אנו מתארים הליך ניסוי פשוט ומהיר ליצירת fibroblasts העיקרי מהאוזניים והזנבות של עכברים. ההליך אינו דורש הכשרה מיוחדת ובעלי חיים יכול לשמש לדור של תרבויות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים ראשוניים נגזרים ישירות מהרקמה ונחשבים לנציג נוסף של המצב הפיזיולוגי של תאים בגוף חי משורות תאים הוקמו. עם זאת, יש לי תרביות תאים ראשוניות בדרך כלל אורך חיים סופי וצריכה להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. פיברובלסטים הם מקור נגיש של תאים ראשוניים. כאן, אנו דנים בהליך ניסיוני פשוט ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי להקים תרבויות עיקריות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים. כאשר הפרוטוקול ואחריו בזהירות, זיהומים צפויים להתרחש למרות השימוש ברקמות שאינן סטרילי מאוחסנות לזמן ממושך ובמקרים מסוימים. Fibroblasts להתרבות במהירות בתרבות ובניתן להרחיב למספרים משמעותיים לפני שעברנו הזדקנות replicative.
מבוא
תאים ראשוניים נגזרים מרקמת חיה ותרבותית בתנאים במבחנה. מקובל להניח כי תאים ראשוניים דומים למצב הפיזיולוגי ורקע גנטי של הרקמה שממנו הם מקורו משורות תאים הונצחו או גידול 1 באופן הדוק יותר. מסיבה זו, תאים ראשוניים מייצגים מודל שימושי לחקר 2,3 שאלות ביולוגי. עם זאת, בניגוד לשורות תאים קבעו כי לגדול ללא הגבלת זמן, תאים ראשוניים סופו של דבר לעבור הזדקנות בתרבות ובצריכים להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה.
תאים ראשוניים נפוצים כוללים fibroblasts, תאי אפיתל, תאי אנדותל, תאי T, תאי B, מקרופאגים נגזר מח עצם (BMDM) ותאים דנדריטים נגזר מח עצם (B....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עכברים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא בעמידה בהנחיות המוסדית עד מתת חסד (המוסדי הטיפול בבעלי חיים והנחיות ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור והוועדה הלאומית המייעצת למחקר בבעלי חיים מעבדה (NACLAR) הנחיות).
1. עכברים
- להזמין עכבר אחד הרקע הגנטי המתאים. פרוטוקול זה מבוסס על רקמה נובעת מC57BL אחד / 6 עכבר.
2. הכנת בינונית מלא
- ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפקה של fibroblasts מתוצאות רקמה בכמות משמעותית של רקמת פסולת (איור 1). בניגוד לפסולת רקמות, fibroblasts לדבוק משטחי פלסטיק בתרבית רקמה בין יום 1 ו -3 של התרבות. הבינוני של תרבויות פיברובלסטים ניתן לשנות בבטחה ביום 3 של תרבות, שאמור להקטין באופן משמעותי את הרמות של הווה פסולת בתרבות (איור 2). Fibroblasts להציג מורפולוגיה מוארכת והציטופלסמה נראית בבירור (איורים 1 ו -2). תאי mitotic צריכים להיות נוכחים מיום 3 של התרבות ואילך ותאים צ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מספקים הליך ניסוי פשוט, זול ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. החילוץ צריך לגרום fibroblasts החלוקה חסיד ומהירות תוך 3 ימים לאחר בידוד של הרקמה. מגבלה חשובה של תאים ראשוניים היא הזדקנות, מעצר צמיחה קבוע 15. שימוש בפרוטוקול, ניתן passaged תרבויות פיברובלסטים במשך 5 עד 6 פעמים לפני fibroblasts הפך מזדקן, שצוין על ידי השטחה של תאים, להגדיל בגודל (2-3 פעמים עליה) וכישלון להרחיב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים פיננסיים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ה-NRF HUJ-CREATE - מנגנונים תאיים ומולקולריים של דלקת.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| סרום עגל עוברי | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-מרקפטואתנול | סיגמא-אולדריץ' | M3148 | |
| אספרגין | סיגמא-אולדריץ' | A4159 | |
| גלוטמין | סיגמא-אולדריץ' | G8540 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | HyClone | SV30010 | |
| אתנול | Merck Millipore | 107017 | אבסולוט לניתוח |
| קולגנאז D | Roche Diagnostics | 11088866001 | מ-Clostridium histolyticum, פרוטאז פרונאז לא סטרילי, ליופיליזציה, לא סטרילי |
| Merck Millipore | 53702 | מ-Streptomyces griseus | |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra טהור |
| כיתה 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | ביוטכנולוגיה דרגה |
| 10X פוספט חוצץ מלח (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | |
| תמיסת טריפסין-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% טריפסין, 0.2% EDTA, טריפסין גמא מוקרן בתהליך SER-TAIN, ללא פנול אדום, במי מלח |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μ גרם/מ"ל במים נטולי יונים, מספריים מסוננים סטריליים |
| Aesculap | |||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μ מסנן מזרק M | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μ מסננת תאים | M SPL | 93070 | |
| בוכנת מזרק | Terumo | SS+10L | |
| צינור קריוביאלי | NUNC | 368362 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ס"מ צלחת תרבית תאים | גריינר | 664160 | צלחת טיפול בתרבית תאים |
| צינור תחתון חרוטי 15 מ"ל | גריינר | 188271 | |
| 50 מ"ל צינור תחתון חרוטי | גריינר | 227261 | |
| GFL | 1002 | ||
| צנטריפוגה | אפנדורף | 5810R | |
| שייקר דגירה | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 מיקרוסקופ אור | Carl Zeiss AG |
מקורות
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformat....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
