פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין ולבצע אלקטרופורזה של לכידת שבר נוזלי מקורי ברור (CN-GELFrEE), טכניקת הפרדה מקורית עבור מכלולים ביומולקולריים לא קוולנטיים וחלבונים מדגימות הטרוגניות התואמת לטכניקות ניתוח חלבונים שונות במורד הזרם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
CN-GELFrEE - Native נקה ג'ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קומפלקסי חלבונים לבצע המערה של תפקודים תאיים קריטיים. הבהרת הקישור לא קוולנטי שלהם ודינמיקה היא בעל חשיבות עליונה להבנת תפקידו של מתחמים במערכות ביולוגיות. בעוד האפיון הישיר של מכלולים וביומולקולרית הפך חשוב יותר ויותר בשנים האחרונות, טכניקות חלוקת יליד התואמות טכניקות ניתוח במורד זרם, כוללים ספקטרומטריית מסה, נחוצות כדי להרחיב עוד יותר את המחקרים הללו. עם זאת, השדה חסר שיטת הפרדת תפוקה גבוהה, רחבת היקף גבוהה התאוששות עבור מכלולי חלבון ילידים. כאן, אנו מציגים אלקטרופורזה מלכודת חלק נוזלי eluted ג'ל יליד ברורה (CN-GELFrEE), אשר היא שיטת הפרדת רומן אסיפות חלבון שאינו קוולנטיים. CN-GELFrEE ביצועי הפרדה הודגמו על ידי מתחמי פיצוח שחולצו מן לב עכבר. שברים נאספו מעל 2 hr ומוצגים להקות דיסקרטיות החל ~ 30 כדי 500 kDa. קוןדפוס עולה בקנה אחד של הגדלה רוחבי פס משקל מולקולרי נצפה, כל ~ 100 kDa מנעימים. יתר על כן, הניתוח מחדש הבא של שברי ילידים באמצעות SDS-PAGE הראה-משקל מולקולרי משמר בקנה אחד עם denaturation של קומפלקסי חלבונים. לכן, CN-GELFrEE הוכח להציע את היכולת לבצע הפרדות יליד ברזולוציה גבוהה גבוהה התאוששות על קומפלקסים חלבונים ממגוון משקל מולקולרי גדול, מתן שברים התואמות חלבון במורד הזרם מנתח.
מבוא
רוב התהליכים הביולוגיים קורה בתוך תא נחשבים להתבצע על ידי אסיפות חלבון ולא יחיד חלבונים 1. כתוצאה מכך, על מנת להבהיר את התפקיד ביולוגי הספציפי של למקטע חלבון בתא יש צורך להבין את יחסי הגומלין המבניים שלה עם חלבונים אחרים או הליגנדים מתחמים 2. עם זאת, לומדים חלבונים באופן מקורי, שמירת הקישור לא קוולנטי שלהם ופעילות, נותר מאתגר. אחד החסרונות של מחקרי חלבון יליד הוא טכניקת הפרדת יליד מתאימה התואמת טכניקות ניתוח חלבון במורד שונות. לכן, הריבית האחרונה טכניקות הפרדה מסוגלות מאפיינת מכלולים שאינם קוולנטיים של ביומולקולות גדלה 3 בחדות.
....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול וידאו זה מבוסס על פרסום הקשורים 9. ריאגנטים ספציפיים, חומרים וציוד דרוש כדי לבצע את כל השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מפורטים בסעיף החומרים. המתכונים ומידע להכנת כל הפתרונות הנדרשים מפורטים בטבלה 1.
1. מילוי מוצרי ג'לי Tube Gradient
- הרכבת מערכת היציקה
- באמצעות סכין או אזמל גילוח להבה מחומם, לחתוך טפטפת סרולוגיות 20 מ"ל יחד קטע מאונך 10 ס"מ ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
200 מיקרוגרם של חלבונים המופקים לבבות עכבר קרקע בהקפאה היו מופרדים באופן מקורי ל -14 שברים של 150 μl כל, בשיטת CN-GELFrEE בתוך שפופרת ג'ל 1-12% T. Aliquot של 10 μl של כל חלק היה לרוץ על ג'ל לוח CN-עמוד וכסף מוכתם. תיאור ברור של החלוקה והרזולוציה שהושגה עם חלוקת CN-GELFrEE מוצג איור 2 א. שברים נאספו למעלה משעתיים ואת assay ג'ל מציג דפוס עקבי של הגדלת משקל מולקולרי החל ~ 30 כדי 500 kDa. חלק מכיל מינים הנעים במסה מעל ~ 100.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
CN-GELFrEE נגזר יליד ברור (CN) מערכת חיץ עמוד המשתמשת תערובת של anionic ודטרגנטים ניטראלי כמולקולות מובילות 9 עבור חלוקת חלבון בעל משקל מולקולרי מבוססת באמצעות מטריקס ג'ל. היישום של CN-GELFrEE כדי לחלץ חלבון לב עכבר יליד שנוצר שברים מורכבים נמוכים עם רוחבי פס דיסקרטי תוך שמירת קישור לא קוולנטי של מכלולי biomolecular. השוואת שברים בין CN-PAGE ג'לים לוח SDS-PAGE צמצום הראתה משמרות מונית הממחישים אובדן הקישור לא קוולנטי בין מקרומולקולות את השברים ושבירים של אג".......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
קק קרן סיפקה מימון בנדיבות עבור עבודה זו. חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי מענק מחקר FAPERJ 100.039 / 2014 מהממשלה של ריו דה ז'נרו מדינה - ברזיל עבור RDM, מדע בלי מלגת גבולות 88888.075416 / 2013-00 מן לתיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה, תחת הממשלה של ברזיל, עבור HSS, את מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע תחת מספר המילגה 2014171659 עבור OSS, ועל ידי מענק מחקר CNPq 202,011 / 2012-7 מממשלת ברזיל עבור LHFDVPCH הוא הנמען של כימיה של החיים של אוניברסיטת Northwestern תהליכים מכון דוקטורים אחוות פרס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| 30% אקרילאמיד/תמיסת BIS, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | תמיסה זו היא נוירוטוקסית. |
| חומצה 6-אמינוהקסנואית (&אפסילון;-חומצה אמינוקפרואית) | סיגמא-אולדריץ' | A2504 | כימיקל זה הוא גורם מגרה. |
| אמוניום פרסולפט (APS) | פישר סיינטיפיק | 7727-54-0 | כימיקל זה דליק, רעיל וקורוזיבי. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | כימיקל זה הוא גורם מגרה. |
| אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA) | FLUKA | 3777 | כימיקל זה רעיל. |
| חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | כימיקל זה רעיל. |
| גליצרול | פישר סיינטיפיק | 56-81-5 | |
| אימידזול | סיגמא-אולדריץ' | I2399 | |
| חנקן נוזלי | כל ספק | n/a | אחסן חנקן נוזלי במיכלים המיועד לנוזלים בטמפרטורה נמוכה |
| לב עכבר | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-בוטנול | פישר סיינטיפיק | 71-36-3 | כימיקל זה דליק ורעיל. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| מעכב פרוטאז קוקטייל | תרמו פישר סיינטיפיק | 78430 | כימיקל זה רעיל. |
| נתרן דאוקסיכולט | סיגמא-אולדריץ' | 30970 | כימיקל זה הוא גורם מגרה. |
| סוכרוז | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | כימיקל דליק ומגרה. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| <חזק>ציוד | |||
| מערבל שיפוע | Hoefer | SG15 | |
| ערבוב מגנטי | לכל ספק | מוטות | |
| מגנטיים | כל ספק | n/a | קטן מספיק כדי להיכנס לתאי המיקסר של gradiet. |
| ספק כוח | Bio-Rad | 164-5056 | מתח עד 1,500 וולט |
| צנטריפוגה מקוררת | אפנדורף | 022622552 | עד 15,000 x גרם |
| <חזק>חומרים | |||
| 15 מ"ל צינור חרוטי | כל ספק | n/a | |
| 30 kDa-MWCO מסנן אולטרה צנטריפוגלי | Millipore | UFC503096 | |
| צינורות גמישים | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | באורך של כ -1 מ |
| ', כל ספק | n/a | ||
| שסתום נוזלי/אוויר, מתכתי או פלסטיק. (למשל שסתום ידית בקרת זרימת אוויר/מים באקווריום) | כל ספק | שסתומי | אקווריום n/a תואמים. |
| מרגמה ועלי | כל ספק | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T ג'ל לוח | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| צלחת פטרי | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| חלבון צינור קישור נמוך 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| סכין גילוח | IDL כלים | TE05-091C | |
| צינורות דיאליזה תאית מחודשת 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE ג'ל לוח לכל kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| פיפטות סרולוגיות (25 מ"ל) | VWR | 89130-900 | |
| (10 מ"ל) | כל ספק | לא ישים |
מקורות
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
