מאמר שיטה

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

DOI:

10.3791/53547

⸱

18 בפברואר 2016

 ,  ,  , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת אימונוגולד לאחר ההטמעה היא אחת הדרכים היעילות ביותר לספק ניתוחים ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה תת-תאית של מולקולות ספציפיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח כמותי של קולטני גלוטמט בסינפסות סרט הרשתית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גנגליון רשתית (RGCs) מקבלים קלט גלוטמטרגי מעורר מתאים דו קוטביים. עירור סינפטי של RGCs מתווך באופן פוסט-סינפטי על ידי קולטני NMDA (NMDARs) וקולטני AMPA (AMPARs). נתונים פיזיולוגיים הצביעו על כך שקולטני גלוטמט ב-RGCs מתבטאים לא רק בתאי ממברנה פוסט-סינפטיים אלא גם בתאי ממברנה פרי-סינפטיים או חוץ-סינפטיים. עם זאת, לא נקבעו מיקומים אנטומיים מדויקים לקולטני גלוטמט בסינפסות RGC. למרות שנעשה שימוש נרחב בניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של קולטני גלוטמט בסינפסות מרכזיות, גישה זו זכתה להצלחה מוגבלת בלבד ברשתית. פיתחנו שיטת אימונוגולד לאחר הטמעה לניתוח קולטני ממברנה, המאפשרת להעריך את המספר, הצפיפות והשונות של קולטנים אלה בסינפסות סרט הרשתית. כאן אנו מתארים את הכלים, הריאגנטים והצעדים המעשיים הדרושים ל: 1) הכנה מוצלחת של קיבוע הרשתית, 2) החלפת הקפאה, 3) הטמעת אימונוציטוכימיה של מיקרוסקופ אלקטרונים אימונוגולד (EM) ו, 4) הדמיה כמותית של קולטני גלוטמט בסינפסות סרט.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גלוטמט הוא הנוירוטרנסמיטר העיקרי המעורר ברשתית 1. תאי גנגליון רשתית (RGCs), קבלת הקלט הסינפטי glutamatergic מתאי דו קוטבית 2, הם נוירונים הפלט של הרשתית ששולחות מידע חזותי אל המוח. מחקרים פיזיולוגיים הראו כי עירור הסינפטי של RGCs מתווכת postsynaptically ידי קולטני NMDA (NMDARs) ואת הקולטנים AMPA (AMPARs) 3,4,5. למרות זרמים סינפתטי (EPSCs) ב RGCs מתווכות על ידי AMPARs ו NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs מיניאטורי ספונטנית (mEPSCs) על RGCs להפגין רק מרכיב בתיווך AMPARs 4,5,9. עם זאת, צמצום ספיגת גלוטמט חשף מרכיב NMDAR ב EPSCs ספונטנית 5, דבר המצביע על כך NMDARs על דנדריטים RGC יכול להיות ממוקם מחוץ סינפסות מעוררות. קינאזות guanylate קרום הקשורים (MAGUKs) כגון PSD-95 כי קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכול, כולל קולטני גלוטמט ערוץ יוןים באתרי הסינפטי, גם להפגין דפוסי ביטוי subsynaptic ברורים 10,11,12,13,14.

במהלך העשורים האחרונים, אימונוהיסטוכימיה confocal ו מיקרוסקופ אלקטרונים טרום הטבעה (EM) אימונוהיסטוכימיה הועסק ללמוד ביטוי קולטן קרום. למרות immunostaining confocal חושף דפוסים רחבים של ביטוי הקולטן, הרזולוציה הנמוכה יותר שלה עושה את זה אי אפשר להשתמש בו כדי להבחין במיקום subcellular. מחקרי EM טרום מוטבע הרשתית יונקת עולים כי יחידות משנת NMDAR נוכחי אלמנטי postsynaptic ב סינפסות סרט מדוך דו קוטבי 15,16,17. זאת בניגוד לכאורה ראיות פיזיולוגיות. עם זאת, דיפוזיה של מוצר התגובה הנה חפצה ידועה בשיטת אימונו-טרום ההטבעה. לפיכך, הגישה זו לא כוללת בדרך כלל נתונים אמינים סטטיסטית ועשויים לכלול הבחנה בין לוקליזציה קרום הסינפטי לעומת 18,19,20,21 קרום extrasynaptic. עַלמצד השני, נתונים פיסיולוגיים אנטומיים עולים בקנה אחד עם לוקליזציה הסינפטי של AMPARs על RGCs 3,5,7,9,22. לפיכך, קולטני גלוטמט MAGUKs ב סינפסה סרט רשתית הם נקודות לא רק על-סינפטי אלא גם על תאי קרום perisynaptic או extrasynaptic. עם זאת, ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של חלבונים בממברנה אלו סינפסה סרט רשתית עדיין יש צורך.

הנה, פיתחנו טכניקה immunogold postembedding EM לבחון את לוקליזציה subsynaptic של יחידות משנה NMDAR, תת-יחידות AMPAR ו PSD-95 ואחריו בהערכת מספר, צפיפות והשונות של החלבונים האלה ב סינפסות על RGCs חולדה שכותרתו באמצעות B למקטע רעלן הכולרה (CTB) שיטות איתור מדרדרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול הטיפול בבעלי חיים היו בהתאם טיפול בבעלי חיים NIH והנחיות ועדת שימוש. ביום הלידה (P) 15-21 חולדות Sprague-Dawley, הזריקו 1-1.2% CTB בילטרלי דרך colliculus מעולה, נשמרו על 12: אור 12-hr: מחזור כהה.

1. קיבוע רקמת הרשתית

  1. להרכיב את חומרים והכלים באים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים עדינים מאוד, מספריים, נייר סינון תאי, פיפטה פלסטיק שקופיות מיקרוסקופ.
  2. להרדים חולדה בתא סגור עם 2.0 מ"ל halothane (הרדמה נשימתית). לקבוע הרדמה נאותה בשיטות הבאות: חוסר נסיגת כפה האחורי לאחר קמצוץ הבוהן, או חוסר רפלקס מצמוץ. ואז לערוף מיד עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת זכוכית המכיל paraformaldehyde 4% חיץ פוספט 0.1 M (PB) ב- pH 7.4.
  3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להסיר את התירסea ידי ניתוק החלק הקדמי של גלגל העין. הסר את העדשה זגוגי מפני שטח הרשתית הפנימית עם מלקחיים.
  4. מקלף את בלובן העין עם שני מלקחיים עד הרשתית מבודדת עיינית.
  5. חותכים את הרשתית מיד לתוך 100 - 200 רצועות מיקרומטר בעובי בתער, ובכפוף קיבעון pH משמרת.
  6. תקן רצועות הרשתית paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PB ב 6.0 pH למשך 20 - 30 דקות ולאחר מכן ב 4% paraformaldehyde בתוספת 0.01% glutaraldehyde ב- pH 10.5 במשך 10 - 20 דקות ב RT.
  7. לאחר שטיפות כמה PB עם 0.15 מ"מ CaCl 2 (pH 7.4 ב 4 ° C), cryoprotect רצועות רשתית עם גליצרול (60 דקות כל אחד ב 10%, 20%, 30%, אז O / N ב 30%) ב 0.1 M PB לפני להקפיא חילוף.

2. החלפת Freeze

הערה: השיטה זו להקפיא החלפה היא שונה מן הפרוטוקול שפורסם קודם לכן 19,20. כמו כן, חשוב כי המכשירים הם מאוד קרים (ללבוש כפפות); otherwise, הרקמה עשויה להפשיר חלקית כאשר נגע עם המכשירים. כל הצעדים האלה נעשים בתוך החדר AFS ו המכשירים הם לא יכולים לנוע מעל השוליים של החדר. באופן דומה, קירור הולם של כל הכימיקלים המשמשים AFS הוא הכרחי.

  1. לצלול-להקפיא את רצועות הרשתית פרופן נוזלי -184 מעלות צלזיוס מכשיר cryopreservation EM (CPC). בעזרת המברשת בסדר, מניח את הדגימות על חתיכות קטנות של קלטת מקל פעמים המצורפות בדלי המתכת שהולכים על הקצה של המוטות הצוללות (פתיל את החיץ נוסף באמצעות המברשת).
  2. לצלול את המוטות אל פרופן נוזלי ולשמור שם בערך 5 שניות, ולאחר מכן להעביר אל המכשיר להקפיא החלפה אוטומטית (AFS) באמצעות תא תחבורה קטן כי הוא מלא עם חנקן נוזלי ( "LN 2 מקורר מיכל העברת cryo ').
  3. לאחר הצבת מדגם ומכשירים קפוא (מלקחיים אזמל) לתוך AFS, לקרר את המכשירים בתא עבור seדקות veral לפני נגיעה רקמות, או לקרר אותם על ידי הנחת טיפים של המכשירים במשך כמה שניות לתוך תא תחבורה קטן (מלאים בחנקן נוזלי ( "LN 2 מקורר מיכל העברת cryo ')).
  4. מדי פעם את AFS, להסיר את מדגם הקלטת מן הבדל באמצעות אזמל בסדר. כמו כן, לשמור על בקרת זרימת גז חנקן, TF (TF מתואר שליטת רגולטור עבור LN 2 vaporiser ') פתוחה במהלך הליכים אלה.
  5. לפני הצבת הרקמה הקפואה לתוך מחזיקי שטוח הטבעה (כלומר, לפני הגדרת AFS), לחתוך עיגול דק מסדין פלסטיק שקוף ומניחים אותו לתוך החלק התחתון של בעל כדי השורה התחתונה של כל טוב. זה מאפשר הסרה יחסית קלה של אבן polymerized הדגימה בסיום.
    הערה: בעבר, השתמשתי בשיטה אלטרנטיבית לבעלי ההטבעה השטוחים, והעסקת קפסולות רייכרט + ג'לטין כפולות (ראה Petralia ו Wenthold, 1999) 20.
  6. השתמש רצף אוטומטית הבאים AFS (תוך שימוש בטרמינולוגיה מכשיר): T1 = -90 מעלות צלזיוס במשך 32 שעות, S1 = הטמפרטורה לעלייה של 4 מעלות צלזיוס / hr (11.3 שעות), T2 = -45 מעלות צלזיוס במשך 50 שעות, S2 = הטמפרטורה לעלייה של 5 מעלות צלזיוס / hr (9 שעות), T3 = 0 מעלות צלזיוס למשך 40 שעות (סה"כ = 142.3 שעות). זה עלול לקחת 2 - 4 שעות למקום דגימות AFS (ב -90 ° C) לפני תחילת רצף מתוזמן.
  7. לטבול את החלקים הקפואים ב יצטט uranyl 1.5% מתנול ב -90 מעלות צלזיוס במשך> 32 שעות ב AFS. מניח שתי חתיכות של רקמות (בדרך כלל) בכל אחד משבע הבארות בעל אלומיניום שטוח הטבעה (שלוש להשתלב AFS).
    1. הנח את הרקמה + הקלטת לתוך מתנול יצטט uranyl / בבארות והסירו את הסרט מאוחר יותר, בסמוך עד בינוני הטבעת תחילה (כגון Lowicryl HM20) הסתננות, אם זה קשה מדי כדי להסיר את רקמה מהקלטת.
  8. ואז להגדיל את בשלבי הטמפרטורה ל -45 מעלות צלזיוס (+ 4 ° C לכל hr; ברצף האוטומטי).
  9. שטוף את הדגימות שלוש פעמים מתנול precooled, באמצעות פיפטה פלסטיק קנס שקצו להסיר את הפתרון ישן מכל בעל שטוח הטבעה, ולאחר מכן באמצעות אחר פיפטה פלסטיק רגיל להוסיף מתנול הטרי precooled.
  10. לאחר מכן, תוך שימוש באותה השיטה, לחדור הדגימות בהדרגה עם שרפי הטבעה בטמפרטורה נמוכה כגון הטבעה הבינונית (HM20 / מתנול ב 1: 1 ו -2: 1, כל אחד עבור 2 שעות, ואחריו שרף טהור עבור שעה 2 ולאחר מכן לשנות את השרפים ולשמור O / N).
  11. שנה את השרף שוב למחרת, התאמת רמת השרף להגיע רק עד לקצה העליון של הבארות.
  12. לפלמר הדגימות (-45 ° C עד 0 ° C ברצף אוטומטי; + 5 ° C לכל hr) עם האור UV במשך 40 שעות.
  13. ואז להסיר את הדגימות מן AFS. בדרך כלל, בלוקים מדגמים עדיין להראות קצת הוורדרדות בצבע. מניח את הדגימות קרובות אור ניאון במנדף כימי, ב RT O / N או יותר עד שהם אפליקציההאוזן לגמרי ברור.

3. Postembedding EM immunogold Immunocytochemistry

הערה: immunocytochemistry Postembedding מתבצע כמתואר 23,24,25.

  1. חותכי 1 מיקרומטר החלק עם ultramicrotome, סעיפי כתם עם 1% toluidine כחול, ולבחון אותם להתמצאות סעיף; כוון את לחסום הרקמות כדי להשיג את המטוס הרוחבי האופטימלי של חתך.
  2. חותכים 70 סעיפים ultrathin ננומטר עבה עם ultramicrotome ולאסוף אותם על רשתות חריץ ניקל מצופה Formvar-חמצני.
  3. לשטוף ורשתות פעם אחת המזוקק H 2 O ואחריו מלוח טריס שנאגר שלוש פעמים (TBS, 0.05 חיץ M טריס, 0.7% NaCl, pH 7.6) לשטוף.
  4. דגירה רשתות ב 20 טיפות μl של BSA 5% ב TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב 20 טיפות μl של תערובת המכילה עז נגד CTB (1: 3,000) ו נוגדן כדי GluN2A (נגד ארנב למקטע NMDAR אחד 01:50 , GluN2B 1:30), או GluA2 נגד ארנב / 3 (1:30)ב TBS-טריטון (TBST, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) עם BSA 2% ו 0.02 M NaN 3 O / N ב RT.
  5. רשתות לשטוף על שלוש טיפות נפרדות (20 μl) של TBS (pH 7.6) במשך 10, 10, ו -20 דקות, ואחריו TBS (pH 8.2) במשך 5 דקות.
  6. דגירה רשתות עבור שעה 2 על טיפות (20 μl) של תערובת המכילה IgG נגד ארנב חמור (1:20) מצמידים 10 חלקיקי זהב ננומטר IgG נגד עז חמור (1:20) מצמידים את חלקיקי זהב 18 ננומטר ב TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3.
  7. לשטוף רשתות ב 20 טיפות μl של TBS (pH 7.6) במשך 5, 5, ו -10 דקות, ולאחר מכן במים ultrapure ולאחר מכן לייבש אותם.
  8. רשתות Counterstain עם אצטט uranyl 5% ו -0.3% ציטראט הובלת H המזוקק 2 O עבור 8 ו -5 דקות בתנאים כהים, בהתאמה.
  9. בניסויים משולש תיוג, דגירת רשתות O / N ב RT עם 20 טיפות μl של תערובת של אנטי-העז CTB (1: 3,000), אנטי עכבר PSD-95 (1: 100), ו GluN2A נגד ארנב (1 : 50). ואז דגירה רשתות עבור שעה 2 על 20 טיפות μl של תערובת של IgGs מצמידים 18, 10, ו -5 חלקיקי זהב ננומטר TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3. שמור אותו נוהל כמו תיוג כפול לרחצה counterstaining בין ואחרי הדגירה נוגדן.
  10. בקרות בוצעו בו נוגדנים משני יושמו לבד.
  11. רשתות צפה על תמונות EM ו digitalize. לעבד נתונים סופיים ב- Adobe Photoshop 6.0 ​​רק עבור בהירות והניגודיות אם יש צורך 24.

כימות 4.

  1. ידני באזורים הנבחרים של שכבת plexiform הפנימי (IPL) ללא חורים או סדקים בהגדלת 8,000X, ואז באקראי פוטומונטאז את מלוא עומקה של IPL בהגדלת 25,000X.
  2. זהה דנדריטים RGC ב צמדים דו קוטביים חרוטים כשהם א) מכילים את אות CTB מועבר retrogradely (חלקיקים זהב גדולים), ב) ממברנות מוגדרות היטב תערוכה, בתרי, צפיפויות postsynaptic, ג) להכיל לפחות שני חלק זהב קטןicles בתוך PSD, או יותר חלקיק זהב אחד קטן לאורך הממברנה extrasynaptic.
  3. אסוף 45 - 55 דנדריטים RGC, על פי קריטריונים לעיל, על ניתוח כמותי.
  4. מדוד את האורכים של PSD ו קרום פלזמת extrasynaptic של דנדריטים RGC פרט עם תוכנת ImageJ NIH. רוזן חלקיקי זהב בתוך 10 ננומטר של קרום כמו קרום קשור, המבוסס על עובי ממוצע של 7 - 9 ננומטר עבור קרום פלזמת 26.
  5. חישוב צפיפות החלקיקים כמספר חלקיקי זהב לכל מיקרומטר ליניארי (זהב / מיקרומטר). למדוד את המרחק בין מרכז של כל חלקיק זהב באמצע PSD (עבור מיקום הסינפטי) או קצה PSD (עבור מיקום extrasynaptic).
  6. בביצוע ניתוחים סטטיסטיים על ידי התוכנה. השתמש שני זנב t- הבדיקות להשוות אמצעים. להסיק משמעות כאשר P <0.05. אלא אם צוין אחרת, ערכי דוח כמו הממוצע ± SEM 18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המוצגות כאן להפגין דפוסי לוקליזציה subsynaptic שונות לחלוטין של GluA 2/3 ו- NMDARs על דנדריטים RGC ברשתית חולדה, כפי שתואר לעיל 24,25. 77% של חלקיקים immunogold GluA 2/3 פרופילים הדנדריטים RGC אותרו בתוך PSD (איור 1 א), בדומה למרבית סינפסות המרכזית. עם זאת, NMDARs אותרו גם synaptically או extrasynaptically. 83% של חלקיקים immunogold GluN2A היו נקודתיים של PSD (איור 1 ג, 2 א, 2 ב), מעדיפים ב סינפס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תארנו ארבע טכניקות שלאחר הטבעת כמותית מוצלחת immunogold EM: 1) קיבוע קצר וחלש, 2) להקפיא-החלפה, 3) שלאחר הטבעה מכתימה immunogold, ו -4) כימות.

EM immunogold מאפשרת זיהוי של חלבונים ספציפיים בסעיפי רקמות ultrathin. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב ניתן דמיינו ישירות באמצעות EM. בעוד עוצמה באיתור לוקליזציה subsynaptic של קולטן קרום, immunogold EM יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, ודורש אופטימיזציה קפדני של שיטות עיבוד קי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילוי נאות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכניות המיפוי של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) ואת המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (NIDCD), של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). אנו מודים מתקן NINDS EM ואת ליבת ההדמיה המתקדמת NIDCD (קוד # ZIC DC 000,081-03) לקבלת סיוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ParaformaldehydeEMS15710
GlutaraldehydeEMS16019
NaH2PO4SigmaS9638
ו-2HPO4Sigma7782-85-6
CaCl2SigmaC-8106
BSASigmaA-7030
Triton X-100SigmaT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
גליצרולGibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2Aדילול AB1555P Millipore1/50
אנטי-GluN2Bדילול AB1557P Millipore1/30
אנטי-GluA2/3דילול MilliporeAB15061/30
אנטי-PSD-95MilliporeMA1– 046דילול 1/100
חמור נגד ארנב IgG-10 ננומטר חלקיקי זהבEMS25704דילול 1/20
חמור נגד עכבר IgG-10 ננומטר חלקיקי זהבEMS25814דילול 1/20
חמור נגד עכבר IgG-5 ננומטר חלקיקי זהבEMS25812דילול 1/20
חמור נגד עזים IgG-18 ננומטר חלקיקי זהבג'קסון ImmunoResearch705-215-147דילול 1/20
רשתות חריצי ניקל מצופות Formvar-Carbon.EMSFCF2010-Ni
אורניל אצטטEMS22400-1
מתנולEMS67-56-1
ציטראט עופרתLeica
Leica EM AFSLeica
Leica EM CPCLeica
UltramicrotomeLeica
JEOL 1200 EMחנקן נוזלי JEOL
 רוברטס חמצן
פרופאןרוברטס חמצן
CTBרשימה מעבדות ביולוגיות1041 - 1.2%
אנטי CTBמעבדות ביולוגיות703דילול 1/4,000
רשימת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImmunogoldFreeze SubstitutionPostembeddingNMDA

מאמרים קשורים