אנו מתארים הליך ניסוי פשוט ומהיר ליצירת fibroblasts העיקרי מהאוזניים והזנבות של עכברים. ההליך אינו דורש הכשרה מיוחדת ובעלי חיים יכול לשמש לדור של תרבויות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים ראשוניים נגזרים ישירות מהרקמה ונחשבים לנציג נוסף של המצב הפיזיולוגי של תאים בגוף חי משורות תאים הוקמו. עם זאת, יש לי תרביות תאים ראשוניות בדרך כלל אורך חיים סופי וצריכה להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. פיברובלסטים הם מקור נגיש של תאים ראשוניים. כאן, אנו דנים בהליך ניסיוני פשוט ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי להקים תרבויות עיקריות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים. כאשר הפרוטוקול ואחריו בזהירות, זיהומים צפויים להתרחש למרות השימוש ברקמות שאינן סטרילי מאוחסנות לזמן ממושך ובמקרים מסוימים. Fibroblasts להתרבות במהירות בתרבות ובניתן להרחיב למספרים משמעותיים לפני שעברנו הזדקנות replicative.
מבוא
תאים ראשוניים נגזרים מרקמת חיה ותרבותית בתנאים במבחנה. מקובל להניח כי תאים ראשוניים דומים למצב הפיזיולוגי ורקע גנטי של הרקמה שממנו הם מקורו משורות תאים הונצחו או גידול 1 באופן הדוק יותר. מסיבה זו, תאים ראשוניים מייצגים מודל שימושי לחקר 2,3 שאלות ביולוגי. עם זאת, בניגוד לשורות תאים קבעו כי לגדול ללא הגבלת זמן, תאים ראשוניים סופו של דבר לעבור הזדקנות בתרבות ובצריכים להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה.
תאים ראשוניים נפוצים כוללים fibroblasts, תאי אפיתל, תאי אנדותל, תאי T, תאי B, מקרופאגים נגזר מח עצם (BMDM) ותאים דנדריטים נגזר מח עצם (BMDC). Fibroblasts לעתים קרובות מנוצלים כמודל תרבית תאים ראשוניים. הם מציעים יתרונות מרכזיים על פני תאים ראשוניים אחרים. תרביות תאים בקלות הוקמו, מתוחזק בקלות ולא דורשות purification של תאים לפני התרבות. יש להם תפוצה ראשונית מהירה ואין דרישה לפרוטוקולים בינוניים או הפעלה מיוחדות. Fibroblasts ניתן transfected ביעילות באמצעות ביולוגי, כימי, ופרוטוקולים פיזיים 4,5. יש אפשרות לאחסן את האוזניים של עד 10 ימים בRT לפני הקמת תרביות תאים. תרבויות פיברובלסטים הם תורמים להדמיה של תהליכי cytoplasmic ומתאימים לתכנות מחדש לתאי גזע pluripotent המושרה (iPS) 6.
פיברובלסטים הם תאים חשובים של רקמת החיבור שמפרישים חלבוני קולגן ומטריקס 7. הם מספקים את המסגרת המבנית ברקמות רבות 8 ולשחק תפקיד חיוני בריפוי פצעים ו9,10 תיקון רקמות.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (<4 שעות) להקים תרבויות פיברובלסטים מאוזניים וזנבות של עכברים 11. הפרוטוקול מחייב עכבר מינימאליניסיון לקצור את הרקמות (בניגוד לפרוטוקולים אחרים 12,13) וניתן להשתמש בם כדי להקים תרבויות מאוזניים מאוחסנות במדיום ב RT לעד 10 ימים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עכברים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא בעמידה בהנחיות המוסדית עד מתת חסד (המוסדי הטיפול בבעלי חיים והנחיות ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור והוועדה הלאומית המייעצת למחקר בבעלי חיים מעבדה (NACLAR) הנחיות).
1. עכברים
- להזמין עכבר אחד הרקע הגנטי המתאים. פרוטוקול זה מבוסס על רקמה נובעת מC57BL אחד / 6 עכבר.
2. הכנת בינונית מלא
- הכן בינוני מלא על ידי הוספת הרכיבים לרוזוול פרק זיכרון המכון (RPMI) מדיום 1640 הבאים: 10% בסרום עגל עוברי (FCS), 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 100 מיקרומטר asparagine, גלוטמין 2 מ"מ, 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין.
3. הכנת פתרונות אנזים
- הכן פתרון collagenase D בצינור תחתון חרוטי 15 מיליליטר.
- שוקל 10 מ"ג של collagenase ד דיD ssolve collagenase ב 4 מיליליטר בינוני שלם.
- הכן פתרון pronase בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge.
- לשקול 10 מ"ג של pronase.
- הוסף 5 μl של 1 חיץ M טריס (pH 8.0). הוסף 1 μl של 0.5 M EDTA (pH 8.0).
- ראש עם 494 μl של מים סטריליים.
- דגירה פתרון pronase על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות.
4. הכנת Collagenase D-pronase מיקס (≤2 זנבות)
הערה: בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.
- הוסף 250 μl של פתרון pronase 4 מיליליטר של תמיסת collagenase D.
- להעביר את תערובת D-pronase collagenase דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך צינור תחתון סטרילי 15 מיליליטר חרוטי.
5. הפקת פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב
- להרדים עכברים על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות.
- מקום מכשירים (מספריים ומלקחיים) autoclaved כירורגית בשכונה תרבית תאים.
- להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלם לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטרים כל אחת.
- חותך את האוזניים (~ רדיוס 1 סנטימטר) ו -5 סנטימטרים של זנב (מקצה הזנב) של עכבר עם מספריים ודגירה של 5 דקות ב 40 מיליליטר אתנול 70% בצינור תחתון סטרילי 50 מיליליטר חרוטי.
- אוזני אוויר יבשות וזנב על ידי הצבת אותם בצלחת תרבית תאי 10 סנטימטרים פתוחות בשכונה במשך 5 דקות. ברגע שהתייבש, אוזן העברה וחתיכות זנב לשתי מנות התרבות שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב" המכיל 10 מיליליטר בינוני שלם כמתואר בשלב 5.3.
- הסרת שיער מהאוזניים וזנב המספריים באמצעות.
- חותך את האוזניים וזנב לחתיכות קטנות יותר מ 3 מ"מ בגודל באמצעות מספריים.
- העבר את הרקמות לחתוך לתוך 1.8 מיליליטר בקבוקוני cryotube שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב" ולהוסיף פתרון D-pronase collagenase מספיק לנפח להגיע הסימן 1.8 מיליליטר בבקבוקון.
- Pתחרה בקבוקוני cryotube אופקית על שייקר ולנער את הדגימות ב 200 סל"ד 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר 90 דקות דגירה, להסיר את בקבוקוני cryotube מייקר ומניח את צלוחיות במכסת המנוע.
- להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלם לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטר, "אוזניים" שכותרתו ו" זנב "כל אחד, ולשים את מסננת 70 מיקרומטר תא בכל מנה.
- מניחים את רקמות אוזן וזנב מתעכלים במסננת 70 מיקרומטר התא במנות מסומנות בהתאם מוכנות בשלב 5.11 וכוח לטחון את הרקמות באמצעות בוכנת מזרק 10 מ"ל ל> 5 דקות. לנער את מסננת התא מדי פעם במדיום לשטוף תאים מתוך מסננת התא.
- פיפטה ההשעיה תא מכל מאכל לתוך צינורות תחתון שני 15 מיליליטר חרוטי שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב". לשטוף את הצלחת ומסננת עם מדיום מלא נוסף 10 מ"ל ולהוסיף הבינוני לצינורות תחתון חרוטי 15 מיליליטר המתאים.
- ספין למטה התאהשעיה למשך 7 דקות ב~ 580 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגות תא קירור.
- הסר supernatant, להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלמה לתא גלולה בשפופרת 15 מיליליטר חרוטי תחתון וresuspend התאים.
- חזור על שלב 5.14 ו5.15.
6. Culturing של תערובת תאים
- הסר supernatant. ודא שהתא גלולה נשאר באין מפריע.
- להשעות מחדש תאים ב 10 מיליליטר בינוני שלם ולהוסיף את התערובת המתאימה לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטרים שכותרתו "אוזניים" ו- "זנב".
- הוסף 10 amphotericin B פתרון μl (פתרון מניות: 250 מיקרוגרם / מיליליטר) לתרבות.
- דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified.
- ביום השלישי, להחליף בינוני עם בינוני 10 מיליליטר טרי שלם המכיל 10 μl של amphotericin B כדי להסיר שאריות (איורים 1 ו -2).
7. תת-תרבות של פיברובלסטים
- Wheתרבות n מגיעה סביב 70% confluency (יום 3-4 של תרבות) להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם מי מלח 5 מיליליטר סטרילי פוספט 1x שנאגרו (PBS).
- הסר PBS ולהוסיף פתרון טריפסין-EDTA 1x סטרילי 2 מיליליטר לתאים.
- דגירה התאים למשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified.
- לאחר 5 דקות, לטפוח בעדינות את המנה התרבות ולהוסיף 6 מיליליטר בינוני שלמה לתאים.
- מעבירים את ההשעיה תא צינור תחתון 15 מיליליטר חרוטי ולסובב את הצינור במשך 5 דקות ב~ 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגות תא קירור.
- הסר supernatant, ובעדינות מחדש להשעות את התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני שלם.
- זרע 2 x 10 5 תאים בצלחת תרבית תאי 10 סנטימטרים ודגירת התאים על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified במשך 3-4 ימים לפני חזרה על שלבי 7.1-7.6.
8. הכנת אוזניים למשלוח
הערה: בצע tהוא השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.
- להרדים עכברים על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות.
- הנח מספריים ומלקחי autoclaved למכסה מנוע תרבית תאים.
- הוסף 50 מיליליטר בינוני שלם לתוך צינור תחתון חרוטי 50 מיליליטר.
- חותך את האוזניים (~ רדיוס 1 סנטימטר) של עכבר עם מספריים.
- העבר את האוזניים לתוך הצינור התחתון חרוטי 50 מיליליטר (כפי שהוכן בשלב 3) מלקחיים באמצעות.
- לאטום את הצינור תחתון 50 מיליליטר חרוטי עם parafilm לפני המשלוח ב RT בתיבה מתאימה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפקה של fibroblasts מתוצאות רקמה בכמות משמעותית של רקמת פסולת (איור 1). בניגוד לפסולת רקמות, fibroblasts לדבוק משטחי פלסטיק בתרבית רקמה בין יום 1 ו -3 של התרבות. הבינוני של תרבויות פיברובלסטים ניתן לשנות בבטחה ביום 3 של תרבות, שאמור להקטין באופן משמעותי את הרמות של הווה פסולת בתרבות (איור 2). Fibroblasts להציג מורפולוגיה מוארכת והציטופלסמה נראית בבירור (איורים 1 ו -2). תאי mitotic צריכים להיות נוכחים מיום 3 של התרבות ואילך ותאים צ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מספקים הליך ניסוי פשוט, זול ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. החילוץ צריך לגרום fibroblasts החלוקה חסיד ומהירות תוך 3 ימים לאחר בידוד של הרקמה. מגבלה חשובה של תאים ראשוניים היא הזדקנות, מעצר צמיחה קבוע 15. שימוש בפרוטוקול, ניתן passaged תרבויות פיברובלסטים במשך 5 עד 6 פעמים לפני fibroblasts הפך מזדקן, שצוין על ידי השטחה של תאים, להגדיל בגודל (2-3 פעמים עליה) וכישלון להרחיב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים פיננסיים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ה-NRF HUJ-CREATE - מנגנונים תאיים ומולקולריים של דלקת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| סרום עגל עוברי | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-מרקפטואתנול | סיגמא-אולדריץ' | M3148 | |
| אספרגין | סיגמא-אולדריץ' | A4159 | |
| גלוטמין | סיגמא-אולדריץ' | G8540 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | HyClone | SV30010 | |
| אתנול | Merck Millipore | 107017 | אבסולוט לניתוח |
| קולגנאז D | Roche Diagnostics | 11088866001 | מ-Clostridium histolyticum, פרוטאז פרונאז לא סטרילי, ליופיליזציה, לא סטרילי |
| Merck Millipore | 53702 | מ-Streptomyces griseus | |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra טהור |
| כיתה 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | ביוטכנולוגיה דרגה |
| 10X פוספט חוצץ מלח (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | |
| תמיסת טריפסין-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% טריפסין, 0.2% EDTA, טריפסין גמא מוקרן בתהליך SER-TAIN, ללא פנול אדום, במי מלח |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μ גרם/מ"ל במים נטולי יונים, מספריים מסוננים סטריליים |
| Aesculap | |||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μ מסנן מזרק M | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μ מסננת תאים | M SPL | 93070 | |
| בוכנת מזרק | Terumo | SS+10L | |
| צינור קריוביאלי | NUNC | 368362 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ס"מ צלחת תרבית תאים | גריינר | 664160 | צלחת טיפול בתרבית תאים |
| צינור תחתון חרוטי 15 מ"ל | גריינר | 188271 | |
| 50 מ"ל צינור תחתון חרוטי | גריינר | 227261 | |
| GFL | 1002 | ||
| צנטריפוגה | אפנדורף | 5810R | |
| שייקר דגירה | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 מיקרוסקופ אור | Carl Zeiss AG |
מקורות
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
