Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS וAFM ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים

סיכום

כדי לקבל מידע בסיסי על ספיגה ומיחזור של זהב ממערכות מימיות, נחקרה האינטראקציה של ננו-חלקיקי Au(III) ו-Au(0) על חלבוני שכבת S. הספיגה של פולימרים חלבונים נחקרה על ידי ICP-MS וזו של חד-שכבות חלבון על ידי QCM-D. AFM עוקב מאפשר הדמיה של הננו-מבנים.

תקציר

בפרסום זה מתוארת התנהגות ספיגת הזהב של חלבוני שכבת פני השטח (שכבת S) (Slp1) של Lysinibacillus sphaericus JG-B53. ביומולקולות אלו מסודרות במערכים דו-ממדיים פרה-קריסטליים על משטחים, קושרות מתכות, ולכן הן מעניינות עבור מספר יישומים ביוטכניים, כגון חומרים ביו-סורפטיים להסרה או התאוששות של יסודות שונים מהסביבה ותהליכים תעשייתיים. התצהיר של ננו-חלקיקי Au(0) על שכבות S, בין אם על ידי סינתזה מכוונת של שכבת ^{S 1} או ספיחה של ננו-חלקיקים, פותח אפשרויות חדשות ליישומים חושיים מגוונים. למרות שמחקרים רבים תיארו את התכונות הביו-ספיגה של שכבות ^{S 2-5}, הבנה מעמיקה יותר של אינטראקציה בין חלבון לחלבון וחלבון-מתכת עדיין נותרה מאתגרת. במחקר הבא, נעשה שימוש בספקטרומטריית מסה בצימוד אינדוקטיבי (ICP-MS) לזיהוי ספיגת מתכות על ידי שכבות S תלויות. זה היה מתואם למדידות של מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), המאפשר זיהוי מקוון של היווצרות חד-שכבתית חלבונית ושקיעת מתכות, ובכך הבנה מפורטת יותר על קשירת מתכות.

תוצאות ICP-MS הצביעו על כך שהקישור של Au(III) לפולימרים בשכבת S המרחפים תלוי ב-pH. הקישור המקסימלי של Au(III) הושג ב-pH 4.0. חקירות QCM-D אפשרו זיהוי של ספיגה של Au(III) כמו גם שקיעה של Au(0)-NPs בזמן אמת במהלך הניסויים באתרם. יתר על כן, שיטה זו אפשרה לחקור את השפעת קשירת המתכת על יציבות סריג החלבון של Slp1. ניתן היה לדמיין תכונות מבניות ויציבות שכבת החלבון ישירות לאחר ניסוי QCM-D באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). לסיכום, השילוב של שיטות שונות אלו מספק הבנה מעמיקה יותר של קשירת מתכות על ידי חלבוני שכבת S חיידקים בתרחיף או כחד-שכבות על תאי חיידקים או משטחים מגובשים מחדש.

מבוא

בשל השימוש הגובר של זהב עבור מספר יישומים כמו אלקטרוניקה, זרזים, חיישנים, או מכשירים רפואיים, הביקוש של מתכת יקרה זו גדל במשך הזמן כמה השנים האחרונות ^6-9. זהב, כמו גם רבות מתכות יקרות וכבדות אחרות משתחררים לסביבה באמצעות שפכים תעשייתיים בריכוזים לדלל, באמצעות פעילויות כרייה, וסילוק פסולת ^7,8,10, למרות שרוב הזיהום סביבתי על ידי מתכות כבדות או יקרות הוא תהליך מתמשך נגרמים בעיקר על ידי פעילות טכנולוגית. זה מוביל להפרעה משמעותית של מערכות אקולוגיות טבעיות ועלול לאיים על בריאות אדם ^9. ידיעת תוצאות השליליות אלה מקדם את החיפוש אחר שיטות חדשות להסרת מתכות ממערכות אקולוגיות ושיפורים מזוהמים במחזור מתכות משפכים תעשייתיים. שיטות פיסיקלי כימיות מבוססות היטב כמו משקעים או חילוף יונים הן לא כל כך יעילות, במיוחד בתחום ההייly מדולל פתרונות ^7,8,11. Biosorption, גם עם חיים או מת ביומסה, היא חלופה אטרקטיבית לטיפול בשפכים ^10,12. השימוש בחומרים ביולוגיים כזה יכול להפחית את הצריכה של כימיקלים רעילים. מיקרואורגניזמים רבים תוארו לצבור או לשתק מתכות. לדוגמא, תאים של sphaericus Lysinibacillus (L. sphaericus) JG-A12 הראו יכולות גבוהות מחייבות למתכות יקרות, למשל, פ"ד (II), Pt (II), Au (III), ומתכות רעילות אחרות כמו Pb (II) או U (VI) ^4,13, תאים של megaterium Bacillus לCr (VI) ^14, תאים של שמר אפייה לPt (II) וPd (II) ^15, ווולגרי כלורלה לAu (III) וU (VI) ^{16 , 17.} הכריכה של מתכות קודמות כמו Au (III), פ"ד (II), וPt (II) דווח גם לDesulfovibrio desulfuricans ¹⁸ ולL. sphaericus JG-B53 ^19,20. עם זאת, לא אלהחיידקים l לקשור כמויות גבוהות של מתכות ויישומם כחומר sorptive מוגבלים ^12,21. יתר על כן, מחייבת קיבולת מתכת תלויה בפרמטרים שונים, למשל, הרכב תא, ביו-רכיב המשמש, או סביבתי ותנאי ניסוי (pH, כוח יוני, וכו 'טמפרטורה). המחקר של דופן תא שברים המבודדים ^22,23, כמו שומני קרום, פפטידוגליקן, חלבונים, או רכיבים אחרים, מסייע להבין את המתכת מחייבת תהליכים של תאים שלמים נבנו מורכבים ^8,21.

מרכיבי התא התמקדו במחקר זה הם חלבוני S-שכבה. חלבוני S-שכבה הם חלקים של מעטפת התא החיצונית של חיידקים וחיידקים קדומים רבים, והם מהווים כ -15 - 20% ממסת החלבון הכוללת של אורגניזמים אלה. כממשק הראשון לסביבה, תרכובות תאים אלה משפיעות בחוזקה על תכונות ספיחת חיידקי ^3. חלבוני S-שכבה עם משקולות מולקולריות הנעות בין ארבעיםלמאות kDa מיוצרים בתוך התא, אבל הם התאספו מחוץ בו הם יכולים ליצור שכבות על ממברנות שומנים בדם או מרכיבי דופן תא פולימרים. ברגע בודד, כמעט כל S-שכבת חלבונים הרכוש המהותי לאופן ספונטני עצמי להרכיב בהשעיה, בממשקים, או על משטחים ויוצרים מבנים מישוריים או כמו ^{צינור-3.} עובי monolayer החלבון תלוי בחיידקים והוא בטווח של 5-25 ננומטר ^24. באופן כללי, מבני חלבון S-שכבה נוצרו יכולים להיות אלכסוני (P1 או P2), ריבוע (P4), או משושה (P3 או P6) סימטריה עם קבועי סריג של 2.5-35 ^3,24 ננומטר. נראה היווצרות הסריג להיות במקרים רבים תלויים בקטיונים דו ערכיים ובעיקר על Ca ^{2 + 25,26, רף, ג 'ואח'. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית'יבר ל Cortajarena) (Springer, 2}016 (שהוגש)). עם זאת, המפל מלא התגובה של קיפול מונומר, אינטראקציה מונומר-מונומר, ההיווצרות של סריג, והתפקיד של מתכות שונות, בעיקר של קטיונים דו ערכיים כגון Ca ^{2 +} וMg ^{2 +,} עדיין לא הבין באופן מלא.

המתח גרם-חיובי ל sphaericus JG-B53 (שם מsphaericus Bacillus לאחר סיווג פילוגנטי החדש) ²⁷ היה מבודד מערימת פסולת כריית אורניום "Haberland" (Johanngeorgenstadt, סקסוניה, גרמניה) ^4,28,29. חלבון S-השכבה הפונקציונלית שלה (Slp1) בעל סריג מרובע, משקל מולקולרי של 116 kDa ^30, ועובי של 10 ננומטר ≈ על תאי חיים חיידקים ^31. במחקרים קודמים, ההיווצרות במבחנה של שכבת חלבון סגורה ויציבה בעובי של כ -10 ננומטר הושגה בפחות מ -10 דקות ^19. הזן הקשורים ל sphaericus JG-A12, גם לבודד מהערימה "Haberland", בעל יכולות גבוהה מחייבות מתכת וחלבון S-השכבה המבודדת שלה הוכיח כימי גבוהות ויציבות מכאנית ושיעורי ספיחה טובים למתכות יקרות כמו Au (III), Pt (II), וPd (II) ^4,32,33. זה מחייב מתכות יקרות הוא פחות או יותר ספציפי לכמה מתכות ותלויות בזמינות של קבוצות פונקציונליות על פני החלבון החיצוני ופנימי של הפולימר ובנקבוביות שלה, כוח יוני, וערך ה- pH. קבוצות פונקציונליות רלוונטיות לאינטראקציה מתכת על ידי החלבונים הן COOH-, NH ₂ -, OH-, PO ₄ -, SO ₄ -, וכך-. באופן עקרוני, יכולות מחייבות מתכת לפתוח ספקטרום רחב של יישומים, ^{רף, ג 'ואח'. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית'יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)).} לדוגמא, כרכיבי biosorptive להסרת או שחזורשל מתכות רעילות או בעל ערך מומס, תבניות לסינתזה או בתצהיר מוגדר של חלקיקים מובנים באופן קבוע מתכתיים (NPS) לקטליזה, וחומרים מהונדסים יו אחרים כמו שכבות ביו-חושי ^3,5,18,33. מערכים מסודרים באופן קבוע NP כמו Au (0) -NPs יכולים לשמש ליישומים מרכזיים החל אלקטרוניקה מולקולרית וחיישנים, התקני אחסון צפיפות ultrahigh, וזרזים לCO-חמצון ^34-37. הפיתוח של יישומים כגון ועיצוב חכם של חומרים אלה מחייב הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המחייבים המתכת הבסיסית.

תנאי מוקדם לפיתוח של חומרים מבוסס ביו כזה הוא היישום אמין של שכבת ממשק בין biomolecule והמשטח הטכני ^38,39. לדוגמא, פוליאלקטרוליטים התאספו עם ^40,41 טכניקת השכבה אחר שכבה (LBL) שימשו כשכבת ממשק לגיבוש מחדש של חלבוני S-שכבה ³⁹ . כגון ממשק מציע דרך קלה יחסית לביצוע ציפוי החלבון בדרך לשחזור וכמותיים. על ידי ביצוע ניסויים שונים עם וללא שינוי עם יזמי דבק, אפשר להצהיר הצהרות בנוגע לקינטיקה ציפוי, יציבות שכבה, ואינטראקציה של מתכות עם מולקולות ביולוגיות ^{19,42, רף, ג 'ואח'. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית'יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)).} עם זאת, המנגנון המורכב של חלבון הספיחה והאינטראקציה חלבון-פני השטח אינו מובן לחלוטין. במיוחד מידע על קונפורמציה, אוריינטצית דפוס, וצפיפות ציפוי עדיין חסר.

microbalance גביש קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D) טכניקה משך תשומת לב בשנים האחרונות ככלי ללימוד חלבון ספיחה, קינטיקה ציפוי, ופרו אינטראקציהcesses בקנה המידה ננומטרי ^19,43-45. טכניקה זו מאפשרת לגילוי מפורט של ספיחה המונית בזמן אמת, ויכולה לשמש כאינדיקציה לתהליך חלבון הרכבה העצמית והצימוד של מולקולות תפקודיות ברשתות חלבון ^{19,20,42,46-48.} בנוסף, מדידות QCM-D לפתוח את האפשרות ללמוד תהליכי אינטראקציה מתכת עם השכבה חלבוניים בתנאים ביולוגיים טבעיים. במחקר שנערך לאחרונה, את האינטראקציה של חלבון S-השכבה עם מתכות נבחרו כמו האיחוד האירופי (III), Au (III), פ"ד (II), וPt (II) נחקר עם QCM-D ^19,20. שכבת חלבון adsorbed יכולה לשמש כמודל מופשט של דופן תא של חיידקי גרם חיובי. המחקר של מרכיב אחד זה יכול לתרום להבנה עמוקה יותר של אינטראקציה מתכת. עם זאת, רק ניסויי QCM-D לא מאפשרים הצהרות לגבי מבני משטח והשפעות של מתכות לחלבון. טכניקות אחרות הן הכרחיות כדי להשיג מידע כזה. קופה אחתsibility ליו-ננו הדמיה ומידע על קבלת תכונות מבניות הוא במיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM).

מטרתו של המחקר שהוצג הייתה לחקור את הספיחה של זהב (Au (III) וAu (0) -NPs) לחלבוני S-שכבה, בSlp1 המסוים של ל ' sphaericus JG-B53. ניסויים נעשו עם חלבונים תלויים על קנה מידה אצווה בטווח pH של 2.0-5.0 באמצעות ICP-MS ועם S-שכבות משותקות באמצעות QCM-D. בנוסף, ההשפעה של תמיסת מלח מתכת על יציבות הסריג נחקרה במחקרים AFM שלאחר מכן. השילוב של טכניקות אלה תורם להבנה טובה יותר של תהליכים באינטראקצית מתכת מבחנה ככלי ללמידה נוסף על אירועים מחייבים בתאים שלמים של חיידקים לגבי זיקות מתכת ספציפיות. ידע זה הוא לא רק חיוני לפיתוח של חומרי מסנן ישימים עבור ההתאוששות של מתכות להגנה על סביבה ושימור מחדשמקורות ^49, אלא גם לפיתוח של מערכים של צירופים ומתכתיים הורה מאוד עבור יישומים טכניים שונים.

פרוטוקול

1. תנאי מיקרואורגניזם וטיפוח

הערה:. כל הניסויים נעשו בתנאים סטריליים ל sphaericus JG-B53 התקבל מתרבות שהשתמר cryo ^29,30.

1. ההעברה cryo-השתמר תרבות (1.5 מיליליטר) מתחת לספסל הנקי ל -300 מיליליטר מרק מזין סטרילי (NB) תקשורת (תמצית בשר 3 G / L, 5 גר '/ peptone L, 10 גר' / ליטר NaCl). לאחר מכן מערבב את הפתרון במשך לפחות 6 שעות על 30 מעלות צלזיוס להשיג מראש התרבות לטיפוח.
2. לטפח את החיידקים בתנאים אירוביים בתקשורת NB ב- pH = 7.0, 30 מעלות צלזיוס בL 70 טיפס bioreactor קיטור במקום. לכן, למלא את הכור עם ≈ 57 מים ללא יוני L. להוסיף ולפזר תקשורת NB המוצקה ישירות בbioreactor (ריכוזים ראו לעיל).
   1. בנוסף להוסיף סוכן antifoam (30 μl / NB-מדיה L) לתקשורת כדי לדכא את היווצרות קצף במהלך טיפוח, אז החיטוי (122 מעלות צלזיוס, טמפרטורה מחזיקה זמן 30 דקות) בתקשורתבתוך מתקן הכור.
3. להתקרר התקשורת ולבצע ריווי חמצן מלא. התאם את ה- pH 7.0 (באמצעות 1 MH ₂ SO ₄ ו- 2 M NaOH) ולהתחיל את החיסון האוטומטי של טרום-תרבות 300 מיליליטר. התחל הקלטת נתונים של פרמטרים טיפוח בנקודת החיסון. התחבר פרמטרים מקוונים למשל, רמת חמצן מומסת (DO _2), בנוסף חומצה ובסיס, ו- pH-ערכים בטיפוח.
   1. צג התפתחות החיידקים באינטרנט על ידי מדידות עכירות לא פולשנית.
4. לבצע דגימה נוספת לאחר כל שעה של טיפוח ולקבוע פרמטר נוסף כגון משקל ביו יבש (BDW) וצפיפות מחובר אופטית (OD). לכן, לאסוף 20 מיליליטר מרק טיפוח בכל נקודה בתנאים סטריליים דגימה.
   1. לקבוע OD מחובר על ידי מדידות photometric של הספיחה ב 600 ננומטר. השתמש NB-בינוני filtrated סטרילי כערך ריק. מאחוראה להגיע ספיחה> 0.4 לדלל את ההשעיה התא הבא הליניאריות של חוק למברט-באר.
   2. לקביעת צנטריפוגות BDW 1 עד 5 מיליליטר של השעיה חיידקים (תלוי בתא צפיפות) בXG 5000 במשך 5 דקות ב RT. ייבש את התא גלולה שהושג ב 105 מעלות צלזיוס בחימום תנור עד יציבות מסה ולמדוד את מסת גלולה.
5. קח תמונות מיקרוסקופיות עם מיקרוסקופ מחקר לעומת שלב אופטי ב400 ו -1000 הגדלה של פי (לעומת שלב הקבל 2 ו -3 בהתאמה) לבדיקה של התפתחות החיידקים וכביקורת זיהום צולב.
6. לאחר שהגיע לשלב הצמיחה המעריכית זוהה על ידי מקוון לעשות ₂ ועכירות באינטרנט, לקצור את ביומסה על ידי צנטריפוגה זרימה דרך ב15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס ולשטוף ביומסה פעמיים עם חיץ סטנדרטי (50 מ"מ טריס, 10 מ"מ MgCl _2, 3 מ"מ ₃ נאן, pH = 7.5).
   הערה: גלולה ביומסה הושגה ניתן לאחסן ב -18 & #176; C עד שימוש נוסף לבידוד.

בידוד חלבון 2. S-שכבה וטיהור

הערה: לטהר פולימרים Slp1 פי שיטה מותאמת כפי שתואר לעיל ^{2,19,30,32,50,51.}

1. Homogenize ביומסה הגולמי שטפה והפשרה שהושגה מטיפוח במאגר סטנדרטי (1: 1 (w / v)) כדי להסיר שוטונים באמצעות disperser (רמה 3, 10 דקות) באמבט קרח קירור ב 4 מעלות צלזיוס.
2. צנטריפוגה ההשעיה (8000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) ולשטוף את הכדור שהושג פעמיים עם חיץ סטנדרטי (1: 1 (w / v)). לאחר הכביסה וצנטריפוגה (8000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות), resuspend גלולה במאגר סטנדרטי (1: 1 (w / v)), להוסיף DNase השני וRNase (0.4 יחידות / ביומסה ז) להשעיה ולהתפורר התאים בבר 1,000 עם homogenizer בלחץ גבוה. לאחר מכן צנטריפוגה ההשעיה ב27,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
   הערה: השעיה תא בקרה עם מיל המחקרcroscope. קרע הושלם כאשר פחות מ 2 - 3 תאים שלמים גלויים בתחום התצוגה של מיקרוסקופ בהגדלה של פי 400.
3. שטוף את הכדור פעמיים עם חיץ סטנדרטי (1: 1 (w / v)) ולבצע צנטריפוגה שוב. לאחר מכן resuspend גלולה במאגר סטנדרטי (2: 1 (w / v)) מעורבב עם 1% Triton X-100 ודגירה זה במשך 20 דקות תחת (100 סל"ד) רועד הרצופים לsolubilize פיקדונות שומנים.
4. צנטריפוגה הפתרון (27,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1) ולשטוף פעמים גלולה שהושגו שלוש עם חיץ סטנדרטי (1: 1 (w / v)).
5. דגירה גלולה שהושג לאחר צנטריפוגה נוספת (27,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1) במשך 6 שעות במאגר סטנדרטי (1: 1 (w / v)) מעורבב עם 0.2 g / L יזוזים, לhydrolyze קשרים ב ^-50 פפטידוגליקן. בנוסף להוסיף DNase השני וRNase (כל 0.4 יחידות / ביומסה ז) להשעיה.
6. לאחר צנטריפוגה (45,500 XG, 4 ° C, 1 שעה), resuspend שלב החלבון הלבן העליון עם נפח נמוך של tהוא supernatant צנטריפוגה (<30 מיליליטר) יחידות משנה חלבון מכיל.
7. Solubilize ההשעיה הלבנה על ידי ערבוב 1: 1 עם 6 מ 'hydrochloride guanidine (6 מ' GuHCl, 50 מ"מ טריס, pH = 7.2). הפתרון הופך בהיר.
8. בצע סינון סטרילי (0.2 מיקרומטר) של הפתרון שטופל GuHCl אחרי צנטריפוגה נוספת במהירות גבוהה (45,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1).
9. מעבירים את supernatant לצינורות קרום דיאליזה (MWCO 50,000 דלתון) ודיאליזה זה נגד מאגר recrystallization (1.5 מ"מ טריס, 10 מ"מ CaCl _2, pH = 8.0) במשך 48 שעות.
10. מעבירים את פתרון פולימר חלבון recrystallized הלבן לתוך צינורות וצנטריפוגות ב 45,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. Resuspend גלולה בהיקף נמוך של המים ultrapure (<30 מיליליטר).
11. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה לתוך צינורות קרום דיאליזה ולבצע דיאליזה נגד המים ultrapure עבור 24 שעות כדי להסיר תוכן חיץ.
    שים לב: מספר שינויים של ד חיץ או המים ultrapureהדיאליזה uring היא הכרחיות.
12. Lyophilize Slp1 המטוהרים במייבש הקפאה.

3. אפיון וכימות של Slp1 לניסויים

הערה: ריכוז Slp1 לניסויי ספיחה וציפוי היה לכמת על ידי spectrophotometry UV-VIS.

1. פיפטה 2 μl של מדגם Slp1 המומס ישירות על הכן המדידה התחתון של פוטומטר. קביעת ריכוז חלבון במקסימום ספיחה באורך גל של 280 ננומטר, אופייני לחלבונים. השתמש במקדם ההכחדה של 0.61 כדי לקבוע ריכוז Slp1. להשתמש בפתרון חופשי Slp1 למדידות התייחסות.
2. לדלל את החלבון עם החיץ (לניסויי ספיחה במצב אצווה להשתמש 0.9% NaCl, pH = 6.0 ולניסויי QCM-D להשתמש חיץ recrystallization, pH = 8.0) לריכוז רצוי לניסויים (ז 1 / L 0.2 g / L בהתאמה).
3. ניתוח איכות Slp1 ומשקל מולקולרי על ידי bioanal הסטנדרטיאלקטרופורזה ytical נתרן שיטת polyacrylamide סולפט dodecyl (SDS-PAGE) תוארה על ידי Laemmli, בריטניה ^52.
   1. בצע SDS-PAGE לפני שימוש Slp1 בתוך ניסויים ולמשל, Au לאחר הדגירה -NP (0) באמצעות ג'לי הפרדת polyacrylamide 10%.
   2. לתערובת SDS-דגימות ≈10 μl של מדגם הטיפוח או חלבון עם חיץ מדגם (טריס 1.97 גר ', bromophenol 5 מ"ג כחול, 5.8 מיליליטר גליצרין, SDS 1 גרם, 2.5 מיליליטר β-mercaptoethanol, למלא במי ultrapure 50 מיליליטר) ב יחס של 1: 1 (V / V) ופיפטה את התערובת לאחר דגירה 4 דקות ב 95 מעלות צלזיוס לכיסי ג'ל.
   3. הפעלת SDS-PAGE 30 דקות במתח של 60 V עד הדגימות לעבור את הג'ל אוסף ושינוי המתח 120 V עובר ג'ל ההפרדה פעם.
   4. הסר את ג'לי ממערכת ג'ל, לשטוף עם מים ultrapure ומקום עבור שעה 1 לפתרון קיבעון (10% חומצת חומץ, 50% אתנול אבסולוטי). לאחר מכן, יש לשטוף את ג'לי עם מים ultrapure.
   5. ג'לי כתםבאמצעות colloidal נוקבים מותאם Coomassie ^53,54 שיטה כחולות מבריקות. לאחר destaining ^72,73, לקחת תמונות SDS-PAGE על ידי מערכת תיעוד ג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן.

4. ניסויי ספיחה במצב אצווה וכימות מתכת

1. ליצוו ניסויי ספיחה להכין Au (III) פתרון מניות _מ4 HAuCl ∙ 3 H ₂ O, לדלל את המלח המתכת ולערבב אותו עם פתרון Slp1 / NaCl לריכוז ראשוני מתכת של 1 מ"מ וריכוז Slp1 הסופי של 1 גרם / L . לבצע ניסויים בשלישייה עם ביקורת שלילית נוספת ללא Slp1. השתמש בהיקף כולל של 5 מיליליטר לניסויי ספיחה.
2. לנער את ההשעיה ברציפות ב RT בערכי pH מותאם מראש שונים בין 2.0-5.0 למשך 24 שעות (להתאים את ה- pH עם פתרון HCl וNaOH מרוכז נמוך).
3. לאחר ספיחה, צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) לseparאכלתי Slp1 מsupernatant.
4. מעבירים את supernatant לתוך צינורות אולטרה סינון (MWCO 50,000 Da) ו צנטריפוגות זה ב15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להסיר מונומרים חלבון מומסים.
5. קבע את ריכוז המתכת בתסנין וכתוצאה מכך על ידי ICP-MS ^19,20 ולהשתמש בתוצאות לגב-חישוב sorbed מתכת על ידי המסה היבשה Slp1. מדידת עקרונות, הזדמנויות של השיטה והמרכיבים של ICP-MS המשומש תוארו בספרות ^55.
   1. הכן דגימות ואזכור למדידות ICP-MS באמצעות 1% HNO ₃ כמטריצה ​​ורודיום כסטנדרט פנימי (1 מ"ג / מיליליטר).

5. סינתזה של Au-NP וקביעת גודל חלקיקים

הערה: ציטראט התייצב Au (0) -NP היה מסונתז על פי שיטה מותאמת שתוארה קודם לכן על ידי Mühlpfordt, ח 'ואח'. (1982) כדי לקבל חלקיקים כדוריים בקוטר של 10 - 15 ^56,57 ננומטר .

1. הכן התייצב 25 מ"מ HAuCl ₄ ∙ 3 מניות H ₂ O להיווצרות NP.
2. לדלל 250 μl של פתרון מניות זה ב19.75 מיליליטר מים ultrapure דגירה אלה ב 61 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות רצוף תחת רעד.
3. הכן 5 מיליליטר של פתרון מניות שני (חומצת 12 מ"מ טאני, די-מימה נתרן ציטרט 7 מ"מ, 0.05 מ"מ K ₂ CO ₃₎ ודגירת פתרון 2 ^nd בנפרד 61 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
4. להוסיף בבחישה מתמדת פתרון מניות ^-2 לפתרון אחד. מערבבים את תערובת תגובה ללפחות 10 דקות על 61 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לקרר את הפתרון ולהשתמש בו לציפוי NP על סריג Slp1 בתוך ניסויי QCM-D.
   הערה: Au התוצאה (0) -NP התאפיינו בספקטרוסקופיה UV-VIS במקסימום ספיגה של 520 ננומטר, משמש בדרך כלל לגילוי של Au נוצר (0) -NPs ^58. הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.
5. לנתח את גודל יצרAu (0) -NP ידי ספקטרוסקופיה מתאם פוטון (PCS) אשר ידוע גם בשם פיזור אור דינאמי.
   1. לקביעת גודל NP, להעביר 1.5 מיליליטר של (0) -NP פתרון Au מסונתז לcuvettes בתנאים נטול אבק בזרימה למינרית תיבה ולנתח אותו עם גודל וסייזר חלקיקי פוטנציאל זטה. תיאור מפורט של מחשבים אישיים והכנת מדגם ניתן בורטנברגר, פ ואח '. (1993) ⁵⁹ וJain, ר 'ואח'. (2015) ^60.

6. ניסויים QCM-D - Slp1 ציפוי על משטחים וAu-NP ספיחה על Slp1 סריג

הערה: מדידות בוצעו עם QCM-D מצויד עם עד ארבעה מודולים זרימה. כל ניסויי QCM-D בוצעו עם קצב זרימה קבוע של 125 μl / דקה 25 מעלות צלזיוס. ציפוי Slp1 ומתכת דגירה / NP נעשו על חיישני SiO ₂ פיזואלקטריים קוורץ AT-החתך (O 14 מ"מ) עם תדר בסיסי של ≈ 5 מגה-הרץ. שטיפת מדרגות ולהוסיףition של פתרון מסומנים בדמויות של חלק נציגי תוצאות. ניסויי QCM-D יכולים להיות מתוארים כצעד אחר צעד בדרך החל בניקוי ושינוי פני השטח של החיישנים המשמשים אחריו recrystallization Slp1 ומאוחר יותר על האינטראקציה NP מתכת ומתכת.

1. ניקוי נהלים:
   1. לצייד את תאי נוזל עם בובות חיישן. משאבה לפחות 20 מיליליטר (כל לכל מודול) סוכן אלקליין נוזלי טיהור (ניקוי 2% במי ultrapure (V / V)) דרך מערכת QCM-D והצינור של. לאחר מכן לשאוב את הנפח פי חמישה (כל לכל מודול) של המים ultrapure באמצעות המערכת (קצב זרימה עד 300 μl / min). לבצע הניקוי על פי הפרוטוקול של היצרן.
   2. נקה את SiO ₂ החיישנים מחוץ לזרימת מודולים על ידי דגירה (לפחות 20 דקות) בפתרון של 2% SDS ולשטוף את החיישנים אחר כך מספר פעמים עם המים ultrapure ^61,62.
   3. ייבש את הגבישים עם comp המסונןressed אוויר ומניח אותם בתא ניקוי אוזון במשך 20 דקות ^63,64.
   4. חזור על תהליך הניקוי פעמיים כדי להסיר את כל התוכן האורגני.
   5. כדי להסיר מתכות כרוכים ממשטח החיישן לשטוף את החיישנים עם 1 M HNO _3. לאחר מכן, לבצע את כל שלבי השטיפה במי ultrapure.
2. שינוי פני שטח חיישן ידי פוליאלקטרוליטים:
   הערה: שינוי פני שטח יכול להיעשות גם בתוך (לזרום דרך הליך) או מחוץ לזרימת מודול (טכניקת LBL). בתוך ניסויים אלה את הדרך לשנות את המשטחים הבאים הייתה בשימוש.
   1. לשנות את החיישנים עם 3 גרם / L של שכבות PE לסירוגין של imine פוליאתילן (PEI, MW 25,000) וsulfonate פוליסטירן (PSS, MW 70,000) באמצעות ציפוי לטבול באמצעות טכניקת LBL ^40,41 תוארה קודם לכן למערכת בשימוש המיוחדת במאמרו של זור, מ 'ואח'. (2014) ^19.
   2. הנח את החיישנים בתוך PE-הפתרון המתאים בw העמוקצלחות ell דגירה אלה במשך 10 דקות ב RT.
   3. קח את החיישנים מPE-פתרון ולשטוף את החיישנים בין כל צעד ציפוי לטבול באינטנסיביות עם מים ultrapure.
      הערה: שינוי פני השטח החדש מורכב מלפחות שלוש מסתיים שכבת PE עם PEI מטען החשמלי חיובי.
   4. לאחר שינוי חיצוני זה למקם את החיישנים בתוך הזרימה מודול ולאזן את החיישנים על ידי שטיפה במי ultrapure לפני תחילת הניסויים.
3. Slp1 חד שכבתי Recrystallization:
   1. ממיסים Slp1 ב 4 M אוריאה להמרת פולימרים למונומרים.
   2. צנטריפוגה חלבוני monomerized ב15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להסיר agglomerates חלבון גדול יותר.
   3. מערבבים את supernatant Slp1 solubilized וcentrifuged עם חיץ recrystallization לריכוז חלבון סופי של 0.2 g / L.
      הערה: סידן בהתאם recrystallization של Slp1 (הרכבה עצמית) מתחיל על ידי תוספת של recמאגר rystallization. לכן, לשאוב את הפתרון המעורב עם קצב זרימה של 125 μl / דקה לחיישנים (ממוקם בתוך זרימת מודולים) באופן מיידי. הגיבוש מחדש נעשה לאחר ערכים יציבים של משמרות תדירות והפיזור התגלו בתוך ניסויי QCM-D.
   4. לאחר גיבוש מחדש חלבון מוצלח על גבי החיישנים-שונה PE בתוך זרימת מודולים לשטוף את החיישנים המצופים עם חיץ recrystallization או ultrapure waterintensively עם קצב זרימה של 125 μl / דקה עד ערכים יציבים של משמרות תדירות ופיזור אותרו.
      הערה: שינוי SiO ₂ משטח עם PE לניסויי ספיחה מאוחר יותר על מחקרי monolayer וAFM Slp1 היא דמיינה באיור 1.

איור 1. סכמטי עיצוב של שינוי פני שטח PE וSlp1 חד שכבתיציפוי; נתון זה שונה מזור, מ 'ואח'. (2015) ¹⁹ באישור שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. מתכת ומתכת NP אינטראקציה:
   הערה: הספיחה עם תמיסת מלח מתכת Au (HAuCl ₄ ∙ 3 H ₂ O) בוצעה בריכוזים של 1 מ"מ או 5 מ"מ ב- pH = 6.0 בפתרונות NaCl 0.9%. ספיחת Au-NP נעשתה עם Au-צירופים וחיים ב1.6 מ"מ חיץ תלת-נתרן-ציטראט על 5.0 pH ≈.
   1. לאחר ציפוי Slp1 מוצלח בזרימת מודולים, לשטוף את שכבת Slp1 הושגה באופן אינטנסיבי עם 0.9% NaCl פתרון עד ערכים יציבים של משמרות תדירות ופיזור אותרו.
   2. לשאוב את הפתרון מוכן מתכת (1 מ"מ) ופתרון NP לזרימת מודולים עם קצב זרימה של 125 μl / דקה ולעקוב אחר ספיחת המסה לSlשכבת P1. ספיחת מסה יכולה להיות מזוהה באופן ישיר על ידי מעקב משמרות התדירות מתייחסת למשוואת Sauerbrey (1 משוואה).
   3. לאחר שסיים את האינטראקציה המתכת והמתכת NP, לשטוף את השכבה עם חיץ חופשי מתכת / NP להסיר מתכות חלשות כבול או חלשות מצורפים או חלקיקים.
      הערה: איור של ההתקנה הניסיונית מוצג באיור 2.

איור 2. סכמטי עיצוב של התקנת QCM-D באמצעות זרימת מודול QFM 401 * ^66. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. נתונים הקלטה והערכה:
   1. רשום את המשמרות בתדירות בהרץ _(n Δf) ופיזור (ΔD _n) בתוך ניסויי QCM-D באמצעות QCM-D תוכנה ספציפית.
   2. להשתמש להערכת הרגישות ההמונית adsorbed המשוואה / מודל Sauerbrey (Δm) (1 משוואה) ^{65 66} שתקפות לסרטים דקים ונוקשה בשילוב ללא חיכוך על פני השטח החיישן להחיל n ^ה נימה. C הטווח (קבוע Sauerbrey) לMHz 5 בשימוש בחיישן קוורץ חתך הוא 17.7 ng ∙ הרץ ^-1 ∙ סנטימטר ^{-2 68.} לנוקשה, מופץ באופן שווה, ושכבות adsorbed דקות מספיק להשתמש 1 משוואה כקירוב טוב.
      
   3. בצע דוגמנות נוספת על פי מודל קלווין-Voigt תקף למולקולות viscoelastic ^68-71 עם התוכנה ספציפית היצרן ולהשוות את התוצאות עם זה של מודל Sauerbrey.
   4. לחישוב עובי השכבה ושימוש ספיחת מסהכפרמטר חשוב דוגמנות צפיפות שכבה של שכבת adsorbed של 1.35 גר '∙ סנטימטר ^-3 מתאים לערכים שתוארו קודם לכן לחלבונים S-שכבת ^72-75. השתמש באותו הערך לחישוב האינטראקציה מתכת עם השכבה חלבוניים.

7. מדידות AFM

1. לבצע מחקרים עם מסוגל באופן מלא AFM על מיקרוסקופ אופטי הפוך.
   1. תמונות רשומות AFM בנוזל באמצעות חיץ recrystallization או המים ultrapure ישירות על חיישני QCM-D המצופה.
   2. יש לשטוף את החיישנים במי ultrapure לאחר ניסויי QCM-D ולמקם אותם בתוך תא נוזל AFM. לכן, שימוש בתא נוזל סגור בהיקף כולל של כ 1.5 מיליליטר. לשמור על הטמפרטורה של נוזל תא הקבוע על 30 מעלות צלזיוס.
   3. השתמש בשלוחה עם תדר תהודה של ≈ 25 קילוהרץ במים ונוקשות של <0.1 N / m. התאם את מהירות הסריקה בין 2.5 ו -10 מיקרומטר / sec.
   4. קח תמונות במצב מגע דינמי ואילו שלוחה מתלהבת מpiezo בתדר התהודה שלו. לקבוע את המרחק של שלוחה אל פני השטח על ידי תנודת דעיכת ^76.
      הערה: תמונות גובה מוצגות עם z בקנה מידה תוך Z-ערכים מייצגים את הטופוגרפיה של פני השטח המדויקת. משרעת תמונות (פסאודו 3D) מוצגות ללא z בקנה המידה כי Z-ערכי המשרעת תלויות בפרמטרי סריקה ונושאות מידע מוגבל. ניתוח של תמונות נעשה באמצעות שלוש תוכנת הערכה שונה של ^77.

תוצאות

טיפוח של מיקרואורגניזמים וSlp1 אפיון

הנתונים שנרשמו צמיחת חיידקים מציין את סוף שלב הצמיחה המעריכית בסביבות 5 שעות. חקירות קודמות הראו כי Slp1 יכול להיות מבודדת מנקודה זו של קציר (4.36 גר '/ ביומסה הרטובה L (≈ 1.45 L / g (BDW)) עם תשואה מרבי ^19. אף על פי כן, אופטימיזציה של טיפוח באמצעות רכיבי תקשורת מוגדרים או ס...

דיון

בעבודה זו בחנה את הכריכה של Au לחלבוני S-שכבה נחקרה באמצעות שילוב של שיטות אנליטיות שונות. בפרט, מחייב Au הוא אטרקטיבי מאוד לא רק להתאוששות של Au ממי כרייה או פתרונות תהליך, אלא גם לבנייה של חומרים, למשל, משטחים חושיים. ללימודים של האינטראקציה Au (Au (III) וAu (0) -NPs) עם מושעה וrecrystallized monolayer של Slp1, היה לי החלבון להיות מבודד. לכן, מחקר זה הראה גידול המוצלח של זן חיידקי גרם חיובי ל sphaericus JG-B53 והבידוד של חלבון שכבת פני השטח Slp1. עם זאת, הטיפוח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ציוד ותוכנה
Bioreactor, Steam In Place מערכת פיילוט 70L	Applikon Biotechnology, הולנד	Z6X	כולל dO2, חיישני pH של Applikon Biotechnology ותוכנת BioXpert V2
צג ביומסה לא פולשני BugEye 2100	BugLab, קונקורד (קליפורניה), ארה"ב	Z9X	---
ספקטרומטר Ultrospec 1000	Amersham Pharmacia Biotech, בריטניה	80-2109-10	החברה כעת GE Healthcare Life Sciences
MiniStar מיקרו צנטריפוגה	VWR, גרמניה	521-2844	לצנטריפוגה של דגימות גידול
מיקרוסקופ מערכת מחקר BX-61	אולימפוס גרמניה LLC, גרמניה	037006	מיקרוסקופ בשילוב עם תוכנת הדמיה
Cell^P (גרסה 3.1)	אולימפוס פתרונות הדמיה רכה LLC, Mü nster, גרמניה	---	יחד עם מיקרוסקופ
Powerfuge מערכת הפרדת פיילוט סדרה 9010-S	Carr Centritech, פלורידה, ארה"ב	9010PLT	לקצירת ביומסה
T18 בסיסי Ultra Turrax	IKA Labortechnik, גרמניה	431-2601	להסרת דגלים והומוגניזציה של דגימה
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	728411	בשימוש בבידוד חלבון
מעבד נוזל גזירה גבוה נייד, M-110EH-30 פיילוט	מיקרופלואידיקה, מסצ'וסטס, ארה"ב	M110EH30K	משמש לקרע תאים
אלפא 1-4 LSC מייבש הקפאה	Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, גרמניה	102041	---
ספקטרופוטומטריית UV-VIS (NanoDrop 2000c)	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	91-ND-2000C-L	לקביעת חלבון ריכוז
תא אלקטרופורזה אנכית Mini-PROTEAN	Bio-Rad Laboratories GmbH, מינכן, גרמניה	165-3322	עבור SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000	Bio-Rad Laboratories GmbH, מינכן, גרמניה	1708030	משמש להדמיה של ג'ל SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000	PerkinElmer, Waltham (MA), ארה"ב	N8120536	לקביעת ריכוז
המתכתZetasizer Nano ZS	Malvern Instruments, ווסטרשייר בריטניה	ZEN3600	לקביעת גודל ננו-חלקיקים
התקן Q-Sense E4	Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה	QS-E4	הוזמן באמצעות תכנון קוונטי LOT (תוכנה כלולה בפלטפורמת E4)
Q-Soft 401 (הקלטת נתונים)	Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה
Q-Tools 3 (הערכת נתונים ומידול)	Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה
מודולי זרימת QCM-D QFM  401	Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה	QS-QFM401	הוזמן באמצעות עיצוב קוונטי LOT
QSX  303 SiO2 חיישני קוורץ פיזואלקטריים בחיתוך AT	Q-SENSE AB, גטבורג, שוודיה	QS-QSX303	הוזמן באמצעות LOT עיצוב קוונטי
תא ניקוי אוזון	Bioforce Nanoscience, איימס (IA), USA	QS-ESA006	הוזמן באמצעות LOT עיצוב קוונטי
מיקרוסקופ כוח אטומי MFP-3D Bio AFM	Asylum Research, סנטה ברברה (קליפורניה), ארה"ב	MFP-3DBio	תוכנת מדידות והדמיה AFM
Asylum Research AFM Software AR גרסה 120804+1223	Asylum Research, סנטה ברברה (קליפורניה), ארה"		ב---תוכנת הדמיה הכלולה ב-Cat. לא. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 תוכנה	תוכנת WaveMetrics, Inc., ארה"		ב---הדמיה הכלולה ב-Cat. לא. MFP-3DBio
BioHeater	Asylum Research, סנטה ברברה (קליפורניה), ארה"ב	מחמם ביולוגי	לדוגמא למדידות AFM
ביוליוור מיני שלוחה,  BL-AC40TS-C2	אולימפוס גרמניה LLC, גרמניה	BL-AC40TS-C2	שלוחה מועדפת למדידות AFM
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)	Nanotec Electronica S.L., ספרד	תוכנה חופשית	תוכנה לניתוח AFM
שם<	strong>חברה	מספר קטלוגי	הערות
חומרי ניקוי וציוד אחר
חומצה חומצית, 100%, p.A.	קארל רוט GmbH+CO. KG	3738.5	סכנה, נוזל ואדים דליקים וקורוזיביים. גורם לכוויות קשות בעור ולנזק לעיניים.
אנטי קצף 204	סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.	A6426	לדיכוי קצף
ברומופנול כחול, מלח נתרן	Sigma-Aldrich Co. LLC.	B5525
---Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3862.1	---
Deoxyribonuclease II מטחול חזיר	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D4138	טיפוסי IV , 2,000 - 6,000  יחידות קוניץ/מ"ג חלבון
אתנול, 95%	VWR, גרמניה	20827.467	סכנה,
גליצרין דליק, p.A.	קארל רוט GmbH+CO. KG	3783.1	---
גואנידין הידרוכלוריד (GuHCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	0037.1	---
Hellmanex III	Hellma GmbH & Co. KG	9-307-011-4-507	---
חומצה הידרוכלורית (HCl) (37%)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	4625.2	סכנה; מאכל, משמש להתאמת pH
Lysozyme מחלבון ביצת עוף	Sigma-Aldrich Co. LLC.	L6876	אבקה שעברה ליופיליזציה, חלבון = 90%, = 40,000 יחידות/מ"ג חלבון (סיגמא)
בוחש מגנטי עם חימום,  MR 3000K	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, גרמניה	504.10100.00	בוחש סטנדרטי במסגרת ניסוי
NB-Media DM180	Mast Diagnostica GmbH	121800	---
חומצה חנקתית (HNO3)CARL	ROTH GmbH+CO. KG	HN50.1	סכנה; מחמצן, קורוזיה
PageRuler סולם חלבון לא מוכתם	ThermoScientific-Pierce	26614	---
Poly (נתרן 4-סטירנסולפונאט) (PSS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	243051	מגה-וואט ממוצע ~ 70,000
פוליאתילנימין (PEI), מסועף	Sigma-Aldrich Co. LLC.	408727	אזהרה; מזיק, מגרה, מסוכן לסביבה; ממוצע Mw ~ 25,000
אשלגן פחמתי נטול מים (K2CO3)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	אזהרה 60108	;
מזיק ריבונוקלאז A מלבלב בקר	סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.	R5503	סוג I-AS, 50 - 100 יחידות קוניץ/מ"ג חלבון
נתרן אזיד (NaN3)	Merck KGaA	106688	סכנה; רעיל מאוד ומסוכן לסביבה
נתרן כלורי (NaCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3957.2	---
נתרן דודציל סולפט (SDS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	L-5750	סכנה;
נתרן הידרוקסיד רעיל (NaOH)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	6771.1	סכנה; קורוזיבי, משמש לוויסות pH בגידול והתאמת pH
Spectra/Por 6, קרום דיאליזה, MWCO 50,000	קארל רוט GmbH+CO. KG	1893.1	---
חומצה גופרתית (H2SO4)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	HN52.2	סכנה; קורוזיבי, משמש לוויסות pH בגידול
חומצה טאנית (C76H52O46)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	16201	---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)	CARL ROTH GmbH+CO. ק"ג	9090.2	---
טריטון X-100	קארל רוט GmbH+CO. KG	3051.3	אזהרה; מזיק, מסוכן לסביבה
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO צינורות אולטרה-סינון	Sartorius AG	VS0132	---
β-מרקפטואתנול	Sigma-Aldrich Co. LLC.	M6250	סכנה, רעיל