הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53537

⸱

30 בדצמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of the Holy Cross, 2School of Medicine, Georgetown University, 3Department of Biochemistry, Giesel School of Medicine, Dartmouth College, 4School of Medicine, Tufts University, 5Transgenomic Inc., 6Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Medical School

במאמר זה

סיכום

על מנת לזהות מוטציות חדשות המשפיעות על תחושה מכנית, תכננו בדיקה המודדת את התגובה ההתנהגותית לגירוי מישוש של זיפי זבובים בשיבוטים מוטנטיים שנוצרו בשיטת MARCM. שילוב הטכניקות מאפשר לזהות מוטציות רגישות למכניקה שאחרת היו קטלניות.

תקציר

בגלל ההומולוגיה המבנית ותפקודית של תאי שיער באוזן הפנימית היונקים, תאי העצב שמעצבבים את איברי חוש חיצוניים תסיסנית לספק מערכת מודל מצוינת ללימוד mechanosensation. פרוטוקול זה מתאר מגע התנהגות פשוטה בזבובי פירות שיכולים לשמש לזיהוי מוטציות שמפריעות mechanosensation. גירוי חוש המישוש של macrochaete זיפים על בית החזה של זבובים מעורר רפלקס טיפוח משתי הרגל הראשונה או שלישית. מוטציות שמפריעות mechanotransduction (כגון NOMPC), או בהיבטים אחרים של קשת רפלקס, יכולות לעכב את תגובת הטיפוח. מסך מסורתי של התנהגויות בוגרות הייתי מחמיץ מוטציות שיש תפקידים חיוניים בפיתוח. במקום זאת, פרוטוקול זה משלב מסך המגע עם ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM) כדי לאפשר רק לאזורים מוגבלים של תאים שעברו מוטציה הומוזיגוטים להיות שנוצר ומסומן על ידי expression של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). על ידי בדיקת השיבוטים MARCM לתגובות התנהגותיות חריגות, אפשר להקרין אוסף של מוטציות p-אלמנט קטלניים כדי לחפש גנים חדשים המעורבים בmechanosensation שהיה החמיצו בשיטות מסורתיות יותר.

מבוא

בני אדם מסתמכים על היכולת להמיר גירויים מכניים מסביבתם, כגון מגע, לחץ, רטט או גלי קול, למידע חושי שיכול להיות מעובד על ידי מערכת העצבים, בתהליך הנקרא מכני-טרנסדוקציה. רבים מהמאפיינים המכאניסטיים הכוללים של טרנסדוקציה מכנית בין בני אדם לחסרי חוליות זהים1, מה שהופך את דרוזופילה למודל שימושי לחקר המנגנונים המולקולריים של טרנסדוקציה מכנית. Drosophila melanogaster מכיל שתי קבוצות של איברי חישה מיוחדים (סוג I ו- II) המסוגלים להמיר גירויים מכניים לפוטנציאל פעולה. לקולטנים מכניים מסוג I יש נוירון עם דנדריט יחיד או תהליך תחושתי, מוקף בשלושה תאי תמיכה2. הקולטנים המכניים מסוג I כוללים קולטנים מכניים זיפים, איברים כורדוטונליים רגישים לשמיעה (איבר ג'ונסטון) ורגישות קמפניפורמית המעבירה מידע על פעימות כנף3. הזיפים המכסים את הצד הגבי של הזבוב הם הנפוצים והנגישים ביותר מבין האיברים מסוג I. בדומה לסביבה החוץ-תאית של תאי שיער הקשורה לשמיעה ושיווי משקל בבעלי חוליות, תאי התמיכה המקיפים נוירונים רגישים למכניקה של זבובים מפרישים אנדולימפה גבוהה של אשלגןהיוצרת שיפוע ריכוז יוצא דופן עבור אשלגן 1. נוירונים רגישים למכניקה, הן של מערכת היונקים והן של מערכת הזבובים, מנצלים את האשלגן החוץ-תאי הגבוה הזה כדי לבצע דה-פולריזציה של התא. בתגובה לגירוי מכני של זיפי המקרוכאט לכיוון דופן הגוף, הנוירונים החושיים מגיבים בפרץ של פוטנציאל פעולה המונע על ידי דה-פולריזציה זו של אשלגן של קרום התא4. הנוירונים החושיים של דרוזופילה המעצבבים זיפים דומים לתאים הרגישים למכניקה של אורגניזמים אחרים, כולל תאי שיער של בעלי חוליות, הן במבנה והן בתפקוד1,5. הנגישות של איברי החישה החיצוניים של דרוזופילה למניפולציה ניסויית ושפע הטכניקות הגנטיות העומדות לרשות החוקרים הופכים את דרוזופילה למערכת מודל מצוינת לחקירת היסודות המולקולריים של תחושה מכנית.

בזבוב, גירוי של נוירון חושי יחיד שמעצבב זיפים מוביל לתגובה התנהגותית נצפית. גירוי של זיפים שונים מעורר תגובות התנהגותיות ספציפיות הניתנות לשחזור, בהתאם לזיפים המגורים. עם גירוי מישוש, זבובי בר ערופי ראש מציגים רפלקס טיפוח מורכב שבו הם מנקים את האזור ליד הזיפים המגורים עם סט מעוצב של תנועות רגליים5-7. כאשר הם הומוזיגוטיים למוטציות ידועות בגן יחיד המפריעות ללמידה7 או קואורדינציה ופעילות תנועתית5, זבובים מגיבים בצורה לא נורמלית לגירוי מכני. רפלקס טיפוח זה הוא אפוא כלי שימושי לחקר ההשפעות של מוטציות בגן בודד על התנהגות ספציפית הניתנת לשכפול.

התגובה ההתנהגותית החזקה לגירוי של זיפי מקרוכאט בודדים טומנת בחובה פוטנציאל לסייע בזיהוי גנים חדשים המעורבים בטרנסדוקציה מכנית. פרוטוקול זה משמש לבדיקת אוסף של זבובים מוטנטיים להיעדר תגובה התנהגותית כדי להצביע על כך שהמוטציה מפריעה לתחושה המכנית. באוסף המוטאנטים שנבחר לסינון, המוטציות גורמות לקטלניות לפני הבגרות, ולכן לא ניתן יהיה לבדוק באמצעות מסכי התנהגות מסורתיים של מבוגרים. במקור, אוסף זה של רכיבי p קטלניים שולב עם אתרי רקומבינציה של FRT כדי לבדוק פגמים בצמיחת תאים בשיבוטים. השיבוטים נוצרו במיוחד בעין מכיוון שזבובים בוגרים יכולים לשרוד במעבדה ללא ראייה פונקציונלית8. עם זאת, הסרת כל התחושה המכנית עלולה לגרום למבוגרים להיות לא מתואמים באופן חמור או למות לפני אקלוזיה5. פרוטוקול זה משתמש בגישת פסיפס כדי לעקוף את הקטלניות של המוטציות ולאפשר בדיקה בשלב המבוגרים. טכניקה גנטית הנקראת ניתוח פסיפס עם סמן תא מדכא (MARCM)9 משמשת ליצירת תאים מוטנטיים הומוזיגוטיים במספר מוגבל של איברי חישה של זבובים בוגרים, בעוד ששאר האורגניזם נותר הטרוזיגוט. זבובי MARCM אלה שורדים בקלות עד לבגרות, אך הזיפים הומוזיגוטיים עבור הגנים הקטלניים המעניינים.

MARCM מאפשר לאזורים של תאים מוטנטיים הומוזיגוטיים להיווצר ולהיות מסומנים על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), בעוד ששאר האורגניזם נשאר הטרוזיגוטי באותו מקום מסוים ולא מסומן9. MARCM משלב מוטציות בודדות של יסודות p עם חמישה אלמנטים גנטיים נפוצים: GFP בשליטה של רצף מפעיל במעלה הזרם (UAS-GFP), חלבון מדכא Gal80 בשליטה של מקדם כללי (tub-Gal80), גורם שעתוק Gal4 בשליטה של מקדם כללי (tub-Gal4), אנזים רקומבינאז FRT המתבטא באמצעות מקדם מבוקר הלם חום, ואתר רקומבינציה FRT10. על ידי הנעת רקומבינאז מיטוטי באמצעות רקומבינאז המופעל על ידי הלם חום, מספר מוגבל של תאים הופכים להומוזיגוטים עבור המוטציה ומסומנים ב-GFP. ביטוי GFP מדוכא בתאים הטרוזיגוטיים על ידי נוכחות Gal80 על העותק הפראי של הכרומוזום.

פרוטוקול הלם חום עבור MARCM עבר אופטימיזציה כדי לגרום לרקומבינציה באיברי החישה החיצוניים של זיפי הזבוב, בעוד שחלק גדול מהאורגניזם נותר הטרוזיגוט, ולכן אינו מסומן ב-GFP. זבובי פסיפס שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה הכילו מוטציות הומוזיגוטיות לרוב בזיפים המרכזיים האחוריים או הגביים על פני השטח של הנוטום.

בדקנו את התועלת של שילוב זה של MARCM ומסך התנהגות הטיפוח עם מוטציה ידועה רגישה למכניקה, NOMPC. תעלת היונים, ללא פוטנציאל קולטן מכני C (NOMPC), היא מרכיב חיוני במסלול הטרנסדוקציה המכנית בדרוזופילה5,11-13. NOMPC שייך למשפחת העל של פוטנציאל הקולטן החולף (TRP) של תעלות קטיון5 ועונה על כל הקריטריונים כדי לזכות בתעלה רגישה למכניקה בדרוזופילה14,15: 1) NOMPC מתבטא בקצות הריסים של נוירונים חושיים מסוג 1 של דרוזופילה 13,16-18, 2) לזחלי אפס NOMPC אין תגובה חשמלית לגירוי מישוש13, 3) ביטוי חוץ רחמי של NOMPC בתאים לא רגישים למגע יכול לגרום לרגישות לגירוי מכני13, 4) ביטוי הטרולוגי של NOMPC בתאי שניידר 2 מניב ערוץ רגיש למכניקה13, ו-5) מוטנטים בוגרים של NOMPC מציגים פגמים בתגובתם לגירוי מכני5. בהתחשב בראיות אלה, חזינו כי שיבוטים מוטנטיים של NOMPC יראו תגובת טיפוח שונה או מעוכבת בתגובה לגירוי מכני של זיפים.

מלאי MARCM המכיל את מוטציית NOMPC פותח לשימוש בניסוי הוכחת עקרונות של מבחן הטיפוח. זבובי פסיפס גורו בזיפים מקרו-כאטיים המכילים תאים מוטנטיים הומוזיגוטיים של NOMPC. ציפינו לעיכוב של תגובת הטיפוח בעקבות גירוי של זיפי המקרוכאט. מצאנו שרק 2 מתוך 14 זבובי זיפים מוטנטיים שנבדקו נתנו תגובה אחת לגירוי חוזר; רובם לא הגיבו לגירוי של הזיפים המוטנטיים ההומוזיגוטיים. לאחר שאישרנו כי בדיקה התנהגותית מבוססת MARCM מייצרת רפלקס טיפוח חריג במוטציה ידועה של פסיפס רגיש למכניקה, ניתן להשתמש בטכניקה זו במסך למוטציות רגישות מכניות נוספות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צלבים כדי ליצור זבובים MARCM

  1. לשמור על זבובים בתקשורת קמח תירס מולסה (אגר L / 6.5 G; 23.5 גר '/ שמרי L, 60 גר' / קמח תירס L, 60 מיליליטר מולסה / L, 4 מיליליטר / תערובת חומצת L; 0.13% Tegosept) או תקשורת תסיסנית סטנדרטית ב 22 מעלות צלזיוס בשעת 12 מחזור אור / חושך.
    הערה: נמוך מהטמפרטורה סטנדרטית משמש כדי לשמור MARCM-מניות בריאים. זה מרחיב את הזמן התפתחותי בין הביצה והבגרות ל -14 ימים.
  2. השתמש נקבות בתולה (כ 1 - 8 ימים ההם) ממניות MARCM מוכנה המכיל אלמנטים גנטיים הנחוצים (GFP תחת שליטתו של רצף הפעלה-במעלה הזרם (כטב"מ-GFP), חלבון Gal80 מדכאים, גורם שעתוק Gal4, חום-הלם recombinase מונע, ואתר רקומבינציה FRT).
    הערה: מוכנות מניות MARCM מכילות גנוטיפים הבאים: elavGal4, כטב"מ-CD8-GFP, HS-flipase; FRT40A, tubGal80 / ארגון נוער קתולי; tubGal4 / TM3Sb.
    הערה: אתר FRT הספציפי יהיה תלוי במיקום של המוטציהבגנום. לדוגמא, FRT40A משמש לבדיקת מוטציות בזרוע השמאלית של כרומוזום 2, כגון NOMPC (ראה 10 לפרטים נוספים על פרוטוקולי MARCM).
  3. נקבות צלב MARCM מוכן בתולה לגברים המכילים מוטציה של עניין והאתר שלה המתאים FRT (לדוגמא, להתראות, ביל; NOMPC3, FRT40A / ארגון נוער קתולי; + / +). כדי לשלוט על האינדוקציה MARCM יעילה, להגדיר צלב שני באמצעות זבובי זכרים מכילים את אותו אתר FRT, אך ללא מוטציה. השתמש יחס משוער של 5 נקבות: זכר 1 בצלבים.

2. מתוזמן הטלת ביצים

  1. לאחר מאפשר זבובים להזדווג ללילה אחד לפחות, לעבור מבוגרים לתוך צלוחיות חדשות עם תקשורת טרי. לאפשר זבובים להטיל ביצים בסביבה חשוכה למשך כ 4 שעות לפני העברה שוב הצלבים לתוך צלוחיות חדשות. שים לב לזמני ההתחלה וסיום של תקופת הטלת ביצים.
    הערה: מרווחים קצרים יותר מקובלים כאשר נראה שיש מספר גבוה של ביצים על התקשורת לפני סוף interva 4 HR-l.
    1. שמור צלוחיות עם מספר מספיק של ביצים (כ יותר מ -20) וחנות בשעה 12 מחזור אור / חושך ב 22 מעלות צלזיוס להיות חום בהלם מאוחר יותר.
      הערה: בקבוקים עם מספר נמוך של ביצים על התקשורת (פחות מכ -20) צפויים להניב כמות מספקת של מבוגר הזבובים לבדיקת התנהגות והאינטרס של יעילות מומלץ הם לא יישמרו לבדיקה נוספת.
      הערה: הזבובים שלנו גדלים עם האורות ב08:00-20:00. מצאנו זמן ערב נקודות יובילו לצפיפות גבוהה יותר ביצה, ולכן בדרך כלל לבצע צלבי מתוזמן בין 4 - 8 בערב ושעה 8 בערב-חצות. הזבובים מטילים את ביציהם על RT בארון חשוך ולאחר מכן הם חזרו לחממה למחרת כדי לא להפריע למחזור אור-חושך הקבוע בחממה.

.3 בצע חום הלם כדי לגרום mitotic רקומבינציה

  1. כ 85-100 לאחר הטלת ביצי HR, נ 'המקוםials לתוך אמבט מים בחום של 37 מעלות במשך שעה 1. ודא כי מפלס המים מגיע מעל לגובה של התקשורת בבקבוקונים, אבל לא לצלול באופן מלא את הבקבוקונים כדי למנוע את זחלי מטביעה.
  2. הסר צלוחיות מאמבט מים ולאפשר תקופת החלמה שעה 1 ב RT.
  3. בקבוקוני מקום בחזרה ל37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעה 1.
  4. הסר צלוחיות מאמבט מים וחנות בחממה על מחזור אור / חושך של 12 שעות ב 22 מעלות צלזיוס עד eclosion.

4. הכנה לבחינות להתנהגות

  1. בעקבות eclosion, להרדים זבובים על קרח. בחר זבובים עם גנוטיפים המכילים את כל המרכיבים הגנטיים לMARCM ומצביעים על השיבוטים מסומנים ביטוי של GFP צפוי להיות נצפו מבוססים על סמני הפנוטיפ הנצפים משמשים במניות ההורה. לערוף זבובים עם המספריים iridectomy.
    הערה: לדוגמא, בחרנו לזבובים ללא סמנים הגנטיים ארגון נוער קתולי (כנפיים מתולתלות) וSb (זיפי זיפים) לזיהה אתזבובי פ.י. שיכילו את כל המרכיבים הגנטיים הדרושים כדי ליצור אזורי פסיפס מסומנים עם GFP.
    הערה: עריפת הראש הוא הכרחית כדי למנוע מהמבוגרים עפו משם כאשר מגורה.
  2. הניחו זבובים חסרי ראש בסביבה סגורה, לחה ולאפשר כ 10 - 20 שעות של התאוששות. שימוש רק זבובים שזכות עצמם כאשר מוטרדים לבדיקה נוספת. מבחן זבובים בתוך 30 שעות של עריפת ראש.

5. בדיקות התנהגותיות

  1. על ידי התבוננות זבובים ערופים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, לזהות שיבוטים הומוזיגוטים מסומנים עם GFP באיברי החישה החיצוניים זיפים. רשום את שם הזיפים וצד שמאל או ימין. לחסל את כל הטיה פוטנציאלית, חבר המעבדה מבצע את גירוי הזיפים צריך להיות עיוור לגנוטיפ של הזיפים, wild-type או מוטציה.
  2. לעורר רפלקס טיפוח על ידי הסטת GFP המסומנת זיפים כלפי גוף הזבוב עם שיער נוקשה או מלקחיים עדינים ולבחון את הרגל מחדשsponse. נותן ציון של אחד לזבובים שלהרים את רגלם בתגובה לגירוי וזיפי ציון אפס לזבובים שלא להזיז את הרגליים שלהם.
    הערה: מחקרים קודם 6,7 אפיינו את תגובת הרגל שהושרה על ידי גירוי זיפים מסוימים. זה כולל את הרגל שמגיבה לכל זיפים ואת חלקם של זבובים שמגיבים לגירוי של זיפים מסוימים. אנחנו רק כבש עבור תנועות של הרגל שצפויה להגיב מבוססים על הסיווג של Vandervorst 6.
  3. לנהל חמישה ניסויים במרווחים 2 דקות זה מזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההצלחה של פרוטוקול זה תלוי במידה רבה על התשואה הכוללת של זבובים הניתנים לבדיקה, את האפקטיביות של הלם החום כדי לגרום לרקומבינציה mitotic, ואת היכולת להשיג תגובה התנהגותית חזקה בזבובי מגורה ב -2 דקות במרווחים. בהתחשב בכך 12.5% ​​משוערים של עוברים מכילים את האלמנטים ההכרחיים וMARCM 16.67% משוערים של מבוגרים שיש לי eclose הפוטנציאל לביטוי של GFP, זה הוא קריטי להשגת מספר גבוה של ביצים במהלך מתוזמן מניח. דוגמא לעיתוי מוצלח שכבה על מרווח 4 שעות שהיה בשימו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מנצל assay התנהגות בוגר למסך למוטציות המשפיעות mechanosensation בדרוזופילה. בגלל האוסף של מוטציות מכיל מוטציות p-אלמנט קטלניים שימנע הקרנה כמבוגרים, פרוטוקול זה עושה שימוש בטכניקה גנטית מורכבת שתוארה לראשונה על ידי לי ולואו , (1999) וכמפורט בפרוטוקול על ידי וו ולואו, (2006) לעקוף קטלני מבוגר. MARCM גורם רקומבינציה mitotic בין כרומוזומים הומולוגיים ליצור אזורים משובטים של תאים הומוזיגוטים. אזורים אלה מסומנים עם GFP בגלל האובדן של החלבון המדכא, אמבטיה-GAL80 המתר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להודות למרכז Bloomington המניות, Liqun לואו, צ'רלס צוקר, ולילי וYuh Nung יאן לשיתוף הנדיב של מניות לטוס ובא למימון: somas-URM (לJD וSW), בוגר תואר ראשון פורד פקולטה קיץ המלגה (לSW), BD תאגיד קיץ מחקר המלגה (לCL וDL), רנה ואנתוני מ 'מרלון, MD 63' קיץ מחקר מלגה (לDL) ג'יימס ג 75 וג'יין Colihan קיץ מחקר מלגה (TO) דרך הבוגרים / הורה קיץ קרן מחקר של המכללה לצלב הקדוש וסטראנסקי קרן מלגת מחקר הקיץ (ל). תודה מיוחדת למחלקה לביולוגיה ומשרד הדיקן במכללה לצלב הקדוש לתמיכה של כל העבודה במעבדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שמרי בירה (25 ליברות)MP ביו-רפואיים ICN90331225 מזון זבוב
תירס (25 ליברות)MP ביו-רפואיים ICN90141125 מזון זבוב
אגר (1 ליברות)מוראגר בע"מ41004מזון זבוב
Tegosept (5 ק"ג)Genesee20-259מזון זבוב
מולסה (1 ליטר)מותג טחנת סוכר - Thomsen Food Service0 2625מזון זבוב
חומצה פרופיוניתפישרA258-500מזון זבוב
חומצה זרחתיתפישרA260-500מזון זבוב
בקבוקוני דרוזופילה, צר (PS)Genesee32-109תרביות זבובים
6oz בקבוק תחתון מרובע (PP)Genesee32-130תרביות זבוב
Flugs - בקבוקי זבוב מפלסטיקGenesee49-100תרביות זבוב כדורי
זהורית,גדול Genesee51-100תרביות זבוב
מילוי דרוסו, Geneseeצר 59-168הכנת מזון זבוב
מילוי דרוסו, בקבוקיםGenesee59-170מזון זבוב הכנה
8A-C / מערבל מעבדה מונע הילוכים עם תושבת c-clamp   1/15 כ"ס, מהירות משתנה 700 סל"ד, 115 וולט, 50/60 הרץקליבלנד מיקסר8A-Cהכנת מזון זבוב
קומקום מעוטר במים הכנתמזון זבוב
תא צמיחה יומיפורמה טמפרטורה מדעיתומחזור אור/חושך מבוקר
אמבט מיםVWRלחום MicroScissors לזעזועים
 כלים מדעיים  15000-08להסרת ראשים
פלורסנס חיתוך מיקרוסקופZeissSteREO Discovery V8 עם קוביית GFP (KSC295-814D) מסנן מעבר פס
מקור אור FluroscenceZeissX-Cite 120צינור אור סיבים אופטיים מקל על הגדרה 
מצלמה עבור היקףZeissAxioCam ICc1
תוכנת רכישת תמונהZeiss
דליעבור אנתזיה קרה
מגשלעריפת ראש אנתזיה קרה
קופסאותלשחזור זבובים מפורקים בסביבה לחה
קרח אנתזיה קרה תוצרת בית פלסטיק

מקורות

  1. Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
  2. Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
  3. Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
  4. Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
  5. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
  6. Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
  7. Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
  8. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59(2005).
  9. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
  11. Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
  12. Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
  13. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
  14. Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
  15. Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
  16. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  17. Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012(2010).
  18. Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
  19. de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
  20. Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שיבוטי MARCMבדיקת חישה מכניתרפלקס טיפוחאנליזה פסיפסתיתגירוי bristlesסימון GFPסריקה התנהגותיתמוטציית NOMpcאתרי FRT
התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.