מאמר שיטה

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

DOI:

10.3791/53577

⸱

11 במרץ 2016

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, NYU School of Medicine, 2Harkness Eye Institute, Columbia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תומך ברשתית התחושתית, באמצעות מיחזור תוצרי לוואי של מחזור הראייה, המצטברים כליפופוסין. מוצרים אלה הם אוטו-פלואורסצנטיים וניתן לצלם אותם באופן איכותי in vivo. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה כמותית של ליפופוסין RPE באמצעות אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) ניצב לצד הרשתית התחושתית, ותומך בתפקוד מערכת הראייה. בין המשימות המבוצעות על ידי ה-RPE ניתן למנות פגוציטוזיס ועיבוד של מקטעי קולטני אור חיצוניים דרך אברונים שמקורם בליזוזום. תוצרי פירוק אלה, המאוחסנים ומכונים גרגירי ליפופוסין, מורכבים בחלקם מביסרטינואידים, בעלי ספקטרום ספיגת פלואורסצנציה ופליטה רחב הניתנים לזיהוי קליני כאוטופלואורסצנציה של פונדוס עם אופטלמוסקופיה לייזר סריקה קונפוקלית (cSLO). הצטברות ליפופוסין קשורה לעלייה בגיל, אך נמצאת גם בדפוסים שונים במחלות ניווניות נרכשות ותורשתיות של הרשתית. לפיכך, חקר דפוס ההצטברות שלו ומתאם בין דפוסים כאלה לשינויים ברשתית התחושתית, חיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה וההתקדמות של מחלת הרשתית. כאן, אנו מתארים טכניקה שבה משתמשת המעבדה שלנו ואחרים המשתמשת ב-cSLO על מנת לכמת את רמת הליפופוסין RPE בעיניים בריאות וחולות כאחד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תומך בפונקציה של הרשתית החושית באמצעות תהליכים רבים 1. גיל ניוון מקולרי הקשור (AMD) היא הסיבה החשובה ביותר של עיוורון חשוכת במדינות המתועשות ומאופיין שינויים הרשתית, כולל הפסד של פיגמנט, אובדן תפקוד וניוון. ב AMD וב הזדקנות נורמלית, הרשתית מצטברת פלורסנט, אברונים הנגזרים ליזוזום המכיל שברי קולטי אור phagocytosed, המכונים גרגרי lipofuscin. הצטברות של lipofuscin הרשתית כבר חשבתי להצביע חמצוני בתפקוד 1, אך מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המורפולוגיה הרשתית נותר תקין בעיני בני עם רמות lipofuscin גבוהה 2. עם זאת, דפוסים חריגים של הפצת lipofuscin, לאובדן מסוים של lipofuscin, הם סמנים מתועדים להתקדמות AMD ו- AMD, הוא היסטולוגית וקליני 3,4

למחזור פגוםלשיר של lipofuscin הרשתית גם הוכח להתרחש מחלות רשתית תורשתיות מסוימות. חולים שסובלים ממחלות Stargardt (STGD) לצבור lipofuscin ב הרשתית בגיל צעיר, בסופו של דבר לפתח אובדן חזון דומה לזה לראות AMD 5. ממצאים אלה הציעו הצטברות lipofuscin עצמו עשוי להיות רעיל ולנסוע רשתית תפקוד 6,7. עם זאת, מחקר הדמיה מפורט של נושאים עם STGD לאורך זמן לא לאשר מוקדים כי הצטברות lipofuscin הובילה לאובדן רשתית לאחר 8. לפיכך, למרות חריגות lipofuscin הם סמנים עבור מחלות רשתית, תפקיד לרעילות ישירה של lipofuscin לא הוכח.

הרשתית היא השכבה אחורית התא ביותר של הרשתית, אבל מייצרת את רוב אות ניאון מן הפונדוס העיני. הדור וזיהוי של autofluorescence (AF) נגזר הרשתית יכול להתבצע באמצעות אופטלמוסקופיה לייזר סריקה confocal (cSLO), המאפשר visualization של הפריסה המרחבית של AF הפונדוס. מחלות רשתית מסוימים להפגין דפוסים ייחודיים של הפונדוס AF, ועזרי הדמיה AF באבחון וניטור של תנאים אלה. למרות הדמית AF הסטנדרטית היא חשיבות קלינית, AF כמותית (qAF) הפך אמצעי חשוב בהערכת בריאות רשתית. אנחנו ואחרים פתחנו גישה סטנדרטית שיכול לקבוע qAF רמות מהימנות במקומות ספציפיים ברשתית 9. יש qAF יישומים פוטנציאליים באבחנה ובמעקב של תנאי רשתית, וייתכן שיש גם שירות ריבוד הפרוגנוזה והסיכון. בנוסף, יכול האבחון של qAF גם תואר הפרעות ברשתית מסוימות 10-12. כאן, אנו מספקים פרטים מבחינת צעד לביצוע הטכניקה שלנו מלווה בהדגמה ויזואלית של היישום שלה בהערכת עיני בריאות וחולות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: כל החולים שהשתתפו במחקרים אלה נעשו זאת בהתאם פיקוח ועדת הבדיקה מוסדיים מאושרים בבית הספר לרפואה באוניברסיטת ניו יורק לרפואה.

1. בחירת חולים והכנה ראשונית הדמיה

הערה: החומרים הבאים נדרשים: 0.5% פתרון עיניים tropicamide, 2.5% פתרון עיניים phenylephrine, cSLO מצויד טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית תחום ספקטרלי (SD-OCT), והתייחסות הקרינה הפנימית.

  1. לפני הדמיה, להגדיר cSLO כראוי לרכישת נתונים על פי הוראות היצרן.
  2. הר התייחסות ניאון פנימי cSLO. הערה: התייחסות הניאון הפנימית, כפי שנרכשה מהיצרן, שוכן טבעת מתכת ממוקמת ישירות מאחורי עדשת המצלמה. אם cSLO מיצרן אחר משמש, ייתכנו תצורה שונה מזו שבה מתוארתבפרוטוקול זה.
    1. על מנת להכניס את הפניה אל cSLO, לסובב את העדשה כדי להסיר אותו, להתיר את טבעת המתכת של המכונה, ולהחליף אותו עם טבעת מתכת חדשה המכילה את ההפניה.
      הערה: ההתייחסות ניאון פנימי חיוני הטכניקה qAF, שכן היא מאפשרת תיקון עבור וריאציה כוח לייזר ורווח / רגישות הגלאי.
  3. יש חולים שגויסו הדמיה לעבור בדיקת עיניים שיגרתית מורחבת ולקבל מידע רקע לגבי ההיסטוריה העינית בעבר ומצבים רפואיים בסיסיים שעשויות להתבטא עם ממצאים עיניים.
  4. מתרחבים תלמידים עם 0.5% tropicamide ו phenylephrine 2.5%. שלב קריטי: מתרחב תלמידי 6 מ"מ לפחות. הערה: זה חיוני למעבר רצוף של אור, ובכך להדמיה ומדידה אופטימליות של הפונדוס.
  5. הסנטר לפני הדמיה, למקם את המטופל כראוי על cSLO, עם נח על chinrest, המצח העומדים כנגד foreheaשאר ד, ו canthi לרוחב מיושר כהלכה עם המדדים.

2. הדמיה Baseline של הפונדוס Ocular

  1. ראשית, תמונה הפונדוס עם החזרה האינפרה אדומה קרוב (IR) אור (אורך גל של 820 ננומטר) על מנת לרכז את המצלמה מעל המקולה ולקבל מוקד מחוספס.
    1. עם חולה ממוקם כראוי, לשנות את הגדרת החומרה בלוח הבקרה למצב הדמית IR, מצלמת מיקום באופן ידני עד הפונדוס הוא בפוקוס מלא, ולקחת תמונה
    2. התאם את ההגדרה בלוח הבקרה כדי "IR-Oct", אשר משתמש טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית רפאים-דומיין (SD-OCT) בשילוב עם הדמית IR להעריך את המקולה עבור מחלה בסיסית.
    3. השתמש במדריכים הנוכחיים בחלון ההדמיה כדי כראוי להתמצא ב- OCT לדימוי IR של הפונדוס. כדי להשיג איכות SD-Oct אופטימלי, למקם את המצלמה כך את תמונת אוקטובר היא בשליש העליון של חלון ההדמיה שלה. רוכש לפחות sc קו אופקי אחדדרך הגומה ו פורש בתחום ההדמיה כולה.

3. הגדרת הדמיה qAF

  1. השתמש רכישת תמונה "מהירה". הערה: הגדרה זו מאפשרת לרכישת תמונה מהר, אשר מקטינה את הסיכון של אובדן אות בשל תנועת מטופל וסתימה וכתוצאה מכך אור על ידי הקשתית או עפעפיים.
  2. השתמש "Mean של 9" מסגרות. הערה: הגדרה זו מאפשרת צילום מהיר, רצוף של 9 מסגרות תמונה, אשר יכול להיות מאוחר "ממוצעים" כדי להפחית את הרעש חפץ (ראה להלן).
  3. השתמש "30 x 30 מעלות" שדה. הערה: זה מתייחס המעלות של האזור ברשתית שנתפס במהלך רכישת תמונה.
  4. לפני ההדמיה, להזהיר המטופל על האור הכחול, כמו זה יכול להיות מדאיג בהתחלה.
  5. הפעל את מצב AF וליישר ציר מצלמה כך המסך הוא מקסימאלי "מלא" עם AF הפונדוס (מחשיך מינימאלי של הצדדים ופינות של התמונה).
    1. אם h החולהקושי ave לסבול את האור הכחול הבהיר, להתחיל הדמיה עם המצלמה רחוקה מהעין ולאחר מכן להביא את המצלמה באיטיות כלפי המטופל עד הפונדוס הוא לעיני.
      שלב קריטי: אם אור הנכנס לתוך או לצאת מן העין חסומה, ירד האות תגרום. ירידה מרוכזת גלויה כמו המחשיך סימטרי של צד תמונה או בפינה. הפסד של האות כללית אפשר לראות כאשר תנועות עיניים לבד לחסום מעבר האור.
  6. יישר את המצלמה כך את אות AF היא ברמה הגבוהה ביותר לאורך כל השדה. כוון אות מקסימלי ולא תמונה חדה, אולם הם פחות או לתאם. התאם את מיקוד המצלמה על ידי הזזת cSLO כדי לשנות את מיקום המצלמה באופן ידני או עם ג'ויסטיק האופתלמוסקופ.
  7. התאם את הרגישות / רווח כך AF הפונדוס גלוי בקלות, אך להימנע הצפת יתר. במהלך רכישת התמונה, בצבע הפיקסלים הנראים בשני ההתייחסות הפנימית (הממוקם בחלק העליון שלתמונה) או הפונדוס מצביע הצפת יתר ובכך פסד של אות.

4. Image Acquisition

הערה: שלב קריטי: המטרה ברכישת תמונה צריכה להיות כדי להשיג 2 ערימות תמונה 9 מסגרת באיכות גבוהה בכל הפעלה לשלוט על השתנות בין תמונות בתוך מושב. לאחר למקם מחדש את החולה ואת המצלמה, לקבל מושב שני של שתי תמונות להעריך ובקרת השתנות. כל התמונות בסופו של דבר להיות מכוילות על ההתייחסות הפנימית (כמתואר להלן).

  1. לרכוש תמונות רק אחרי לפחות 20 שניות של "הלבנה" (חשיפה מלאה של רשתית לאור AF) כדי למזער קליטת האור על ידי rhodopsin ברשתית החושית 9.
    1. השתמש את התקופה הזו כדי לייעל מצלמת יישור, מוקד ורגישות.
  2. יש הנושאים למצמץ לפני כל רכישת התמונה כסרט מדמיע טרי משפר את איכות האות.
  3. הימנע עפעפיים במישור של רכישה.
    הערה: זה עשוי להיות מועיל כדי עפעפיים לפתוח באופן ידני לחולים מאתגרים יותר. החוקרים ממליצים כעוזר מבצע משימה זו.
  4. מטב יישור לפני כל רכישת תמונה על מנת להבטיח כי האור אינו חסום על ידי איריס וכתוצאה מכך אות ירד.
    הערה: כפי התנועה לפחות קטין נפוצה מאוד, ממליצי מחברי התכנסות קנסה לפי צורך לפני כל רכישת תמונה. מנחים ועידוד המטופל תוך הדמית עזר תנועת ירידה. המחברים ממליצים גם להשתמש ברגל-הדוושה של המכונית כמו "כפתור הרכישה" על מנת להקטין הסחת דעת מפעיל.
  5. בצע בעיבוד תמונות פוסט על ידי חישוב "שביל" ערימת 9 המסגרת להגדיל את יחס אות לרעש. לחשב את הממוצע של ערימה באמצעות תוכנת cSLO ידי בחירת האפשרות לחשב את הממוצע.
    הערה: ייתכנו ערימות שבו מסגרות וחלקם לא באיכות אופטימלית (כלומר, לוקליזציה או להכליל ירד סיביחס gnal אל המסגרות האופטימלית), ולכן בזהירות לבדוק כל ערימה ולבטל את בחירת מסגרות לא טובות לפני החישוב של הממוצע.
    הערה: תמונות Mean עם יחס אות לרעש מקובל יכולות להיות מעובד מן 3 מסגרות לפחות. זה נורמלי הצדדים והפינות של כל תמונה יש אות נמוכה 20 מעלות המרכזיות בשל מגבלות בתוך cSLO עצם.
    1. אם התוכנה שואלת אם המפעיל רוצה לנרמל את הרמות האפורות (כלומר, למתוח את ההיסטוגרמה) בין 0 ל -255, בחר "לא". זה שומר על רמות אפורות ללא שינוי לניתוח.

ניתוח תמונה 5.

  1. ניתוח תמונות AF כפי שתואר לעיל באמצעות תוכנת ניתוח תמונה שפותחה עבור טכניקת qAF (איגור; 9). להלן תיאור קצר של ניתוח תמונה אופייני באמצעות תוכנה זו כלול להלן.
    1. טען את התוכנית qAF ב איגור לייבא תמונות (בפורמט bmp) מיוצא מןcSLO תוכנה עם יחס ממדים פיקסל 768 x 768 (פרמטר פלט ברירת מחדל).
    2. בחר את התמונה בתפריט הנפתח וליזום ניתוח.
    3. מיקום מחדש אינדיקטורים כיול על תמונה כזו כי "הכוונת" לשכב הגומה ואת "סוגר" הסמוכה לאתר בדיסק האופטי (אינדיקטורים אלה משמשים סולם ומקם את ROIs). כשהוא מוצב כראוי, להשתמש בתוכנת הנחיות אז לאכלס את התמונה עם ROIs ההיקפי סביב הגומה (ראה איורים 1, 2).
    4. בחר באפשרות ב איגור לכייל את הרמות האפורות הכוללות של כל תמונה לרמות נוכחים בהפנית הניאון הפנימית. הערה: שלב זה מאפשר כיול של גורמים הקשורים המכונה, כוללים רמת האפס האלקטרונית של כל תמונה וסרטון הגורם כיול התייחסות הפנימי של כל מכונה, כמו גם גורמים הקשורים לחולה, כולל גיל, רפרקציה עקמומיות קרנית.
      הערה: תוכנת הניתוח ולאחר מכן מציגה את r הקבועegions על התמונה תוצאתי וסך ערך qAF מודגם בכל אזור. ערכי qAF גם מוזנים באופן אוטומטי לפורמט גיליון אלקטרוני בחלון נפרד. "
    5. צור qAF "מפות חום" על ידי בחירה באפשרות בתוך ההנחיות הפקודות. כל תמונות הנתונים ניתן לייצא מתוכנת איגור בגיליון אלקטרוני של Excel על ידי בחירת האפשרויות המתאימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה זו שמשה ללמוד qAF בשני 13 ומחלות בריאות מדינות 10-12. בעיני בריא (איור 1), AF נפלט הרשתית מופץ יחסית אחיד לאורך כל (איור 1 א) הפונדוס. עוצמת מופחתת נתפסת באזור המקולה המרכזית בשל חסימת האור על ידי פיגמנט מקולרי, ועל הצדדים ואת הפינות של התמונה בשל אופטיקה של העין ואת המצלמה. כלי להופיע כהה וצריך להיות בפוקוס ברור בתמונות-רכשה גם. איור 1B מדגים ייצוג מפת חום המקביל רמות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפצת lipofuscin רשתית חריגה, אם רמות גבוהות או נמוך, הוא סמן רגיש של מחלת רשתית והיא קשורה בדרך כלל עם אובדן תפקוד רשתית חושי. כאן אנו מתארים יישום של qAF להערכת lipofuscin רשתית. התאגדות של התייחסות ניאון פנימית לתקן רגישות כוח גלאי ליזר משתנית 9 לצד טכניקת דימות הסטנדרטית שלנו מאפשר אלקטרוני כדי לכמת אמין של רמות AF. המטרה שלנו היא כי שיטה זו תסייע באבחון וניטור של מחלת רשתית, ובסופו של דבר בהערכת היעילות של התערבויות טיפוליות, כגון טיפול תרופתי או הגן. qAF עשוי גם לס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STA: ללא גילויים, JPG: ללא גילויים, RTS: יועץ, Ocata Therapeutics.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות משתפי פעולה שלנו, פרנסואה Delori, תומס בורק, וטוביאס Duncker.

לתשתיות למחקר: NIH / ניי R01 EY015520 (RTS, JPG), וקרנות בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון (RTB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Spectralis HRA + OCTהיידלברג הנדסה
0.5% תמיסתניתן להשתמש בכל מותג
2.5% תמיסתניתן להשתמש בכל מותג ניתן להשתמש
בהפניה פלואורסצנטית פנימיתהיידלברג הנדסה
IGOR Pro תוכנהWaveMetrics
עיניים טרופיקמיד עיניים פנילפרין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).
  2. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 4832-4841 (2014).
  3. Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 56, 3242-3252 (2015).
  4. Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).
  5. Weng, J., et al. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell. 98, 13-23 (1999).
  6. Holz, F. G., et al. Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin. Investigative ophthalmology & visual science. 40, 737-743 (1999).
  7. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1981-1989 (2000).
  8. Smith, R. T., et al. Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD. Investigative ophthalmology & visual science. 50, 3907-3914 (2009).
  9. Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 9379-9390 (2011).
  10. Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 2841-2852 (2014).
  11. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 1471-1482 (2014).
  12. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy. Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).
  13. Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 5684-5693 (2013).
  14. Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects. Investigative ophthalmology & visual science. 42, 1855-1866 (2001).
  15. Sparrow, J. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2812-2820 (2013).
  16. Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. American National Standards Institute. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Retinal Pigment EpitheliumConfocal Scanning Laser OphthalmoscopyLipofuscin QuantificationAge Related Macular DegenerationGeographic Atrophy AnalysisHigh Speed Image AcquisitionMean of 9 FramesInternal Fluorescent ReferencePupil Dilation Protocol

מאמרים קשורים