הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53619

⸱

24 בפברואר 2016

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנה פשוטה עבור ננו-חלקיקים מזהב משולב ליפוזומים צילום מגיבים עם חומרים זמינים מסחרית. הוא גם מראה כיצד למדוד את תהליך cavitation microbubble של ליפוזומים מסונתז על טיפול של לייזר פעמו.

תקציר

ננו-חלקיקים מגיבים לאור (NPs) זכו לתשומת לב ניכרת בגלל הפוטנציאל שלהם לספק שליטה מרחבית, זמנית ומינון על שחרור התרופה. עם זאת, רוב הטכנולוגיות הרלוונטיות עדיין בתהליך פיתוח ואינן ניתנות לרכישה על ידי מרפאות. כאן, אנו מתארים ייצור קל של NPs מגיבים לאור אלה עם NPs זהב זמינים מסחרית וליפוזומים מגיבים לחום. קלצין משמש כתרופת מודל להערכת יעילות האנקפסולציה והפרופיל הקינטי של השחרור בעת גירוי חום/אור. לבסוף, אנו מראים כי שחרור זה המופעל על ידי פוטו נובע מהפרעה בממברנה הנגרמת על ידי קוויטציה של מיקרו-בועות, שניתן למדוד באמצעות הידרופון.

מבוא

האפשרות להפעיל שחרור התרופה באמצעות גירויים חיצוניים היא דרך אטרקטיבית אפשר לשלוח את התרופות באופנת spatial-, temporal- והמינון שבשליטת עם ייחוד מוגדל ותופעות לוואי מינימליות. בין מגוון רחב של מערכות גירויים תגובה אקסוגניים (אור, השדה המגנטי, אולטרסאונד, קרינת מיקרוגל), פלטפורמות אור מופעלות הם אטרקטיביים, בשל אי-הפולשנות, פשטות והתאמה שלהם במרפאות. 1 מחקר מקיף בעשור האחרון ספק מגוון של טכנולוגיות פלטפורמה, כגון זהב אחראי קרוב אינפרא אדום-אור (Au) nanocages מצופה פולימרים חכמים, 2 חלקיקי צילום יציב, פולימריים (NPS) מצומדות עם סמים, 3 ו nanovesicles porphysome העצמית התאסף. 4 עם זאת , טכנולוגיות אלה הן עדיין בשלבים פרה-הקליני של פיתוח, ודורשות הבנה ואופטימיזציה ברורה של הפרמטרים המעורבים בתהליך של ייזום המשךלגלגל את שחרור התרופה.

אחת השיטות הפשוטות ביותר ונגיש להכנת מערכת כזו היא לשלב Au צירופים עם ליפוזומים תרמית רגיש 5,6, אשר שניהם זמינים באופן נרחב בשוק נחקרו בהרחבה בניסויים בבעלי חיים ואפילו קליניים. למרות המגבלה של הפעלת רקמות עמוק של Au צירופים באורך גל plasmonic שלהם, בהשוואה ננו האינפרה-אדום הקרוב המופעל Au (למשל, nanocages), מערכת זו עדיין טומן בחובו הבטחה גדולה כאשר נעשה שימוש בבעלי חיים קטנים או למסירה אקטואלי בבני אדם. 7 יש כמה מאמצים מוקדם שילוב Au צירופים עם ליפוזומים לשחרור אור מופעל. 8-11 בעוד רובם מתמקדים החידוש של חומרים, בעיות נגישות ויכולת רחבת צורך לטפל. יתר על כן, דיווחים על מנגנוני שחרור באמצעות nanocarriers אלה עדיין מוגבלים.

בזאת, ייצור של צילום-תגובהליפוזומים, נטען בו זמנית עם תרופות הידרופיליות Au צירופים תוארה. Calcein משמש כמתחם מודל כדי להעריך את יעילות אנקפסולציה ופרופיל שחרורו של המערכת. בנוסף, במערכת זו, האור נספג על ידי Au צירופים מתפוגג אל microenvironment שמסביב בצורה חומה, וכתוצאה מכך לעלייה בטמפרטורה המקומית. Microbubbles האוויר נוצר במהלך חימום הליזר ולגרום הפרעה מכאנית של ליפוזומים (איור 1). המנגנון של cavitation microbubble אושר על ידי מדידות hydrophone.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה

  1. 100 מ"ל נקי עגול צלוחיות התחתונה באמצעות Regia אקווה (1 חלק חומצה חנקתית מרוכזת (HNO 3) ו -3 חלקים של חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl)) ולשטוף את צלוחיות עם מים די. חיטוי הצלוחיות ולייבש אותם בתנור אוויר חם ב 100 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לעטוף ולאחסן את צלוחיות סטרילי עד השימוש.
  2. לעקר את סט מיני מכבש יד שנערך באמצעות אתנול 70%.
  3. הפעל את מאייד רוטרי להגדיר את הטמפרטורה של המים באמבטיה החמים מגדל קירור על 37 מעלות צלזיוס ו 4 ° C בהתאמה.
  4. הכן 60 מ"מ calcein פתרון המניות על ידי המסת 374 מ"ג של calcein ב 10 מ"ל של 0.1 מ"מ בופר פוספט (PBS) (pH 7.4). התאם את ה- pH ל -7.4 באמצעות 1 M נתרן הידרוקסידי פתרון (NaOH).

2. סינתזה של ליפוזומים

  1. הסר את הליפידים (1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-Palmitoyl-2-הידרוקסי SN -glycero-3-phosphochoקו (MPPC) ו 1, 2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanol-amine- N - [carboxy (פוליאתילן גליקול) -2000] (אמוניום מלח) (DSPE-PEG2000)) מהמקפיא (-20 ° C) להפשיר אותם RT.
  2. לשקול 15.9 מ"ג DPPC, 1.3 מ"ג MPPC, ו -2.8 מ"ג DSPE-PEG2000. ממיסים יחד אותם 2 מ"ל כלורופורם.
  3. מעבירים את הפתרון כלורופורם אל הבקבוק תחתית עגולה סטרילית להתאדות ממס באמצעות המאייד רוטרי תחת לחץ מופחת, כדי ליצור שכבת השומנים דק ויבש.
  4. מימה שכבת השומנים על 45 מעלות צלזיוס עם בתמיסה מימית 2 מ"ל במשך 30 דקות המכיל 1.95 מ"ל 60 מ"מ calcein מוכן בשלב 1.4 ו 50 μl Au צירופים (3.36 × 10 16 חלקיקים / מ"ל).
  5. טרום לחמם את בלוק חימום עד 45 מעלות צלזיוס. מקום מסנן הממברנה פוליקרבונט 200 ננומטר בין מוטות תמיכה המסננת ולהרכיב הסט המיני-המכבש. בדקו את הזליגה הפוטנציאלית עם מים די.
  6. מלאו את אחד של מזרקים עם 1 מ"ל של תמיסת ליפוזום משלב 2.4 ו extruדה המדגם על ידי העברת הפתרון המזרק בקצה השני של מיני-מכבש להרכיב. חזור 11 פעמים.
  7. הפעל את ליפוזומים המסונתז דרך טור desalting PD-10 כדי להסיר את צירופי Au חינם, שומני calcein באמצעות PBS כמו eluent על פי פרוטוקול של היצרן.
  8. אחסן את דגימות צינורות סטרילית ב 4 ° C ולהשתמש ב 2 ימים.

3. שחרור Calcein מ ליפוזומים עם חימום

  1. חשב את השומנים molarity של פתרון המניות על ידי הוספת את molarities של DPPC, MPPC, ו DSPE-PEG2000 בשלב 2.2. לדלל את הפתרון המניות ליפוזום ריכוז השומנים 5 מ"מ באמצעות חיץ 0.1 מ"מ PBS (pH 7.4). העברת דגימות צינור צנטריפוגות (2 מ"ל).
  2. מניחים את הצינור בתוך אמבט מים חמים, ומעלים את הטמפרטורה באופן הדרגתי מ -25 עד 70 מעלות צלזיוס. העלו את הטמפרטורה בשיעור של 1 ° C / min כאן.
  3. אסוף aliquots (10 μl) בנקודות טמפרטורה שונות (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 ו -70 מעלות צלזיוס).
  4. הוסף 10 μl של 2% טריטון X-100 2 מ"ל aliquot של פתרון liposomal לעכל את ליפוזומים במשך 10 דקות ב RT, וכדי להשיג את השחרור המלא של calcein.
  5. העבר 200 μl של פתרון liposomal לכל היטב microplate 96-היטב למדוד את עוצמת הקרינה של דגימות שנאספו באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי. אורכי גל העירור והפליטה של ​​calcein הם 480 ו 515 ננומטר, בהתאמה.
  6. אם ניקח את עוצמת הקרינה של דגימות מטופלים X-100 Triton 100 שחרור%, בחישוב אחוז של calcein שוחרר בכל נקודת זמן, באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-1
    Ft הוא עוצמת הקרינה של הפתרון בנקודת זמן נתונה. אני F ו- x F היא עוצמות קרינה התחלתי וסופי המנורמלת של הפתרון בהתאמה.

4. Calcein Reלחכור מן ליפוזומים עם ליזר פעם

  1. העבר פתרון liposome 100 μl קובט קוורץ ולמקם אותו בפמוט קובט. השתמש פעם Nd: YAG ליזר עם משך פעימה של 6 NSEC באורך גל 532 ננומטר כמקור אור. השתמש בפרמטרי הליזר הבא - שיעור ההחזרה: 1 רץ; צפיפות האנרגיה לייזר: 1 mJ / 2 ס"מ; Beam קוטר: 0.5 מ"מ.
  2. מדריך את קרן הלייזר collimated דרך קובט כך האור עובר דרך הפתרון liposome ולאסוף aliquots לאחר פולסים שונים.
  3. הוסף 10 μl של 2% טריטון X-100 2 מ"ל aliquot של פתרון liposomal לעכל את ליפוזומים במשך 10 דקות ב RT, וכדי להשיג את השחרור המלא של calcein.
  4. בהתחשב calcein הוא רגיש לאור ויכול להיות מולבן במהלך ניסוי הליזר, מראש למדוד את האפקט הלבן של ליזר פעם על פתרון calcein לנרמל את הנתונים מהשקת liposome.
    1. באופן ספציפי, לחשוף פתרון calcein (60 מ"מ) כדי wi לייזר פעמותדירות ה 1 הרץ עבור מספרים שונים דופקים (0, 25, 50 ו -100). למדוד את עוצמת הקרינה של calcein עם אורכי גל עירור ופליטה של ​​ננומטר 480 ו 515 בהתאמה, לפני ואחרי החשיפה לייזר.
    2. לחשב את הסכום של הלבנה (עוצמת הקרינה של calcein לפני עוצמת ליזר חשיפה / קרינה של calcein לאחר מספר הדופק הספציפי). השתמש גורם זה לנרמל את הערכים שהתקבלו דגימות liposome על ידי הכפלת עוצמת הקרינה של ליפוזומים עם הגורם.
  5. למדוד את עוצמת הקרינה של המדגם נאספו באמצעות קורא microplate הקרינה באורכי גל עירור ופליטה ב ננומטר 480 ו 515 בהתאמה.
  6. אם ניקח את עוצמת הקרינה של דגימות מטופלים X-100 Triton 100 שחרור%, בחישוב אחוז של calcein שוחרר בכל מספר הדופק, באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-2
    Ft הוא עוצמת הקרינה של פתרון לעבר מספר דופק ניתן לאחר נורמליזציה. אני F ו- x F היא עוצמות קרינה התחלתי וסופי המנורמלת של הפתרון בהתאמה.

מדידת 5. דחפים לחצו

  1. מקום 100 μl של מדגם בשקופית מיקרוסקופית להגדיר את מיקוד של ליזר על מדגם.
  2. טובלים hydrophone מחט (בקוטר 1 מ"מ ו -450 רגישות NV / Pa) לתוך התמיסה.
    זהירות: hydrophone אסור להיות מואר על ידי אור לייזר כדי למנוע את הנזק.
  3. מקרין את המדגם עם הליזר פעם עם מספרי דופק משתנה (0-100) ואנרגיה דופקת (20-160 μJ / דופק).
  4. רשום את אותות הלחץ באמצעות אוסצילוסקופ דיגיטלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ליפוזומים אלה נערכו על בסיס טכניקה הידרציה סרט דק קונבנציונלי עם DPPC, MPPC ו DSPE-PEG2000 ב טוחנת יחס של 86: 10: 4 או 7.95: 0.65:. 1.39 מ"ג / מ"ל 12 הגודל של Au צירופים היא קריטית כדי לקבוע את האור מרה יעילה לחום במהלך ניסוי עירור הליזר הבא. הקטן בגודל של Au NPS, הגבוהה הוא יעילות transducing. 13 לפיכך 5 ננומטר Au צירופים, דגימות הקטנות מהספק, נבחרו אנקפסולציה. במהלך הסינתזה, בינוני לחות המכיל Au NPS ו calcein התווס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הידרציה סרט דקה היא השיטה מקובלת להכנה ליפוזומים. ממסים אורגניים (כלורופורם במקרה זה) שמשו ראשון לפרק את השומנים ולאחר מכן מוסר מאייד רוטרי ב 37 ° C כדי ליצור סרט דק שומנים על הבקבוק. הסרט השומנים זו hydrated עם בתמיסה מימית המכילה 60 מ"מ calcein ו -5 ננומטר Au צירופים. במהלך תהליך הידרציה, הטמפרטורה נשמרה סביב 50 מעלות צלזיוס, הבקבוק היה נסער כל הזמן על ידי החלפה של הבקבוק. המפתח בשלב זה הוא הבחירה של הטמפרטורה שבה אידוי הידרציה בוצעו בהתאמה. הטמפרטורה המעבר לשלב (מ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים מוכרזים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות מחקר אקדמי Tier-1 על ידי סינגפור משרד החינוך (RG 64/12 ל CX) ו NTU-נורת 'ווסטרן המכון הננורפואה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)850355Pאבקה, יש לאחסן ב-20 מעלות; C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)855675Pאבקה, יש לאחסן ב-20 מעלות; C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום) (DSPE-PEG2000)אבקת Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)880120P, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
ננו-חלקיקי זהבסיגמא אולדריץ'752568-100 מ"ל5  חלקיקי ננומטר, מיוצבים ב-0.1  מ"מ PBS
סיגמאאולדריץ'C0875-10 גרם60  mM, pH 7.4 (מותאם באמצעות NaOH)
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)Sigma AldrichP54930.1 מ"מ, pH 7.4
מים מזוקקים כפוליםMillipore Milli-DI מערכת
Triton X100   סיגמא, מדעי החייםX-100כדי לשבש את הליפוזומים לחישוב האנקפסולציה הכוללת
Rotavapor   בוצ'י (שוויץ)R 210משמש להכנת ליפוזוזמה
אמבט חימוםבוצ'י (שוויץ)B 491משמש להכנת ליפוזוזמה
בקר ואקום   בוצ'י (שוויץ)V-850משמש להכנת ליפוסוזמה
משאבת ואקוםבוצ'י (שוויץ)V-700משמש להכנת ליפוזוזמה
אמבט מחזור עם בקר טמפרטורהPolyscienceמשמש להכנת ליפוזוזמה
מכלול מיני מכבש עם בלוק חימום Avanti Polar Lipids (אלבמה, ארה"ב)610000משמש לשחול של מזרקי ליפוזומים
, 1,000 & #956; lליפידים קוטביים אוונטי (אלבמה, ארה"ב)610017משמש לשחול של ליפוזומים
קרום מסנן פוליקרבונט, 200  nmWhatmann800281משמש לשחול של ליפוזומים
תמיכה במסנןשומנים קוטביים אוונטי (אלבמה, ארה"ב)610014משמש לשחול של ליפוזומים
PD 10 קולומנים מתפלים, Sephadex G-25 בינוניGE Healthcare, מדעי החיים17-0851-01משמש לטיהור הליפוזומים
צנטריפוגה   צנטריפוגות מעבדה סיגמא3K30משמשות לריכוז התמיסה הליפוזומלית 
רוטורסיגמא19777-Hמשמש לריכוז התמיסה הליפוזומלית 
Zetasizer   Nano ZS Malvernמשמש לקביעת גודל הליפוזום
וספקטרופוטומטר גלוי UVShimadzuUV-2450משמש למדידת ספיגת הדגימות
ספקטרופלואורומטר פלואורסצנטי   מכשירים מולקולרייםSpectraMax M5משמש למדידת פליטת הקרינה של הדגימות
Nd:YAG לייזרNewWave Research532 ננומטר; הספק מרבי: 17  מ.ג'י; רוחב: 406  nsec; משמש להקרנה מדגמית
HNR הידרופון ONDAHNR-1000קוטר 1 מ"מ ורגישות 450 nV/Pa, טווח תדרי עבודה תקין: 0.25-10  מגה-הרץ; כיול: 50  mV/בר; משמש למדידת האותות האקוסטיים
אוסצילוסקופ דיגיטליLECORY - Wave Runner 64Xi-Aתדר: 600 מגה-הרץ; קצב דגימה מקסימלי: 10  Gs/sec (בשני ערוצים); משמש להקלטת האותות האקוסטיים הנמדדים
טיהור מים

מקורות

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796(2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.