מאמר שיטה

תלת ממדי טכנולוגיה Biomimetic: רומן Biorubber יוצר מוגדרת מיקרו מאקרו בקנה מידה ארכיטקטורות ב הידרוג קולגן

DOI:

10.3791/53578

⸱

12 בפברואר 2016

 ,  , 
1Department of Surgery - Division of General Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Chemical Engineering, University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת ייצור ביולוגי חדשנית פותחה כדי להנדס מבנים תלת מימדיים הדומים לתכונות האדריכליות, הרכיבים והתכונות המכניות של רקמת in vivo. טכניקה זו כוללת חומר קורבן שפותח לאחרונה, גומי BSA, המעביר תכונות מרחביות מפורטות, ומשחזר את ארכיטקטורות in vivo של מגוון רחב של רקמות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיגומי רקמות לשחק תפקיד מכריע בתהליך התחדשות רקמות. הפיגום האידיאלי חייב למלא מספר דרישות כמו רכב ראוי שיש, מודולוס ממוקד, מאפיינים אדריכליים מוגדרים היטב. Biomaterials כי לשחזר את הארכיטקטורה הפנימית של רקמת in vivo הם חיוניים לחקר מחלות כמו גם כדי להקל על התחדשות של רקמות רכות איבד פגום. טכניקה biofabrication פותחה רומן המשלב מצב הדמיה אמנות, תלת ממדי (3D) הדפסה, ופעילות אנזימטית סלקטיבית כדי ליצור דור חדש של חומרים ביולוגיים למחקר ויישום קליני. החומר שפותח, גומי שור סרום אלבומין, הוא תגובה מוזרקת לתוך תבנית המקיימת תכונות גיאומטריות ספציפיות. חומר הקרבה זה מאפשר ההעברה הנאותה מאפיינים אדריכליים לחומר פיגום טבעי. אב הטיפוס כולל פיגום קולגן 3D עם ערוצי מ"מ 4 ו -3 כי represent ארכיטקטורה מסועפת. מאמר זה מדגיש את השימוש בטכניקת biofabrication זה ההדור של מבנים טבעיים. פרוטוקול זה מנצל תוכנה בעזרת מחשב (CAD) לייצר תבנית מוצקה אשר תהיה תגובה הזריק גומי BSA ואחריו העיכול אנזימטי של הגומי, עוזב המאפיינים האדריכליים שלה בתוך חומר הפיגום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתחום הנדסת רקמות היכולת לפברק פיגומי רקמות היא חיונית. פיגום רקמות מתאים יש מבנה 3D, מורכב מחומרים ביולוגיים, ומחקתי באדריכלות רקמות vivo כדי להקל צמיחת תאים ורקמות שיפוץ. פיגום זה חייב לאפשר הובלה של חומרים מזינים ו הרחקת פסולת 1-4. אחד מכשולים העיקרי בייצור של פיגומים אלה הם היכולת לשחזר תכונות גיאומטריות ספציפיות לחומר ביולוגי. כמה טכניקות biofabrication דווחו לשלוט בתכונות הגיאומטריות של פיגומים אלו, דוגמאות הם electrospinning 5-8, ממס ליהוק 9, stereolithography 10, ו 3D-הדפסת 11, בין יתר. טכניקות אלו נופלים במתן העברה קל יחסית של מאפיינים אדריכליים פנימיים וחיצוניים לשליטה, הם יקרים, מוגבלים על ידי רזולוצית printability שלהם ( > למשל, מד זרבובית, הגבלת חומר), או לדרוש טכניקות שלאחר ייצור הדורש תקופה ארוכה של הזמן לייצר פיגומי קיימא 12.

במערכות ייצור מסחריות רבות, יצירת חללים פנימיות, ערוצים, ותכונות מושגות באמצעות חול או חומרים נשלפים או הקרבה מתאימים אחרים. חלק המתכת או הפלסטיק נוצר סביב עובש החול, והפעם הוא הקרושה, בחול מוסר. ב הרבה באותו אופן, את הדור הבא של חומרים ביולוגיים צריך המקבילה biosand. לכן, גומי BSA פותח כתחליף biosand. גומי BSA הוא חומר שעוצבה זה מקרוב שמורכב אלבומין בסרום שור crosslinked עם glutaraldehyde. המטרה סופית הוא ליצור מחדש מאפיינים אדריכליים מסוימים לתוך פיגום קולגן מתכלה. המאפיינים של biorubber ההקרבה מקיימת נאמנות ממדים עם העובש של רקמה המקורית מתוארים.

התחת = "jove_content"> שילובים כמה ריכוזי BSA ו glutaraldehyde נבדקו באמצעות מגוון של ממיסים. חומר זה נוצר על ידי תגובה בין BSA ו glutaraldehyde. גומי BSA יכול להיות תגובה מוזרקת הגיאומטריות הסבוכות של תבניות רקמות. BSA Crosslinked הוא טריפסין יציב ולעכל בקלות על ידי האנזים בתנאי pH וטמפרטורה קל. לעומת זאת, סוג שלמים שאני קולגן הוא עמיד מאוד לעיכול טריפסין. תכונות אלו מהוונות להסיר את גומי BSA סלקטיבי עוזב את הקולגן מאחור. העבודה נוכחית כללה קביעת הפרמטרים האידיאליים צריכים להשיג עובש יציב שיכול לספק מאפיינים אדריכליים ספציפיים פיגום ביולוגי. התכונות הספציפיות אשר הוערכו כלל mixability, עיכול אנזים, נושאים עומס, ויכולת להיות תגובה מוזרקת לתוך תבנית שלילית. השילוב של BSA 30% ו -3% glutaraldehyde מילוי דרישות אלה. פרוטוקול זה מספק את necessהנחיות האר"י ליצור פיגומים תלת ממדי אלה. אב הטיפוס כולל פיגום קולגן המייצג ארכיטקטורת קנים עם יבוא אחד ושני ערוצי זרימה בקטרים ​​של 4 ו 3 מ"מ, בהתאמה. טכניקה זו יש פוטנציאל לחקות סביבות מיקרו מקרו של הרקמה של עניין. טכנולוגיה זו מספקת טכניקה מעשית לספק מאלפת גיאומטריות ספציפיות חומר מתכלה בתוך קל ומהיר יחסית עם איכות גבוהה, אשר יכול להיות מכוון לחקות את גמישות רקמות vivo ב ומאפיינים אחרים של הרקמה של עניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. לקבוע את אחוז המוצקים יצווה קולגן

  1. חלץ את הקולגן בעקבות הליך שפורסם בעבר 13. להפשיר מינימום של 20 מ"ל של קולגן. לקבוע את האחוז הראשוני של מוצקי הקולגן יצווה כדי לתפעל את ריכוז הקולגן הידרוג נוצר.
    1. חותכים שלוש חתיכות של נייר אלומיניום (כ- 6 x 6 ס"מ) ולעצב כל אחד כפי במחבת באמצעות בתחתית מבחנה 25 מ"ל. רשום את המשקל של כל מחבת.
    2. הוספת כמות קטנה של קולגן לכל מחבת ולהקליט את המשקל הכולל של סיר האלומיניום וקולגן. הוסף 0.5 - 0.8 גרם של קולגן על כל סיר אלומיניום.
      הערה: לאחר שלב זה, יש שלוש מחבתות רדיד אלומיניום וכל אחד צריך כמות קטנה של קולגן. הקפד לרשום את המשקל של כל מחבת אלומיניום ריקה (סה"כ 3) והמשקל של המחבת לאחר תוספת של קולגן.
    3. חשבתי את המשקל של קולגן בכל מחבת באמצעות following הנוסחה:
      קולגן משקל = פאן ומשקל קולגן - במשקל פאן
    4. מניחים שלוש מחבתות אלומיניום אשר מחזיקים את הקולגן בתנור ב 100 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    5. לאחר 24 שעות, להקליט את המשקל של כל מחבת אלומיניום קולגן מיובש.
    6. חשב את המשקל של קולגן מיובש באמצעות המשוואה הבאה:
      משקל קולגן מיובש = פאן ומשקל קולגן מיובש - במשקל פאן
    7. חישוב אחוזי מוצק במשך שלוש דגימות לקביעת ריכוז מוצק קולגן השתמשה בנוסחה הבאה:
      figure-protocol-1
    8. חשבתי את התוכן המוצק קולגן הממוצע של יצווה באמצעות האחוז המוצק קולגן לכל אחת משלוש הדגימות.
      הערה: קולגן אשר ישמשו מה שנשאר של קולגן התייבשות. אף אחד קולגן המיובש ישמש.
    9. לאחר קביעת אחוז קולגן המוצקה (iריכוז הקולגן nitial) של אצווה, להמשיך להשתמש קולגן hydrated הנותרים. השתמש מטר pH מכויל כדי להתאים את ה- pH של אצווה קולגן 3.
      1. הוספת כמויות קטנות (2-5 μl בכל פעם) של 12 N חומצה הידרוכלורית (HCl). שמור על קרח בכל עת. אל תוסיף את חומצה הידרוכלורית ישירות קולגן - להוסיף את החומצה על הצד של הצינור. לאחר הוספת חומצה, השתמש מרית לדחוף את החומצה על קולגן ובמהירות ומערבבים את התערובת.
    10. ברגע שהוא מגיע pH של 3, בואו הקולגן לשבת O / N ב 4 ° C.

2. הכנת גומי BSA

  1. הכן את אלבומין בסרום שור הפתרון (BSA) ביצוע הליך מפורט להלן.
    1. כן פתרון בופר פוספט 2x (PBS). הוסף שתי טבליות PBS ל -100 מ"ל של מים כדי להפוך 0.02 פתרון M PBS.
    2. שלב BSA עם 2x PBS ליצור פתרון BSA 30% באמצעות הליך מפורט להלן.
      1. לדוגמה, כדי לבצע BSA 30% עם 30 מ"ל של PBS 2x, השתמש 12.9 גרם של BSA. להוסיף 1/3 PBS 2x (למשל, 10 מ"ל) כדי בקבוקון עם בר ומערבבים. להוסיף 1/2 של BSA (למשל, 6.45 גרם BSA) אל הבקבוק בעזרת מרית, להרטיב את המומס יבש.
      2. חזור על תהליך זה של הוספת PBS ולאחר מכן BSA עד שכל המומס ואת ממס הוא בבקבוק. השתמש מרית להרטיב כל המומס. זה ייראה כמו תערובת של כמה נוזלי גושים. תן לזה לשבת במשך כ 30 דקות.
      3. ואז, להפוך את הבוחש על מחזור נמוך ולוודא שאין גושים סביב הבר ומערבב. זה צריך לקחת 90 ​​דקות כדי לקבל את הכל בתמיסה או שזה יכול להיות שמאל ערבוב O / N ב 4 ° C. לאחר המומס הוא כל מומס, מניחים את הפתרון בתוך מזרק 20 מ"ל ו כתרים עם מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר. לחץ על הבוכנה לגרש נוזל דרך המסנן ולאסוף הפתרון המעוקר צינור חדש. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. כן soluti glutaraldehyde 3%על ידי דילול פתרון glutaraldehyde 25% עם PBS 2x מסונן סטרילי. לדוגמה, במשך 10 מ"ל של תמיסת 3% Glutaraldehyde, השתמש 2 מ"ל של 25% glutaraldehyde ו -8 מ"ל של 2x PBS. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.

3. טיפול תבניות

הערה: אב הטיפוס המתואר במאמר זה משתמש חתיכת עובש Y נירוסטה בהתאמה אישית. העובש מכיל יבוא ושני ערוצי יצוא של 4 ו -3 מ"מ, בהתאמה. ראשית, תבניות נקיות, לרסס אותם עם שומן בלתי רווי, לעקר אותם. הכן את תבניות הנוהל מתוארות להלן.

  1. תבניות נירוסטה נקיות באמצעות sonicator בתדר של 35 קילוהרץ. מניחים את התבניות ב sonicator לצלול אותם עם מים וקרח. שמור את התבניות קרות בכל עת בעוד sonicator פועל. הפעל את sonicator עבור 2 תקופות של 90 דקות.
    1. לאחר כל התקופה, להשתמש במחט לוודא שאין המהותיות Luer לנעול נירוסטה או במחבר רז. השתמש במים וסבון כדי לנקות את כל פני השטח של שני הצדדים של התבניות. ודא שאין חסימה של הערוצים.
  2. מניחים את התבניות, ברגים, ומחבר מנעול Luer בתוך שקית החיטוי ו החיטוי זה.
  3. מלא את הבקבוק שמתחבר דרך חצי מרסס אוויר שבומן-חזיר זמין מסחרי (סוכן שחרור חומצת שומן מעורב). החזר את המכסה עם בקבוק כובע רגיל. מניח אותו בתוך שקית חיטוי ו חיטוי זה.
    הערה: לארד משמש כדי להקל על השחרור של החומר יהיה תגובה המוזרקת בהמשך (גומי BSA). אין להניח את המכסה בקבוק מרסס ב autoclave- זה יכול לגרום נזק לאטם פנימי.
  4. לחמם את השומן במשך 45 שניות או עד ברורה הנזילות שלה במיקרוגל. הבריגו את המכסה מרסס אוויר לבקבוק שומן. חבר את המכסה עם המרסס. צרף המרסס למקור האוויר על ספסל המעבדה. פתח את שסתום האוויר, ופתח את הפייה של המרסס עד שהוא מתחיל להרטיב את המשטחשל מגבת נייר.
  5. תרסיס שומן בניצב לפני השטח עובש עד פני השטח מכוסה במלואה. לאחר כל פיסת כבר מרוסס, למקם אותם בצלחת פטרי ולאטום אותו. מניחים את התבניות על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  6. המשך לעקר את התבניות ידי החשיפה פני לאור UV למשך 30 דקות. מניחים אותם בחזרה על 4 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להיות מוזרק התגובה.

4. הזרקת התגובה של גומי BSA

הערה: כל החומרים הפתרון צריך להיות לשמור על קור עד מוכן לשימוש כדי למנוע הגדרה מוקדמת של גומי BSA בשלבים הבאים.

  1. הכן את המנפק עבור מסירת גומי BSA אל תבניות ביצוע השלבים הבאים.
    1. לעקר את כל הרכיבים ערבוב (שני O טבעות, כובע מזרק, מזרק כפול, לערבב קצה, ו -4: מנפק 1) על ידי חשיפת אותם לאור UV למשך 30 דקות ב תגובת שרשרת פולימראז ברדס (PCR).
      הערה: מכסה מנוע PCR שמש בגלל tההליך שלו כרוך fixatives. כימיקלים אלה לא ניתן להשתמש ב למכסת מנוע תרבית תאים / רקמות בשל סיכון של חשיפה ורעילה לתאים. כל מכסה מנוע אחר המכיל אור UV יהיה מתאים.
    2. מניחים את הכובע טיפ על בעל פתרון.
    3. בצע את הערבוב וההזרקה בכל 4: יחס 1 של BSA: Glutaraldehyde. מוסיפים את BSA 30% לתא מזרק כפול אשר יספקו את הכמות הגבוהה ביותר של פתרון (זה ייקח בערך 4 מ"ל למלא). הקפד להשאיר מספיק מקום כדי למקם את טבעת O כדי למנוע גדותיו וזיהום של החדר הסמוך.
    4. הוסף פתרון glutaraldehyde 3% אל החדר השני (זה ייקח בערך 1 מ"ל כדי למלא). הקפד להשאיר מספיק מקום כדי למקם את טבעת O כדי למנוע גדותיו וזיהום של החדר הסמוך.
    5. יש להכניס את המזרק הכפול על המנפק. הטה את ההרכבה אנכית כך כובע המזרק הוא על העליונה. החזר את המכסה עם קצה הערבוב.
    6. Sc REW חלקי שני עובש הנירוסטה יחד.
    7. הנח את המכלול בתוך שקית חיטוי.
    8. למען הסר האוויר מנפק, להחזיק אותו במצב זקוף ובמהירות ללחוץ על הידית פעם אחת כדי לשחרר כמות קטנה של BSA מעורבב עם glutaraldehyde. ואז במהירות לצרף את מחבר מנעול Luer של עובש נירוסטה Y אל קצה המזרק.
    9. להחזיק את התבנית נירוסטה Y ביד שמאל ואת מנפק תערובת BSA-Glutaraldehyde מימין. חלופי כיסוי כל פליטה של ​​שמאל וימין של ערוצי היצוא ידי הלחיצה על הפליטה של ​​מכונת צדי שקית החיטוי לוודא החללים בתוך מלאי פתרון. ואז, במקום התבניות אופקיות ולהזריק שוב.
    10. לנתק את התבניות מן המנפק ומניח בצלחת 25 מ"מ פטרי.
    11. מניחים Parafilm ברחבי צלחת פטרי כדי למנוע התייבשות של גומי.
    12. מניחים את התבנית בתוך O מקרר 4 ° C / N.

= "Jove_title"> 5. התאמת ריכוז קולגן

הערה: קולגן יש לשמור על הקרח בכל עת במהלך התהליך.

  1. שנה את ריכוז הקולגן באמצעות האחוז המוצק קולגן.
    1. הפוך 10 מ"ל של קולגן 1.75% על ידי התאמת ריכוז הקולגן הראשונית עם מים קרים.
    2. באמצעות מד pH מכויל, להתאים את ה- pH ל 3 באמצעות 12 N חומצה הידרוכלורית. אל תוסיף את חומצה הידרוכלורית ישירות collagen- להוסיף את החומצה על הצד של הצינור. לאחר הוספת חומצה, השתמש מרית לדחוף לתוכו את החומצה קולגן ובמהירות ומערבבים את התערובת.
    3. לשקול 4 גרם של קולגן צינור חרוטי נפרד.
    4. צנטריפוגה קולגן כדי להסיר אוויר ב 4 ° C ו- 9343 XG במשך 20-30 דקות.
    5. UV לעקר את מכסה המנוע תרבית תאים עבור 30 דקות, ולהוסיף 14 μl של laminin על קולגן 4 מ"ל. זה יגרום ריכוז laminin סופי של 10 מיקרוגרם / μl. הערה: Laminin מספק sשלמות tructural, הדבקה, ומקדם תגובות הסלולר השונות.
    6. סובבו את UV PCR להדליק במשך 20-30 דקות לפני השימוש ברדס לעיקור.
    7. מניחים את הכובע מנעול Luer, לצרף מזרק 20 מ"ל, באתנול במשך שעות 2. לאחר מכן, לאפשר לו להתייבש ומניחים אותו לאור UV.
    8. גמא מקרין את קולגן עבור 8.6 דקות כדי להגיע ל -1,200 cGy.
      שים לב: בפעם יהיה תלוי הדעיכה של מקור צסיום. התאם את הזמן כדי להגיע לאותה המינון.

6.Casting קולגן על גומי BSA

  1. כדי לפלמר קולגן, השתמש 8: 1: 1 יחס (קולגן: HEPES: MEM). ההליך הבא מבוסס על גרם 4 ראשוניים של קולגן acidified (משלב 5.1.8).
    1. בצע פתרון 0.2 N HEPES במים, ולהתאים את ה- pH עד 9 על ידי הוספת כמויות קטנות (1-5 μl) של 1-5 M נתרן הידרוקסידי פתרון (NaOH). באמצעות מד pH מכויל, לפקח על ה- pH של התמיסה לאחר כל הוספה. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או keEP על הקרח.
    2. כבה את האור UV של מכסה המנוע בתרבית רקמה במשך 20-30 דקות כדי לעקר את מכסה המנוע.
    3. מלקחי חיטוי, מרית, אזמל עבור עיקור.
    4. מערבבים 1.5 מ"ל של 0.2 N HEPES (pH 9) ו -1.5 מ"ל של 10x MEM באמצעות מכסה המנוע בתרבית רקמה. הקפד לשמור את זה על הקרח מערבולת במשך 5 שניות לפני השימוש. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או ולשמור על הקרח.
    5. כדי לעקר את מכסה המנוע PCR, להדליק את האור UV במשך 30 דקות.
    6. מניחים צלחת 12 היטב מזרק 20 מ"ל ב -20 ° C למשך 10 דקות, או עד מוכן להמשיך. הערה: שמור את כל החומרי קר עד מוכנה לשימוש. הגידול בטמפרטורת גורם fibrillogenesis קולגן המוקדם.
    7. לרסס את כל הצינורות והצלחים היטב כי הם הולכים להיות בשכונה עם אתנול 70% ולתת להם להתייבש במשך עיקור. מניחים מזרק 20 מ"ל על קרח כדי לקרר לשימוש מאוחר יותר.
    8. ב למכסה המנוע PCR, לפתוח את תבניות נירוסטה לשחרר את הגומי BSA ו באמצעות אזמל, לחתוך את ערוצי הפליטה של ​​r BSAעובש ubber.
    9. מתחת למכסה מנוע PCR, לפתוח את צינורות קולגן סטרילי ולהוסיף 1 מיליליטר של פתרון HEPES-MEM (לוודא כי לפני לחילוץ פתרון HEPES-MEM, שזה מתערבב היטב ואין פיקדונות מוצקים).
    10. באמצעות מרית סטרילי, ביסודיות לערבב את הפתרון קולגן חיץ.
    11. סגור מערבולת אותו במהירות כדי להבטיח הידרוג'ל מעורב היטב.
    12. מעבירים מזרק 20 מ"ל קר.
    13. ביד אחת, החזק את גומי BSA בתוך הבאר, באמצעות אחרים, לוותר מחצית הפתרון הידרוג'ל קולגן על החלק התחתון של הבאר.
    14. באמצעות פינצטה סטרילית, להבטיח כי הקצוות יבוא ו יצוא גומי נוגעים בצידי היטב.
    15. יוצקים פתרון קולגן על גבי גומי עד מכוסה לחלוטין.
    16. ודא גומי BSA מושעה בתוך קולגן כי אין בועות, במיוחד ליד הקצוות של הגומי.
    17. מניחים את המכסה ועוטפים Parafilm ברחביהיקף של הבאר.
    18. שים בחממה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. השאירו את האור PCR UV על.
  2. לאחר פילמור של קולגן, UV crosslink הידרוג באמצעות ההליך הבא.
    הערה: crosslinking של קולגן ייעשה באמצעות מנגנון UV crosslinker שבו כמות האנרגיה יכול להיות נשלט.
    1. הפעל את crosslinker UV ולהשתמש בהגדרה אנרגיה כדי להקרין את התוף הריק עם 630,000 μJ / 2 ס"מ.
    2. הסר את הג'לים מן החממה.
    3. תרסיס ידיים עם אתנול, ו, בתוך החדר, להסיר את המכסה מהר ככל האפשר.
    4. סגור את קאמרית UV crosslink הידרוג על ידי בחירת הגדרה אנרגיה irradiating 630,000 μJ / 2 ס"מ.
    5. לאחר מחזור crosslinking, לכבות את האור UV על מכסה המנוע PCR
    6. תרסיס ידות עם אתנול ופתח את התא, הציב את המכסה במהירות החזרה אל צלחת היטב. הזז את הצלחת היטבאל מכסה המנוע PCR.
    7. באמצעות מרית סטרילי, בעדינות לשחרר ולהסיר את הג'ל מהבאר. תהפכו את הג'לים מתחת למכסה המנוע כדי crosslink התחתון של הידרוג'ל. חזור על שלב 6.2.3 ו 6.2.4.

7. עיכול אנזים של גומי BSA

  1. על מנת לקבל פיגום קולגן חלול, להסיר גומי BSA בצורה שאינו משפיע על הממדים המוטבעים הידרוג'ל. ההליך המתואר להלן.
    1. כבה את האור UV במשך 20-30 דקות כדי לעקר את מכסה המנוע בתרבית רקמה.
    2. בצע פתרון טריפסין 0.25% pH 7.8. לדוגמה, במשך 15 מ"ל מים, להוסיף 0.0376 גרם של טריפסין צינור חרוטי 50 מ"ל. התאם את ה- pH 7.8 ידי הוספת כמויות קטנות (2-5 μl) של 1 M NaCl. מניחים את הפתרון בתוך מזרק 20 מ"ל ו כתרים עם מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר. לחץ על הבוכנה לגרש נוזל דרך המסנן ולאסוף הפתרון סטרילי בתוך שפופרת חדשה.
    3. הפעל באמבט מים ולהגדיר את הטמפרטורה ל 30מעלות צלזיוס.
    4. אחרי 30 דקות, לכבות את האור UV. תרסיס אתנול על כל צינורות וחומרים אשר ישמשו בשכונה.
    5. מעבירים את הידרוג'ל קולגן מתחת למכסה המנוע ומכניסים צינור חרוטי נפרד.
    6. להוסיף סביב 3-5 מ"ל (רק מספיק כדי לכסות את הג'לים) של פתרון טריפסין 0.25% עם pH של 7.8 על צינור אחד.
    7. חותם את הצינורות עם Parafilm ו מערבולת בקלילות כ 1 דקות.
    8. מקום באמבט מים C 30 מעלות במשך 15-24 שעות. בעוד באמבט מים, מערבולת הג'לים קל לעתים קרובות עד גומי BSA כבר מעוכל או יוסר הידרוג'ל.
      הערה: על מנת לקבוע אם גומי BSA הוסר, או הגומי הוא צף הפתרון טריפסין או שיש חלקים שבורים. אסור שיהיו אזורים כהים חזותיים בתוך הידרוג'ל.
  2. כדי להבטיח שכל גומי טריפסין BSA הוסר מן הידרוג'ל, לשטוף אותו כמתואר להלן.
    1. הפעל את הו PCRד אור UV במשך 20-30 דקות.
    2. כן פתרון Mosconas. שלב אשלגן כלורי (KCl, 28.6 מ"מ), (3 NaHCO, 11.9 מ"מ), גלוקוז (9.4 מ"מ) ו- (4 לאא 2 PO, 0.08 מ"מ) במים. התאם ל- pH 7.4 עם 1 M NaOH או 12 פתרון M HCl. מניחים את הפתרון בתוך מזרק 20 מ"ל ולהשתמש במסנן מזרק של 0.20 מיקרומטר לעקר את הפתרון.
    3. תרסיס הכל עם אתנול לפני הצבת על מכסה המנוע ולאפשר אתנול להתייבש.
    4. פתח את צינור ולהעביר 5-10 מ"ל של תמיסת Mosconas סטרילי כדי צינור חרוטי 50 מ"ל חדש.
    5. מעבירים את הידרוג'ל קולגן אל צינור חרוטי המכיל את פתרון האנזים. ודא כי הידרוג'ל מכוסה כולו הפתרון. השאירו את הצינורית שייקר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    6. לשאוב את הפתרון Mosconas וחזור על שלב 7.2.5 פעמיים.
    7. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות מראה כי טכניקת biofabrication זו יעילה ביצירת פיגומי 3D שיכולים לחקות את הסידור המרחבי לראות רקמות vivo. המאפיינים אדריכליים הם פרמטרים חיוניים עבור יישום הנדסת רקמות, החלו למלא תפקיד מרכזי ביחסי גומלין תא vivo ב והפונקציונלי של הרקמה.

העקביות mixability של גומי BSA היה פרמטר חשוב בייצור גומי BSA כי היא הומוגנית, והוא מסוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofabrication הוא שדה רב תחומית ביותר שבו עקרונות הביולוגיה וההנדסה למזג ליצור בחומרים מורכבים המחקות רקמות הילידים. כדי להשיג זאת, יש צורך לפתח טכניקות להשתמש במידע שנאסף רקמות in vivo ולתרגמו פיגום חוץ גופית. בדרך זו, פלטפורמה יכולה להיות מהונדסת דומה המאפיינים האדריכליים, פונקציונליים, מכאניים של רקמת vivo. חומר הפיגומים האופטימלי צריך להחזיק מאפיינים מסוימים, כגון להיות ביולוגי, לחקות את התכונות המכאניות של הרקמות של עניין, להיות מסוגל שפלה נשלטה, מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH-NIDCR IRO1DE019355 (MJ Yost, PI) ו-NSF-EPSCoR (EPS-0903795).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגן מסוג Iקולגן המופק מעור עגל
חומצה הידרוקלורית (HCl)Sigma-Aldrich7647-01-0
תמיסת חיץ פוספט (טבליות PBS)MP BiomedicalU5378טבליה אחת ל-100 מ"ל מייצרת 1x PBS
אלבויום מסרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA9647
GlutaraldehydeSigma -AldrichG5882שדות שומן חזיר רעיל
3090
תבניותנטחנות באמצעות מכונת מיקרולוט
ערכת מברשת אווירCentral Pneumatic47791
קצה ערבוב למזרק כפולMedmixML2.5-16-LLMמערבל, DN2,5X16, 4:1 חום, טבעת
O קטנה למזרק כפולMedmixPPB-X05-04-02SMבוכנה B, 5 מ"ל, 4:1, PE טבעי
פקק מזרק כפול MedmixVLX002-SMכובע, 4:1/10:1, PE חום,
טבעת med Big O למזרק כפולMedmixPPA-X05-04-02SMבוכנה A, 5 מ"ל, 4:1
מזרק כפולMedmixSDL X05-04-50Mמזרק כפול, 5 מ"ל, 4:1
מתקן מזרק כפולMedmixDL05-0400M, 5 מ"ל, 4:1, רפואי,
רגיל3.6 מ"ג/מ"ל - מיצוי מעבדת USC
20 מ"ל מזרק Luer Lock TipBD302830
Luer Lock CapsFisherJGTCBLLX
HEPESSigma -AldrichH4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM)Life Technologies1143-030
TrypsinLife Technologies27250-018
UV Crosslinker ספקטרולין UVXLE1000
נתרן קלוריד (NaCl)פישרS271-10להכנת מוסקונאס
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא -אולדריץ'P5405-250להכנת מוסקונאס
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)פישרBP328-500להכנת מוסקונאס
גלוקוזסיגמא -AldrichG-8270להכנה מוסקונאס
נתרן פוספט דידסיק (NaH2PO4)Sigma-AldrichS-7907של Mosconas
למזרקיםקורנינג431224
נירוסטה להכנת מסנן סטרילי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
  2. Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
  3. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
  4. Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
  5. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
  6. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  7. Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
  8. Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
  9. Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
  10. Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
  11. Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
  12. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  13. Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
  14. Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
  15. Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
  16. Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
  17. Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
  18. Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
  20. Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
  21. Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
  22. Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
  23. Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723(2012).
  24. Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

asistred

מאמרים קשורים