מאמר שיטה

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

DOI:

10.3791/53559

⸱

21 בפברואר 2016

1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, ריסים ראשוניים התגלו כמווסתים מרכזיים בהתפתחות ובמחלות על ידי השפעה על מסלולי איתות רבים. אחד ממסלולי האיתות המוקדמים ביותר שהוכחו כקשורים לתפקוד הרירי היה מסלול האיתות הלא קנוני Wnt, המכונה גם איתות קוטביות תאים מישורית (PCP). אחד המקומות הטובים ביותר לחקור את ההשפעות של איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP) במהלך התפתחות בעלי חוליות הוא שבלול היונקים. שיבוש איתות PCP בשבלול העכבר משבש את צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, כולם מושפעים מתפקוד לקוי של הריסים. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את הניתוח של איתות PCP בשבלול היונקים המתפתח באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. פגמים בהתכנסות ובהתרחבות באים לידי ביטוי כקיצור של צינור השבלול ו/או שינויים בדפוס התאי, שניתן לכמת לאחר דיסקציה ממוטציות עכברים מתפתחות. ניתן לצפות ולכמת שינויים בכיוון הצרור הסטריאוציליארי ובאורך או במיקום הקינוציליה באמצעות אימונופלואורסצנציה או מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). תובנה מעמיקה יותר לגבי תפקידם של חלבונים ריסניים במסלולי איתות תאיים ותופעות ביולוגיות אחרות היא חיונית להבנתנו את הביולוגיה התאית וההתפתחותית, כמו גם לפיתוח אסטרטגיות טיפול ממוקדות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cilia ראשי הם נספחי microtubule מבוסס ארוכים שמרחיבים מפני שטח של רוב בתאי יונקים. cilia הראשי מבולבלים לעתים קרובות עם cilia ניע, אשר יש תמיד מרובים לכל תא, ואשר מטרתו הוא להעביר נוזל על פני משטחים הממברנה. cilia היסודי, לעומת זאת, לאמץ תפקידים חושיים ובשל כך הן גם התייחסו cilia החושית כמו. לאחר שאבד עליהם כלח, אברון זה כבר "מחדש" לאחרונה כתוצאה ההתאגדות שלה עם שפע של מחלות גנטיות האדם 1. באופן אידיאלי מיקומו בתור אברון איתות, את cilium העיקרי הוכח לווסת מסלולים רבים איתות, שרבים מהם חשובים לא רק הומאוסטזיס רקמה ומחלות, אלא גם במהלך הפיתוח 2.

אחד מסלולי איתות הראשונה הראו להיות הקשורות בתפקוד cilia היה מסלול איתות Wnt קאנונית, הידוע גם בשם הקוטביות בתא מישוריים (PCP) מסלול > 3. מפל איתות זה בתחילה זיהה תסיסנית, הוא קריטי עבור עובר; בפרט עבור תהליכי התכנסות ארכה את הכיוון הנכון של תאי המטוס של אפיתלים 4. את האיתות הרציפה של גרעין המוגדר של חלבונים רגולטוריים מתרגם רמזים כיוונית אשר בסופו של הדבר להוביל rearrangements cytoskeletal ולגרום הקיטוב המתואם של תאי אפיתל במטוס 5. תהליך ההתכנסות והסיומת הוא דרוש לחלוטין את צינור השבלול להאריך ועבור דפוסים הסלולר נכונים 6. כמו זה מוסדר באמצעות שפעול מסלול PCP, אחד פנוטיפים הבולטים ביותר של מוטציות שבלול PCP הוא צינור שבלול יקוצר epithelia החושית מאורגנת 7. באופן דומה, מוטנטים עכבר, אשר חסר cilia, גם תערוכה כגון פנוטיפ התכנסות ורחב 8,9, למרות בדיוק איך זה מוסדר נותר הובהר.

ve_content "> מכיוון תהליכי התכנסות והרחבה הם קריטיים עבור התולדה של צינור השבלול, דפוסים הסלולר של epithelia החושית בתוך צינור השבלול, השבלול המתפתח הוא איבר אידיאלי שבו לבחון איתות PCP במהלך ההתפתחות החולייתנים. הביטאון קורטי, השם שניתן האפיתל החושית המיוחדת המרפדת את צינור השבלול, מורכבת ותאי תומכים שאינם חושיים ותאי שיער mechanosensory אשר חייב להיות מכוונות באופן אחיד עבור השבלול לתפקד 10. תאי שיער mechanosensory נקראים כך בגלל חבילות stereociliary שמרחיבות מצלחת cuticular (למשטח פסגה) של כל תא שיער חושי 11. אלה משמשות מתמרים עיקריים של mechanosensation ולמרות המינוח שלהם כמו stereocilia, מורכבות למעשה של microvilli מבוסס נימה תקטין שונה. בתוך כל שיער בצורת שברון צרור, שלוש שורות של stereocilia מאורגנים רשות הורה מאוד ורגילttern באופן במקרה דמוי מדרג. Cilia microtubule מבוססי ריאל, כינה kinocilia, נדרשים לפיתוח והכיוון של חבילות stereociliary 12. עם כל תא שיער, kinocilium אחת מחוברת פיזית את צרור stereocilia, הממוקמת בסמוך מרכזי לשורה הגבוהה של stereocilia. הפונקציה מדויק של kinocilium אינה ברורה, אחת ההשערות היא כי kinocilium 'מושך' את stereocilia לכושר כשהם מתבגרים מן microvilli 12. בבעלי החוליות, kinocilia בשבלול נוכח רק זמנים לסגת מתאי השיער בעכברים לפני תחילת שמיעת 11,13,14.

אובדן מוחלט של השיער בתוצאות שבלול המתפתח צינוריות שבלול מקוצר קשות, יצרו אי ו MIS מוכווני חבילות stereociliary, וכן גופים הבסיס ממוקם mis 8,9. Cilium תפקודית אינה מורכבת רק של axoneme ריסי. חלבונים רבים הקשורים ciliaפונקציה להתרחש מתחמים מקומיים תחומיים משנה הקשורות cilia כמו גוף בסיסי, אזור מעבר, או ריסי axoneme 15. הגוף הבסיסי, נגזר אמא צנטריול של centrosome, היא גם המרכז מתארגן microtubule עבור microtubules הארכה הרחק cilium לתוך גוף תא יכול לווסת סחר תאי וכן סחר ריסים. אזור מעבר הריסים הוא אזור אחר שבו פונקצית ריסי מוסדר מבחינת ארגון יבוא ויצוא של תרכובות ריסי 16.

מחקרים רבים זיהו קשר בין הריסים ו קאנונית Wnt (איתות PCP), אם כי המנגנון המדויק אינו ברור 17. יתירות של גני ריסים ו PCP ואת הרגישות של קוטביות בתא לאי תקינות הסלולר כללית, להקשות לקשר מוטציה ישירות גירעונות ספציפיים PCP. אחד פסקי לקריאה של איתות PCP הוא המיקום של הגוף הבסיסי ו primarcilium y, ולכן ההפרדה העיקרית מן הפגמים המשניים הם מאתגר. כמה מחקרים מוטנטים דג הזברה והעכבר הציעו שום קשר בין הריסים ו Wnt איתות 18-20. אי-התאמות בנתונים עשויות לשקף מינים, רקמות, או בדלים זמניים תלויים תרומות ריסים לקראת איתות Wnt. יתר על כן, היענות Wnt רגיל עלולים להיעזר במידת גופים הבזליים להישאר פונקציונליים. תובנה עמוקה יותר לתוך התפקיד של חלבונים ריסי במסלולי איתות הסלולר תופעות ביולוגיות אחרות חיונית להבנת ביולוגיה תאית והתפתחותית, וכן לפיתוח אסטרטגיות טיפול ממוקד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לשימוש להרדים כל החיות בהתאם להנחיות מוסדיים הממשלתיות והתקנות, לרוב באמצעות שאיפת CO 2 ו נקע בצוואר הרחם.

1. הכנת ריאגנטים

הערה: לפני תחילת, להכין את כל ריאגנטים באמצעות כימיקלים כיתה אנליטי. הפוך פתרונות באמצעות מולקולרית כיתה מזוקקים מים ללא יונים אלא אם צוין אחרת.

  1. בופר פוספט (1x PBS): הפוך 1 ליטר של 1x PBS על ידי המסת 8g NaCl, KCl 0.2g, 1.44g Na 2 HPO 4 ו 0.24g KH 2 PO 4 ב 1 ליטר של H 2 O. התאם את ה- pH ל -7.4 עם HCl. PBS לא צריך להיות סטרילי ניתן לאחסן ב RT. שים לב החיץ זה נעשה ללא CaCl 2 או MgCl 2.
  2. Paraformaldehyde (4% PFA): כן פתרון 4% PFA ב 1x PBS במנדף מאוורר. להוסיף 40g של אבקת paraformaldehyde 1 ליטר של 1x PBS. כדי לפזר, מערבבים ומחממים כ 60 מעלות צלזיוס,ולאט לאט מוסיפים NaOH טיפה חכם להעלות את רמת החומציות. לאחר האבקה נמסה, להתקין מחדש את ה- pH 7.4 עם HCl. סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר ולהקפיא aliquots. להפשיר aliquot טרי עבור כל ניסוי.
  3. חיץ טריטון: כן פתרון 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.15 M NaCl, 0.1% Triton X-100 על ידי המסת 8.77 גרם NaCl ב 1 ליטר של 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5). הוסף 1 מ"ל טריטון X-100. מערבבים לפזר. חיץ חנות טריטון ב RT.
  4. בלוק טריטון: הכן 10% נסיוב עז במאגר טריטון על ידי הוספת 1 מ"ל של סרום עיזים 9 מ"ל של חיץ טריטון. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. אם באמצעות נוגדנים ראשוניים וגדלו עכבר, להוסיף עז נגד העכבר IgG Fab שברי בדילול של 1 ל -200 לבלוק טריטון עבור שלב החסימה.
    הערה: במידה ואתם מתכננים להשתמש דגימות עבור במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), להכין חומרים כימיים נוספים, כמפורט להלן.
  5. תמיסת מלח מאוזן "הנקס (HBSS) עם סידן ומגנזיום: בצע פתרון 1x של HBSS על ידי דילול מפתרון המניותב H 2 O. מזוקקים סטריליים כפי חיץ HBSS מסובך לעשות ויש סיכונים כרוכים בכך, רצוי להזמין פתרון premade 10x מניות. הריכוז הסופי של HBBS חיץ בשימוש שגרתי הוא: 1.26 מ"מ CaCl 2, 0.49 מ"מ MgCl 2 -6H2O, 0.41 מ"מ MgSO 4 -7H2O, 5.33 מ"מ KCl, 0.44 מ"מ KH 2 4 PO, 4.17 מ"מ NaHCO 3, 137.93 מ"מ NaCl , 0.34 מ"מ Na 2 4 HPO, 5.56 מ"מ דקסטרוז.
  6. חיץ Hepes: הכן פתרון 0.1 M Hepes ב 1x HBSS, על ידי המסת HEPES 23.8 גרם 1 חיץ L 1x HBSS.
  7. מקבע מיקרוסקופיית אלקטרונים (תקן SEM): הכן מקבע עבור SEM ידי דילול glutaraldehyde כיתה במיקרוסקופ אלקטרונים (2.5%) ו paraformaldehyde (4%) במאגר Hepes. להוסיף CaCl 2 לריכוז סופי של 10 מ"מ.
  8. Tetroxide 1% אוסמיום (OSO 4) במאגר Hepes; tetroxide 1% אוסמיום במים: מדולל פתרון המניות של tetroxide אוסמיום במאגר Hepes, ו separately ב סטרילית מזוקק H 2 O, לריכוז סופי של 1%. tetroxide אוסמיום הוא רעיל מאוד והוא נמכר לרוב כפתרון 4%.
  9. 1% (w / v) חומצה טאנית: ממיסים 0.5 גרם חומצה טאני ב 50 מ"ל מזוקקים סטריליים H 2 O. סנן לעקר ידי סינון דרך מסנן גודל נקבובי 0.45.
  10. סדרת פתרון אתנול מדורגים: לדלל 200 אתנול הוכחה עם H מזוקקים סטריליים 2 O לעשות 30, 50, 70, 90 ו פתרונות אתנול 95%. עבור שטיפות אתנול הסופיות, 100% הוכחת אתנול 200 נדרשה. השתמש בקבוק טרי פתח של 200 אתנול הוכחה עבור השטיפות הסופיות.

בחירת 2. של רקמות

  1. באופן אידיאלי, לבחון עוברים או גורים צעירים בגילאי עובריים יום 16.5 (E16.5) ואת יום לאחר הלידה 3 (P3).
    הערה: התאבנות של המבוך הגרמי ועצמות זמני עושה דיסקציה יותר ויותר מאתגר כמו עכברים בוגרים. כמו כן kinocilia, את cilium נכון microtubule מבוסס היחיד שנמצא על תאי שיער שבלול,חזר בו במהלך הפיתוח הוא כבר לא קיים בעכברים בוגרים.
  2. לאחר קיבוע, decalcify cochleae המבוגר. מקום גזור (ראו סעיף 3) מבוכים גרמיים, לתוך 2 מיליליטר EDTA (4.13% ב PBS), pH 7.3, בצינור microcentrifuge עבור 3 - 4 ימים עם רוטציה. לחדש EDTA יומי. לאחר רקמות התרככו, לשטוף 1.5 מ"ל או פעמים PBS 3 יותר במשך 5 דקות על nutator עם תסיסה מוגברת.

3. שבלול Dissection

  1. Euthanization הודעה דרך נקע בצוואר הרחם או שאיפת CO 2 (100% CO 2), להסיר את הראש. השתמש בלהב סכין מנתחים או מספריים קטנים, תלוי בגודל של חיה, כדי לנתח את הראש לאורך אמצע קו sagittal החל האף והארכת caudally. הסר את המוח מכל מחצית הגולגולת עם זוג מלקחיים. זהה את העצמות הזמניות, אשר מכיל את המבוכים גרמיים בפיתוח של אוזן פנימית (ראה חץ באיור 1 א).
  2. השתמש זוג עבורפטריות לבנות לבודד את המבוכים הגרמיים בזהירות מהגולגולת (עצמות הזמניות). האם זה תחת מיקרוסקופ לנתח. Prise את הרקמה הגרמית מהגולגולת על ידי הפעלת המלקחיים בעדינות מתחת במבוכים הגרמיים. אצל בעלי החיים עד P4 במבוכים הגרמיים עדיין סחוסים וניתן להסירו בקלות בלי לשבור.
  3. בעקבות לנתיחה, להשתמש קצה המלקחיים לנתח כדי לנקות את סגלגלים חלונות עגולים ולעשות חור קטן הקודקוד של ספירלת השבלול. תקן את המבוכים הגרמיים לפני לנתיחה נוספת של צינור השבלול. כדי לאפשר הסרה קלה של קרום tectorial (ראה 3.7), לתקן את המבוכים הגרמיים ב 1.5 מיליליטר PFA 4% במשך 5 דקות על קרח.
    הערה: אם הסרת קרום tectorial אינה נדרשת, קיבעון עוד מומלץ (ראה 4.1 - 4.3). קיבוע קצר של העצמות זמניות לפני לנתיחה של צינור השבלול מסייע בתהליך לנתיחה והסרה של קרום tectorial. לנתיחה לאחר החשיפה של האיבר של קורטי, furtהקיבעון שלה נדרש.
  4. לנתח עוד במבוכים הגרמיים לחשוף את האפיתל חושי שבלול כדלקמן. מניח את המבוכים הגרמיים בצלחת לנתח סיליקון שחור מצופה אלסטומריים המכילה PBS כדי להקל לנתיחה. השתמש סיכות minutien כדי לשתק את הרקמות במידת הצורך. כדי להשתמש סיכות minutien, למקם אותם דרך חלק שיווי המשקל של המבוכים הגרמיים עם היבט הגחון של ספירלת השבלול כלפי מעלה.
    הערה: צלחת אלסטומריים סיליקון שחור: מערבבים רכיב בסיס סיליקון אלסטומריים עם אבקת פחם כדי לקבל צבע שחור אטום. מוסיפים את הסוכן ריפוי ויוצקים לתוך צלחות פטרי אחד או יותר (זכוכית או פלסטיק). ניקוי תחת ואקום כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו. מנות יבשות לחלוטין לפני שימוש.
  5. שימוש במלקחיים בסדר (# 5) להסיר את הסחוס החיצוני חשיפת צינור השבלול. התחל החלון הסגלגל; להכניס את הקצה התחתון של המלקחיים לתוך החלון הסגלגל בעדינות לפרוץ את הסחוס, נעו באיטיות כלפי מעלה לכיווןשִׂיא.
  6. לאחר חשיפה של צינור שבלול, הזז את משטח הגחון, הממברנה של רייסנר. השתמש זוג נאה של מלקחיים לצבוט את הממברנה של רייסנר בבסיס צינור שבלול לקלף אותו בתנועה כלפי מעלה. דמיין בהיבט הגבי של צינור השבלול, כולל האפיתל החושי.
  7. הסר את קרום tectorial כמתואר להלן (לא חובה). עבור SEM או אימונוהיסטוכימיה של kinocilium או צרורות stereociliary להסיר את הקרום tectorial.
  8. השתמש זוג יפה מאוד של מלקחיים (# 55 או עדינה) לצבוט את קרום tectorial בבסיס של שבלול לקלף כלפי מעלה לכיוון הקודקוד.
    הערה: קרום tectorial ברור אופטי אשר מקשה לזהות. לעתים קרובות יותר מאשר לא הממברנה יורד בחתיכה אחת ולמרות שזה לא דמיינו בקלות, אפשר לחוש התנגדות כפי שהוא הוריד מן האיבר החשוף של קורטי.
  9. לאחר חשיפת האיבר של קורטי, עוד לתקן את הרקמה כפי דescribed להלן. שמור באזור שיווי המשקל כדי לסייע להכנות נוספות של רקמות.

קיבוע 4.

  1. אימונוהיסטוכימיה רגיל לתקן את מבוכים גרמי גזור 1.5 מ"ל PFA 4% ב 4 ° C על nutator עבור שעה 2.
    הערה: בגלל הרגישות שונה נוגדנים לאנטיגנים, וריאציות באורך והרכב הקיבעון שיידרש צריך להיות מותאם עבור כל נוגדן.
  2. לאחר קיבוע, לשטוף את הדגימות על ידי שטיפה ב 1.5 מ"ל או פעמים PBS 3 יותר במשך 5 דקות על nutator עם תסיסה מוגברת. דוגמאות ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני העיבוד.
  3. אם הכין דגימות עבור SEM, לתקן גזור עצמות זמניים לתקן SEM (ראה 1.7) עבור שעה 2 ב RT. שטפו ידי שטיפה ב 1.5 מ"ל או יותר פעמים Hepes חיץ 3 דקות 5 על nutator עם תסיסה מוגברת. חנות במאגר Hepes ב 4 ° C עד לעיבוד נוסף. אחסון עבור יותר מכמה שבועהים אינו מומלץ.

5. אימונוהיסטוכימיה

  1. בצע אימונוהיסטוכימיה על דגימות גזורות אחד טוב של צלחת גם 96 תחתית שטוחה. לחלופין, להשתמש בצינור PCR או microcentrifuge. רצוי לשמור על חלק שיווי המשקל של המבוך הגרמי כדי להקל על עיבוד.
  2. Permeabilize הרקמה על ידי דוגרים ב 1.5 מ"ל חיץ טריטון עבור שעה 1 ב RT על nutator עם תסיסה עדינה.
  3. חסום את הרקמה על ידי דוגרים ב 0.5 מ"ל טריטון לחסום למשך תקופה מינימלית של שעה 1 ב RT. אם באמצעות נוגדנים ראשוניים וגדלו עכבר, להוסיף שברים אנטי עכבר IgG Fab לבלוק בדילול של 1 ל -200 (ראו סעיף 1.4). זה מקטין באופן משמעותי שאינו ספציפי מחייב של IgG אנטי עכבר לרקמות עכבר.
  4. דגירת רקמה עם נוגדנים עיקריים מדוללים בבלוק טריטון / N ב 4 ° C עם תסיסה עדינה. דילול נוגדן תלוי נוגדנים בשימוש (ראה סעיף 6.1). לחלופין דגירה antibodie העיקריים עבור שעה 2 ב RT. אידיאלי לשימוש נפח מינימלי של 0.5 דילול נוגדן ראשוני מ"ל. אם הנוגדן מוגבל, השתמש הנפח הקטן של דילול נוגדן לחלוטין עוטף את הרקמה.
  5. שטפו את הרקמה על ידי שטיפה ב 1.5 מ"ל או יותר חיץ טריטון, מינימום של 3 פעמים במשך 15 דקות, על nutator עם תסיסה מוגברת.
  6. דגירה הרקמה עם נוגדנים צבען מצומדות פלורסנט מדולל ב יצרני מומלץ ריכוז (בדרך כלל 1: 200-1: 1,000) בבלוק טריטון עבור שעה 1 ב RT על nutator. השתמש נפח מינימלי של דילול נוגדנים משני מ"ל 0.5.
    1. צנטריפוגה נוגדנים משני מדולל ב 13,000 XG במשך 3 דקות לפני השימוש כדי למזער מחייב הלא ספציפית של אגרגטים נוגדנים משני. להגן על הרקמות מפני אור משלב זה ואילך, כדי למנוע photobleaching צבעי הניאון.
  7. כמו בשלב 5.5, לשטוף את הרקמה על ידי שטיפה ב 1.5 מ"ל או יותר חיץ טריטון, מינימום של 3 פעמים במשך 15 דקות, עלnutator עם תסיסה מוגברת. חנות דגימות PBS ב 4 ° C עד מוכן לעלות.

6. בחירת נוגדן

הערה: מקור נוגדנים מומלצים הדילולים שלהם מפורטות בטבלה של חומרים וציוד ספציפיים. בצע incubations נוגדן כמתואר בסעיף 5.

  1. כדי להמחיש את kinocilium מבוססי microtubule, להשתמש ריסי axoneme סמן כגון Arl13b אנטי (1: 1,000) או-acetylated-α-טובולין אנטי (1: 800). דמיין את הגוף הבסיסי באמצעות נוגדן נגד γ טובולין (1: 200) או כל סמן centrosomal אחר.
  2. כדי להמחיש את חבילות stereociliary נימה עשירה יקטין, להוסיף phalloidin (1: 300 - 1,000) מצומדות לאחד כמה fluorophores השונה דגירת הנוגדנים משני. Phalloidin גם תוויות מבנים אקטין פילמנטיות אחרים לרבות סיבי אקטין קליפת המוח שמסביב בפריפריה של כל תא שיער אפיתל. זה מסייע בקביעתאת קווי המתאר של כל תא שיער. השתמש סמן קרום חלופיים כגון אנטי-Zo-1 (1: 500) במידת הצורך.
  3. תווית תאי שיער שבלול באמצעות נוגדנים נגד שרירן VI (1: 1,000) או שרירן VIIa (1: 1,000). אלה יכולים לשמש אם הערכת אורך שבלול.

הערה: צבען מצומדות פלורסנט מתאים השתמש נוגדנים משני המותאמים לדרישות מיקרוסקופ.

שמה והדמיה 7.

  1. מניחים את המדגם בצלחת אלסטומריים סיליקון שחור המכיל PBS. בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר את האזור שיווי המשקל מן מפותל בצורת שבלול.
  2. בזהירות רבה להסיר את סחוס mesenchyme הבסיסי מן מפותל בצורת השבלול. ספירלת שבלול הנותרים מכילה מענית הפנימית, איבר של קורטי ו מענית חיצונית.
  3. מעבירים את הספירלה שבלול לתוך ירידה של PBS להציב בשקופית מיקרוסקופ. אם תרצה, להפריד הספירלה שבלול לחתיכות שווה סיבוב אחד. שלב זה אינו הכרחי עם זאת, ויכול להוביל loss של רקמה. למשטח הפסגה (צד stereocilia) של תאי שיער שבלול צריך להיות פונה כלפי מעלה לכיוון coverslip.
  4. וויק משם את PBS עם רקמות בעלי כושר ספיגה או פיסת נייר סינון ובעדינות למקם הספירלה שבלול אם האפיטל השתנה ו חופף על עצמה.
  5. הוסף ירידה של התקשורת הרכבה ישירות על מדגם שבלול ומניחים בעדינות coverslip על גבי, מקפיד להימנע בועות אוויר. אין מפרידי נדרשים; המקום coverslip ישירות על המדגם. מסיסים במים, שאינם fluorescing, הרכבה בינונית חצי קבוע אשר אינו מחייב צעדים נוספים כדי להחזיק את coverslip במקום מומלץ. תקשורת coverslip שמת עובי צריך להיות מתאים מיקרוסקופ מפרטים.
  6. שימוש במיקרוסקופ confocal epifluorescent או ליזר הסריקה מאובזר עם הגדלה גבוהה (63 - 100X), צמצם מספרי גבוה (1.2 - 1.4) מטרות כדי ללכוד תמונות של למשטח הפסגה של תא שיער השבלול. השתמש loמטרות wer (5 - 20X) לקחת חופפי תמונות של ספירלת השבלול לכמת את האורך של צינור השבלול. לייזרי עירור התאמה ומסנני פליטה כדי fluorophores המשמש נוגדנים משני.

8. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק

  1. המשך ממקטע 4.3. לאחר שטיפת דגימות קבועות SEM במאגר Hepes, בצע את הפעולות הבאות תחת אוורור. הפרוטוקול הבא עובד היטב עבור רקמות שבלול ואינו עושה שימוש של ציפוי גמגום עם מוליך מתכת.
  2. פוסט לתקן ב 1% OSO 4 במאגר Hepes עבור שעה 1, ואחריו 3 שוטף עם 1 מ"ל מים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד. הנפח הקטן של OSO 4 לחלוטין עוטף את הרקמה צריכה לשמש כדי למזער פסולת רעילה. אין תסיסה נדרשה.
  3. דגירה דגימות ב RT כל אחד מהפתרונות הבאים עבור שעה 1 עם 3 שוטף עם מים מזוקקים 1 מ"ל במשך 5 דקות כל אחד בין שלבים: חומצה טאנית 1% טריים במים filאפריקניות לפני שימוש; 1% OSO 4 במים, 1% חומצה טאנית במים, 1% OSO 4 במים.
  4. מייבשי דגימות באמצעות סדרת אתנול מדורג על ידי דגירה במשך 10 דקות בכל אחד הדילולים הבאים: 30, 50, 70, 90, ו -95%. אין תסיסה נדרשה.
  5. העברת דגימות באמצעות שלושה שינויים, 5 דקות כל אחד, של 100% אתנול (מבקבוק שנפתח לאחרונה של 200 אתנול הוכחה).
  6. הפעל את הדגימות למרות יבשי נקודה קריטיות הבאות הוראות יצרן.
  7. הר דגימות באמצעות דבק פחמן מוליך על גבי תלוש SEM לפני הדמיה על מיקרוסקופ אלקטרונים. תחת סטראו, להשתמש זוג מלקחיים בסדר ומכחול כדי למקם את המדגם בעדינות עם האפיטל שבלול פונה כלפי מעלה. השתמש חלק שיווי המשקל של הדוגמית 'עוגן' הרקמה אל הבדל. חנות דגימות ייבוש עד הדמיה. בצע הדמיה SEM כמתואר ג'ונס (2012) 21.

9.קְבִיעַת כָּמוּת

  1. לאחר הכנה אימונוהיסטוכימיה, לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal epifluorescent או לייזר סריקה. לאחר הכנת SEM, השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים סורקים כדי שזה יקלוט את הדגימות. תמונה למשטח הפסגה של האיבר של קורטי עם תאי שיער שבלול חשוף ותאי תמיכה intercalated.
  2. גדר בתפקידים השונים לאורך צינור השבלול, כגון 25, 50, ו -75% מהבסיס ולהשתמש אלה כדי להשוות אזורי שבלול בין דגימות מוטציה ושליטה. לנתח ולהשוות מוטציות cilia עם הפקדים להמלטה שלהם, כמו בדלי רקע גנטי יכולים לשנות את הפנוטיפ השבלול.
    הערה: האיבר של קורטי מתפתח שיפוע המשתרע מאמצע הבסיס הוא כלפי הקודקוד ואת הבסיס. בשנת עכבר, פיתוח אינו שלם עד P14, ולכן חשוב להשוות אזורים בשלבים ועמדות התפתחותי דומים.
  3. תמונות קח באמצעות בתוכנה הנלווית המיקרוסקופ כי Allow כימות של פנוטיפ מסוים כנדרש (ראה להלן). השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כגון J תמונה או בתוכנה נלווית המיקרוסקופ למדידת אורכים, לספור תאים ולקבוע לוקליזציה חלבון כמתואר להלן. גרף נתונים אלה כתרשים בר, עלילת פיזור, כתם תיבה או היסטוגרמה, השוואת שליטה מול מוטציה.
  4. אורך כולל של צינור השבלול (איור 3 א):
    1. באמצעות סמן שיער תא או phalloidin, (אשר מסמן את חבילות stereociliary), לקבוע ולמדוד איפה האפיתל חושית מתחיל ונגמר. אורכו של צינור שבלול מתקצר לעתים קרובות מוטנטים cilia.
  5. ליקויים צרורים Stereociliary (איור 3 ב, ד, ה, ז):
    1. מדוד קמירות צרורה (גובה) כמו המרחק קצר בין הקודקוד של הצרור והקו משתרע דרך בשני קצוות של 'נשק' הצרורה כמוצג 3G האיור, עזב. לחלופין, לכמת את האזורמוקפת בזרועות הצרורה stereociliary תא שיער חיצוני כפי שמוצג 3G האיור, נכון. אם תאי שיער עם צרורות stereociliary עגולות ניתן לזהות ולמנות אותן כאחוז בתאים השיער הכולל.
      הערה: ריסי מוטציות רבות ליקויים צרורים ניתן לצפות ללא קשר האורינטציה צרורה. קשה לכמת מומים צרורים stereociliary במדויק.
  6. כיווניות של חבילות stereociliary (איור 3B, C, G):
    1. להעריך את הכיוון של כל יחסי צרור פרט קו הארכת בניצב בשורה של תאי עמוד שמפרידה בין תאי שיער הפנימיים והחיצוניים. תאים עם אורינטציה נורמלית מיושרים לאורך ציר בניצב זה ולכן יש רוטציה של 0 °. לקבוע זוויות סיבוב או באמצעות סימון 360 ° או סטיות מוחלטות החל מיום 0 °.
  7. מיצוב Kinocilia או מיצוב צרור stereociliary (איור3B, F, H):
    1. הרוזן באחוז התאים בהם kinocilia חסרים. מדדו את המרחק בין kinocilium אל 'קודקוד' או מרכז של צרור. ה 'הקודקוד' של צרור לא יהיה קל להגדיר אם צרורות הם לא נורמלים, וכן הלאה במרכז הצרור יכול לשמש במקום.
  8. לכמת את עמדת kinocilia וצרורות stereociliary על פני התא שיער הפסגה, על ידי יצירת שכבת רשת מיקומית על כל תא שיער וסימון המיקום של כל אחד בבסיס kinocilium או במרכז הקודקוד / של צרור stereociliary. הצגת נתונים כאחוז בכל קטגוריה שנמצאת בתוך אזור מסוים של הרשת, ועל ידי שכיסה את מיקומם של כל סימון על גבי רשת מיקומית אחד.
    הערה: ברקמות שליטה, kinocilia תמיד מחוברים הקודקוד של צרור stereociliary. מוטנטים cilia, kinocilia לעתים קרובות חסר, mislocalized עדיין מחובר עדיין, או אפילו מנותק לחלוטין מן sצרור tereociliary.
  9. אורך Kinocilia (איור 3I):
    1. מדוד את האורך של kinocilium ידי תיוג בטוש axoneme ריסי. רק למדוד kinocilia כי שטוח בתוך מטוס confocal 1.5 מיקרומטר. ודא cilia משקר שטוח ידי התבוננות נוף חתך של רקמות סרק. השוואת דגימות מתאימות בגיל מאותו אזור של שבלול מאז kinocilium חזר בו במהלך הפיתוח.
  10. Mislocalization של חלבונים קוטביים:
    1. בעקבות אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים כנגד חלבונים קוטביים כגון Vangl2 ו Gαi3, לקבוע את הלוקליזציה באמצעות הדמיה.

הערה: בחלק מוטציות cilia, לוקליזציה של חלבונים קוטביים מופרת. אלה כוללים Vangl2 ו Gαi3, אשר הוכחו משתבש Ift20, Bbs8 ו Bbs6 מוטציה שבלול.

הערה: דוגמאות נוספות עבור איך לכמת polarit תא תצוגת שיערy ניתן למצוא בעיתונים הבאים. קרטין, et al. (2003) 22 העת Current Biology, Montcouquiol, et al. (2003) טבע 7, וואנג, et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et al. (2008) שיטות בביולוגיה מולקולרית 24, מאי-Simera, et al. (2012) שיטות בביולוגיה מולקולרית 25, Yin ואח '(2012) PLoS ONE 26.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבלול Dissection והכן רקמות

לאחר הסרת המוח, דיסקציה sagittal באמצע הקו לתפקיד ראש עכבר P0, המבוך הגרמי, במבט מאחור, ניתן דמיינו (איור 1A, חץ לבן) והוסר. איור 1B מציגה את המבוכים גרמיים המבודדים עם שיער השבלול כלפי מעלה, גחון, (מהשמאל) מאחור, הגבה (מימין). נקודות חץ הלבנות אל החלון הסגלגל שממנו אפשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת הכנת רקמת שבלול לניתוח, יש כמה נקודות מפתח כדי לזכור. ראשית, בדלי רקע גנטי יכולים לשנות את הפנוטיפ השבלול, מה שהופך אותו הצורך לנתח ולהשוות שולט להמלטה בלבד. שנית, הסרה מלאה של קרום tectorial נדרש לקבל את התמונות הטובות ביותר עם אימונוהיסטוכימיה והוא חיוני SEM. קרום tectorial הוא מבנה אטום יכול לטשטש את תאי האפיתל חושית ישירות מתחתיו, מה שהופך הדמיה יותר מאתגר. לפעמים במהלך עיבוד, קרום tectorial עלול להתכווץ בחזרה, לחשוף את תאי השיער. גם במקרים אלה הסרה מומלצת בחום. שלב זה דור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מצהיר שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מבקש להודות מתיו קלי, Tiziana Cogliati, ג'סיקה Gumerson, Uwe Wolfrum, רבקה לברון, ויולה קרצ'מר וזואי מאן להערכה ביקורתית שלהם של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי בפרס Sofja Kovalevskaya (קרן Humbodlt) ואת יוהנס-גוטנברג אוניברסיטת מיינץ, גרמניה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלים/ציוד
אלסטומר סיליקון - Sylgard 184Sigma-Aldrich761028-5EAראה הערה 2
מספריים מיקרו ניתוח-להב ישר
(מס' 5 ו-55) ומלקחיים קהים
.שקופיות
פתקי כיסוי מיקרוסקופ שונים (22 מ"מ ופעמים; 40 מ"מ ופעמים; 0.15 מ"מ)
פיניםשונים
Fine Science Tools26002-10
SEM מחזיק מדגםtousimis8762
סריקת חתיכי מיקרוסקופ אלקטרוניםTED PELLA16111
PELCO לשוניות: דבק פחמןTED PELLA16084-3
מיקרוסקופ פלורסנט
שונותסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים
כיסויי זכוכיתשונים
של מברשת
1& פעמים; תמיסת מלח חומצה פוספט (PBS)Gibco/Life Technologies10010023
פרפורמלדהיד  (PFA) (דרגת EM נדרשת עבור EM)שוניםהכן תמיסה של 4% ב -1 פעמים; PBS התרעננה בכל פעם. דרגת EM נדרשת עבור EM.
2.5% גלוטראלדהיד דרגה 1סיגמא-אולדריץG5882
Tris-HCl (pH 7.5)שונים
NaClשונים
CaCl 2שונים
Triton X-100
שונים סרום עיזים רגילשונים
AffiniPure Fab Fragment חמור נגד עכבר IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-007-003
Fluoromount-G מדיה הרכבהSouthernBiotech0100-01
10× הנקס תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Gibco/Life Technologies14065
HepesGibco/Life Technologies15630-080
אוסמיום טטרוקסיד (OsO4סיגמא-אולדריץ'/פלוקה אנליטי75632
חומצה טאניתסיגמא-אולדריץ'403040
אתנול 200 הוכחהנוגדנים שונים
anti Arl13bProtein Tech17711-1-APריכוז מומלץ 1:1,000
אנטי אצטילציה טובולין (611-B1)Sigma-AldrichT6793ריכוז מומלץ 1:800
אנטי גמא טובולין (GTU-88)Sigma-AldrichT6557ריכוז מומלץ 1:200
anti Zo_1 Invitrogen40-2300ריכוז מומלץ 1:500
Myosin VIProteus Biosciences25-6791ריכוז מומלץ 1:1000
Myosin VIIaProteus Biosciences25-6790ריכוז מומלץ 1:1,000
anti Vangl2Merk MilliporeABN373ריכוז מומלץ 1:250
anti Gα i3Sigma-AldrichG4040ריכוז מומלץ 1:250
Alexa Fluor® 488 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12379ריכוז מומלץ 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 PhalloidinInvitrogen/Life TechnologiesA12380ריכוז מומלץ 1:300 - 1,000
מלקחיים עדינים שונים מיקרוסקופ ניתוח שונים מיקרוסקופ זכוכית לא מצופות שונות פיפטות העברה שונות זעירים   מייבש נקודות קריטיות שונות שקופיות מיקרוסקופ זכוכית שונות רקמות Kimwipe שונות  ריאגנטים שונים צבע עדין' )

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7(2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378(2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7(2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839(2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988(2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925(2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VIIAZO 1

מאמרים קשורים