המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.
המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.
היכולת של תאי CD4 T לבצע פונקציות מפעיל תלויה ההגירה המהירה ויעילה של תאים אלה ברקמות פריפריה מוסתות באמצעות מנגנון שטרם מוגדר. היישום של מיקרוסקופיה multiphoton לחקר מערכת החיסון מספק כלי למדוד את הדינמיקה של תגובה חיסונית בתוך רקמות ללא פגע. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multiphoton intravital לא פולשנית של תאים מסוג CD4 T בדרמיס האוזן העכבר מוסת. שימוש פלטפורמת הדמיה מותאם אישית צנתר ורידים מאפשר ההדמיה של דינמיקת תא CD4 T ב interstitium עורי, עם היכולת לחקור תאים אלה בזמן אמת באמצעות התוספת של חסימת נוגדנים לרכיבים מולקולריים מפתח המעורבים תנועתיות. מערכת זו מספקת יתרונות על פני הן במבחנת מודלים ונהלי הדמיה פולשנית כירורגית. הבנת מסלולים בשימוש על ידי תאים מסוג CD4 T עבור תנועתיות עשוי בסופו של דבר לספק תובנה בשיאפונקציה ג תאי CD4 T וכן בפתוגנזה של שתי המחלות והפתולוגיה אוטואימוניות מדלקות כרוניות.
תפקוד האפקטור של תאי CD4 T תלוי באופן קריטי ביכולתם להיכנס במהירות ולחצות מגוון רחב של רקמות היקפיות כדי לסקור נזק, לאתר מוקדי זיהום או לגרום לפתולוגיה מזיהום כרוני או אוטואימוני. בעוד שתהליכי הביות לאתרים מודלקים1-4 והאקסטרוואזציה5-7 מכלי הדם לרקמות אופיינו היטב, הגורמים המניעים ומווסתים את התנועתיות הבין-רקמית של תאי T נותרו לא מוגדרים. נדידת תאי T בסביבות תלת מימד מורכבות נחקרה במבחנה באמצעות שימוש במטריצות מלאכותיות8-10 או מכשירים מיקרופלואידיים11,12, אך אלה אינם מצליחים לסכם את הסביבה המורכבת והדינמית של מערכת in vivo. רק לאחרונה, עם הופעת הדמיה תוך-חיונית רב-צבעונית ברזולוציה גבוהה, ניתן לחקור את ההת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הנהלים הקשורים עכברים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת רוצ'סטר, ובוצע בהתאם קפדנית עם חוק צער בעלי-חיים ואת מדיניות השירות לבריאות הציבור על טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה מנוהל על ידי ה- National Institutes הבריאות, משרד הרווחה בחיות מעבדה.
1. הכנת תאי המפעיל CD4 T
הערה: עכברים DO11.10 TCR-מהונדס BALB / ג שדווקא להכיר פפטיד מ ovalbumin ביצת תרנגולת (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). מערכות TCR-מהונדסות אחרות ניתן להחליף, באמצעות הפפטיד מאותו המקור המתאים במקום pOVA ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
היכולת ללמוד תגובות חיסוניות באתרו מבלי לשנות את הסביבה החיסונית חיונית בלימוד אינטראקציות בזמן אמת של תאי מפעיל T עם רקמה דלקתית. הדמיה של הדרמיס האוזן ללא פגע על ידי פרוטוקול זה, המתואר באיור 1 א 'וב', מאפשרת ההדמיה של תאי מפעיל T שסומנו הועברו fluorescently ב interstitium עורי. הליך זה יגרום גם ברזולוציה גבוהה (איור 1 ג) ו הזמן לשגות (האיור 1D, סרט 1)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מַשְׁמָעוּת
כאן אנו מציגים פרוטוקול מלא עבור להדמית 4D של עבירה, מפעיל-specific antigen תאי Th1 בדרמיס אוזן עכבר השלם. שיטה זו מספקת יתרונות על פני כמה שיטות הדמיה נוכחיות מכמה סיבות. על ידי הדמית הדרמיס אוזן הגחון, אנו מסוגלים לוותר על הסרת שיער כי נדרשה עבור פרוטוקולי הדמיה מעורבים אתרי עור אחרים. למרות מסירי שיער הם קלים בדרך כלל, הם הוכחו לגרום להפרעת מחסום העור 42, תהליך שיכול לעורר תגובה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
החוקרים אין לי מה לחשוף.
המחברים מודים אוניברסיטת מתקן Core רוצ'סטר multiphoton מיקרוסקופ לעזרה עם הדמיה לחיות. נתמך על ידי NIH AI072690 ו AI02851 כדי DJF; AI114036 כדי AG ו AI089079 כדי MGO.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברי BALB/c | מעבדות ג'קסון | 000651 | עכברים ששימשו גודלו בבית |
| DO11.10 עכברים | ג'קסון | 003303 | עכברים ששימשו גודלו בבית |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | חום מושבת ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות |
| משלים שרקנים | Cedarlane | CL-5000 | |
| נוגדן נגד CD8 | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | נוגדנים שמקורם ב |
| נוגדן היברידומה זה נגד MHC Class II | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | נוגדנים שמקורם ב |
| נוגדן היברידומה זה נגד CD24 | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | נוגדנים הנגזרים מ |
| נוגדן היברידומה זה נגד Thy1.2 | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | נוגדנים שמקורם ב היברידומה זו |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | נוגדן |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| נוגדן אנטי-CD62L ביוטיניל (שיבוט MEL-14) | BD | ||
| חרוזי הפרדה מגנטית סטרפטווידין | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS עמודת הפרדה | Miltenyi | 130-042-401 | |
| רקומביננטי אנושי IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| עכבר רקומביננטי IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| עכבר רקומביננטי IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| נוגדן נגד IFNg (שיבוט XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| נוגדן נגד IL-4 (שיבוט 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | פישר | 15303641 | |
| L-גלוטמין | פישר | 15323671 | |
| 2-מרקפטואתנול | Bio-Rad | 161-0710 | |
| פפטיד אובאלבומין | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH פפטיד | |
| סרום עגל עוברי (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | מושבת בחום ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות |
| צלחת תרבית 24 בארות | LPS | 3526 | CFSE |
| Life Technologies | C34554 | ||
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 מזרקי אינסולין, 1 מ"ל | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 מזרקי אינסולין, 300μ l | מזרקי BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB, 1 מ"ל | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 מחטים | BD | 305106 | |
| PE-10 צינורות רפואיים | BD | 427400 | |
| ציאנואקרילט דבק וטרינרי (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| צלחת חימום | WPI | 61830 | |
| בקר צלחת חימום | WPI | ATC-2000 | |
| בקר שמיכת מים | Gaymar | TP500 | כבר לא בייצור, שמיכת מים זמינה שווה ערך חדשה |
| יותר Kent Scientific | TP3E | ||
| Isoflurane וופורייזר | LEI Medical | Isotec 4 | כבר לא בייצור, שווה ערך חדש יותר |
| זמין איזופלורן | הנרי שיין | הוזמן דרך וטרינריה | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה | VWR | 20170-038 | שווה ערך מרובה |
| 3M | 1538-0 | ||
| איזופלורן אף | מובנה בבית, ראה איור 2 | ||
| פלטפורמת | מובנית בבית, ראה איור 2 | ||
| מלקחיים מעוקלים | WPI | 15915-G | מקבילים |
| מרוביםRoboz | RS-6802 | כיסויי זכוכית שווים מרובים | |
| VWR | ערך מרובות | ||
| שוות ערך גריז ואקום גבוה | פישר | 146355D | |
| ספוגיות | מספר מקבילות | ||
| למשימות | פישר | 34155 | |
| מיקרוסקופ זקוף מקביל מרובה Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM עם ספקטרה-פיזיקה MaiTai HP DeepSee Ti:Sa לייזר | אולימפוס | קריאה להצעת מחיר | |
| טבלה אופטית עם בקרת רטט | ניופורט | שיחה להצעת מחיר | |
| 25x NA 1.05 מטרת טבילה במים להדמיה מרובת פוטונים | אולימפוס | XLPLN25XWMP2 | |
| מחמם אובייקטיבי | Bioptechs | PN 150815 | |
| קוביית מסנן זיהוי | אולימפוס | FV10-MRVGR/XR | קובייה קניינית, ניתן להעריך ממסננים בודדים / דיכרואיקה |
| אנטי אינטגרין ובטא; 1 נוגדן (שיבוט hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | נטול אזיד, אנדוטוקסין נמוך |
| אנטי אינטגרין ובטא; 3 נוגדנים (שיבוט 2C9. G3) | eBioscience | 16-0611-82 | נטול אזיד, אנדוטוקסין נמוך |
| טקסס אדום דקסטרן (70,000 מגה-וואט) | Life Technologies | D-1830 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה