מאמר שיטה

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

DOI:

10.3791/53638

⸱

25 בינואר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר עיכול אנזימטי של עור עכבר במדיום עשיר בחומרים מזינים ואחריו הפרדת שיפוע לבידוד לויקוציטים. תאים הנגזרים כך יכולים לשמש ליישומים מגוונים במורד הזרם. זוהי אלטרנטיבה יעילה, חסכונית ומשופרת למכונות דיסוציאציה של רקמות ופרוטוקולי עיכול רקמות קשים יותר וטריפסין מבוססי דיספאז.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פירוק עור עכברים לתרחיף תא בודד חיוני לניתוח תאים במורד הזרם, כגון אפיון של תאים חיסוניים חודרים במודלים של מכרסמים של דלקת עור. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לעיכול עור עכבר בתמיסה עשירה בחומרים מזינים עם קולגנאז D, ואחריו הפרדה של תאים המטופויאטיים באמצעות שיפוע צפיפות לא רציף. ניתן להשתמש בתאים המתקבלים כך למחקרי מבחנה, העברה in vivo וניתוחים תאיים ומולקולריים אחרים במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מהווה אלטרנטיבה יעילה וחסכונית לדיסוציאטורים מכניים יקרים, עמודות הפרדה מיוחדות ושיטות עיכול קשות יותר המבוססות על טריפסין ודיספאזה, שעלולות לפגוע בכדאיות התאית או בצפיפות של חלבוני פני השטח הרלוונטיים לאפיון פנוטיפי או לתפקוד תאי. כפי שמוצג כאן בנתונים המייצגים שלנו, פרוטוקול זה ייצר תאים ברי קיימא מאוד, הכיל תת-קבוצות ספציפיות של תאים חיסוניים, ולא הייתה לו השפעה על שלמות חלבוני סמני פני השטח הנפוצים המשמשים בניתוח זרימה ציטומטרי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעיות עור הנעים בין דלקת עור ממגע, אקזמה, פסוריאזיס, צלוליטיס, זיהומים פטרייתיים ומורסות לסרטן העור שאינו מלנום נמצאו להיות בין 50 המחלות הנפוצות ביותר בעולם, והסיבה הרביעית המובילה העולמית של מחלות שאינן קטלניות בשנת 2010 1. בהתאם לכך, החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים שבבסיס מחלות עור שונים הוא אזור חיוני ופעיל של מחקר. מודלים של מכרסמים היו להפליא שימושיים בהבנה של מצבי עור דלקתיים כגון אטופיק דרמטיטיס 2, 3 פסוריאזיס, או זיהום Staphylococcus aureus 4. פרוטוקולים זולים, יעילים, ופשוט לעיכול אנזימטי של רקמת עור עכבר יכולים לספק הכנות של תאים שיכולים לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עור טוב יותר. הנה, שיטה פשוטה וחסכונית מתוארת להאנזימטית תקציר של עור עכבררקמה ובידוד של לויקוציטים הסתננות עור שיכול לשמש לתרבית תאים, in vivo העברת מאמצת, ניתוח תזרים cytometric ומיון או מחקרי ביטוי גנים. המטרה הכללית של הליך זה היא להכין השעיה תא בודדת של כדוריות דם לבנות-הסתננות עור עם כדאיות תא גבוהות תוך מזעור עלויות הקשורות בדרך ערכות מגיב מותאם אישית וdissociators המכני.

שיטות ניתוק רקמת עור קיימות 05-07 מאי לגרום לשלמות סמן כדאיות תא ומשטח נמוכה, או לדרוש ערכות אנזים מותאמות אישית ומכונות דיסוציאציה הרקמה יקרה 8-11. בעוד העיכול של רקמת עור אוזן עכבר הוא נפוץ למדי 12-13, לעכל רקמת עור keratinized מאוד (למשל מהאגף) יכול לגרום להכנות תא מזוהמות בכמויות גדולות של פסולת בלתי תאית. במחקר שנערך לאחרונה, זייד ועמיתים מתעכלים עור אגף עכבר על 90 דקות ב2.5 מ"ג / מיליליטר dispase, folloנישא ב -45 דק 'ב 3 מ"ג collagenase / מיליליטר 7. במחקר אחר, חוקרים אלה משמשים incubations מרובה עם עיכול שילוב של 2.5 שעות, כוללים השימוש בטריפסין / EDTA, collagenase III, וdispase 5. השימוש בטריפסין אינו מומלץ לעיכול עור האנזימטית, כטיפול עם טריפסין מיצרנים שונים הוכח להשפיע מדידה השלמות של חלבונים בתא שטח בתאי יונקים 14-15. בנוסף, dispase יכולה להיות השפעה משמעותית על יכולות שגשוג של תאי CD4 וCD8α T ולהשפיע שפע פני השטח של לפחות 20 מולקולות, כולל סמני הפעלת תא T הנפוץ כגון CD62L 16. פרוטוקולים אחרים משתמשים RPMI 1640 במדיום העיכול 6. עם זאת, הנוכחות של Mg 2 + Ca 2 + בRPMI יכולה לגרום לתא נרחב צבירה 17.

פרוטוקול אידיאלי לניתוק רקמה צריך לשאוף לכדאיויות תא גבוהות, נמוכותהרמות של צבירת תא, ונזק מינימאלי לתא חלבוני פני השטח. הכנות תא סטרומה הבלוטה לימפה באיכות גבוהה שהושגו עם פרוטוקולים המשתמשים incubations אנזים קצר יותר, 2 + תקשורת חופשית Ca 2 + וMg, ולהימנע מטריפסין וdispase 18. עם זאת, פרוטוקולים מסוג זה לא נקבעו לניתוק של עור עכבר כולו.

כאן, פרוטוקול מתואר לנתק, לבודד, ולהעשיר את כדוריות דם לבנות-הסתננות עור מעור אגף עכבר-תיגר אלרגן. בקצרה, עור נכרת הוא-מודגרות מראש במאוזן מלח הפתרון של האנק (HBSS) עם 10% בסרום שור עוברי עבור שעה 1 כדי לרכך את הרקמה לעיכול ולהסיר את כל רקמת עור או שומן עודף מת. זה ואחריו צעד עיכול אנזימטי 30 דקות עם 0.7 מ"ג / מ"ל collagenase ד Collagenase D יש השפעות מינימליות על צפיפות של סמנים פני תא, ואין כל השפעה על התפשטות תאי T במבחנה 16,18, שהופך אותומתאים מאוד ליישומים הכוללים אפיון של חלבוני פני השטח. בעקבות עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה הייתה משמשת להסרת תאי אפיתל ופסולת מהשעית התא הבודד ולהעשיר לתאי hematopoietic. חשוב לציין, בהליך זה ימנע ריאגנטים יקרים מבוסס עמודת תא מגנטי הפרדה וניתוק מכונות רקמה 8-11, וניתן לבצע עם ציוד וחומרים הנמצא במעבדת מחקר ביו-רפואית בסיסית. הנה פרוטוקול זה שימש כדי לבודד לויקוציטים מעור אגף פעמים תיגר שלוש עם oxazolone hapten (השור) בעכברי ND4 השוויצריים רגישים בעבר (המותאם מ 19). תאים נותחו באמצעות cytometry זרימה רב-פרמטרית. טכניקה זו הניבה השעיה תא עם מינימאלית פסולת ו> כדאיות 95% של לימפוציטים המבודד שנותחו על ידי זרימה רבת-פרמטרית cytometry למדוד את החדירה של לימפוציטים מסוג T ונויטרופילים לsk המושפעב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: נקבות עכברים ישנות 8-12 שבוע ND4 השוויצרי וובסטר, כמקובל שוכנו עם גישה חופשית למזון ומים, שמשו למחקרים אלה פרוטוקול הניסוי בשימוש (B13S1) אושר על ידי IACUC של מקאליסטר המכללה..

1. רגישות ואתגר עם Oxazolone

  1. יום 0
    1. הכן תא הרדמה על ידי הוספת 3 מיליליטר isoflurane למגבות סופגים ממוקמות מתחת רשת בתחתית צנצנת זכוכית עפעפי 4 L. לנקבות עכברי ND4 משמשים כאן, זמן בחדר הוא 30-60 שניות עד שהנושא הוא הרדים כראוי; לייעל ממשל הרדמה לשימוש בלחצן העכבר.
    2. לגלח בחזרה של כל עכבר הרדים ולאגף באמצעות גוזם שיער בעלי חיים.
  2. יום 1
    1. הפוך פתרון 2% של 4 ethoxymethylene-2-פניל-2-oxazolin-5-אחד (שור) לתוך אתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה.
    2. בקצרה להרדיםעכברים בהרדמה isoflurane כמתואר ב1.1.1 ולהחיל של 2% שור 100 μl למגולח בחזרה במספר יישומים הסידוריים של כ -20 μl כל אחד. חכה 5-10 שניות בין יישומים הסידוריים לפתרון לייבוש.
    3. לטפל כדי למנוע שפיכת 2% פתרון השור באזורים אחרים מאשר הגב, ולחכות לפתרון לייבוש בין יישומים.
  3. הימים 5-7
    1. הפוך פתרון 1% מ( שור) באתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה.
    2. בעדינות אך בתקיפות לשתק את העכבר בעורפו של בסיס הצוואר וזנב עם בטן כלפי מעלה וצוואר מעט מוטה כלפי מטה (בדומה לאחיזה לזריקת intraperitoneal) ולהחיל של 1% שור 100 μl לאגף המגולח במספר יישומים סידוריים ולקחת את הזמן כדי לייבש את העור לאחר מכן כפי שתואר לעיל.
    3. לעכברי שליטה, תחול רכב אתנול מוחלט 100 μl לפלאן המגולחk.

2. עור הצלע קציר

  1. להרדים עכברים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, ובלו האזור הרצוי של עור אגף (~ 25 מ"מ x 25 מ"מ של עור) עם מספריים כירורגיות 10 סנטימטרים בזהירות.
  2. באמצעות סכין נקי, חד כירורגית, לגרד ממנו את עודפי השומן ורקמת חיבור של עור האגף.
  3. מניחים 3 חתיכות של עור אגף מן 3 עכברים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר RT HBSS [עם פנול אדום, ללא סידן או מגנזיום, 5 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 10 מ"מ 4 (2-hydroxyethyl) -1- חומצת piperazineethanesulfonic (HEPES), ו -10% בסרום שור עוברי (FBS)].

כביסה רקמות 3. טרום עיכול

  1. צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס.
  2. וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף תקופת הדגירה.
  3. מסננים את התוכן של הצינור באמצעות מיקרומטר 70מסננת כדי לבטל את החיץ לשטוף ולאסוף את הרקמה. מסננת אחת ניתן לעשות שימוש חוזר בכל ההליך כולו בתוך קבוצת טיפול ביולוגית.
  4. בעזרת זוג המלקחיים, להעביר את עור האגף מן המסננת לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש המכיל 10 מיליליטר של תקשורת טרי, RT HBSS (המכיל EDTA, HEPES, וFBS כפי שתואר לעיל).
  5. עם זוג 12.5 סנטימטר של מספריים לנתח ניתוח השקוע לתוך הצינור, ברר בכל פיסת עור אגף כך שפיסת הרקמה הממוצעת היא כ 2.2 מ"מ x 2.2 מ"מ באזור.
  6. צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס.
  7. וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה

4. Collagenase עיכול של עור

  1. מסננים את התוכן של הצינור דרך מסננת 70 מיקרומטר, לאסוף ולהעביר את חתיכות עור אגף לתוך צינור חדש 50 מיליליטר חרוטי המכיל 10 מיליליטר fresh, תקשורת RT HBSS בתוספת 0.7 מ"ג / מיליליטר collagenase ד
  2. צינור מקום מכיל בינוני עיכול ושברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס.
  3. תוכן מערבולת של צינור במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה.
  4. תוכן מסנן של צינור דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש; לשמור על הזרימה דרך מכיל רקמה מתעכל וזורקים את המסננת ולאגף עור פסולת.
  5. לשטוף את הזרימה דרך 50 מיליליטר של תקשורת HBSS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 גרם, ולמזוג supernatant.

צנטריפוגה שיפוע 5. צפיפות

  1. בעזרת פיפטה סרולוגיות, להוסיף 3 מיליליטר 67% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות RT במלח 1X פוספט (PBS) לתוך צינור חרוטי חדש 15 מיליליטר עבור כל דגימה.
  2. Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר RT 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בHBSS עם פנול אדום.
  3. ג'ֶנטֶלמֶןשכבת ly 5 מיליליטר של 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות המכילה את התאים על גבי 67% מדגם תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בעזרת פיפטה סרולוגיות. הקפד להגדיר pipettor למהירות האיטית ביותר, ולמקם את פיפטה לאורך הקיר של צינור חרוטי. היזהר שלא ללחוץ, לשבש, או להפוך את השיפוע.
  4. ההאצה נקבע להגדרה הנמוכה ביותר, להתנתק הבלם, ו צנטריפוגות השיפוע ב931 XG במשך 20 דקות ב RT ולוודא כי צנטריפוגות היא מאוזנת.
  5. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את השיפוע מצנטריפוגות, ועדינות להעביר לספסל המעבדה מחזיק הצינור זקוף. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק 5 מיליליטר, להסיר את שכבת התאים בממשק של תקשורת 44% ו 67% שיפוע צפיפות צנטריפוגה והעברת צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. אם הממשק הוא לא נראה לעין, פשוט להסיר על 2 מיליליטר של נוזל בגבול 67% -44%.
  6. מלא את צינור חרוטי המכיל תאים מinterface עם 2% FBS בPBS קר כקרח 1X, תאי צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG, ולמזוג supernatant.
    הערה: זו הפעם הראשונה שיכולים להיות מקוררים התאים / שמרה קרה מאז צעדי עיכול הם על 37 מעלות צלזיוס וצעדי תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות הם ב RT. ניתן להשיג דילול 1 Trypan כחול ורוזנים ומידע כדאיות בנקודה זו: ניתן resuspended תאים ב1.

6. חסימה ומכתים לניתוח תזרים cytometric

  1. בלוק FcγRII / קולטנים שלישי בתאים כדי למנוע הכתמת נוגדן שאינו ספציפית. לניסויים שתוארו כאן, לעשות תערובות אדון הנוגדן בPBS עם 2% FBS המכיל 1: 100 דילול של נוגדן unconjugated נגד CD16 / 32 (2.4G2) כדי לאגד ולחסום קולטני FcγRII / III.
  2. דגירה תאים חסומים בתערובות אדון מתאימות של נוגדנים נגד CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), וLy-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), כמו גם כתם מבריק ויולט 510 חי / מת לזהות תאים מתים. להשתמש בכל הנוגדנים או בדילול מומלץ על ידי יצרנים או בעבר מותאם על ידי חוקרים. לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בכל הנוגדנים בשעת 1: 100 דילול.
  3. לשטוף את תאים וגלולים בμl 50 חיץ מכתים 1X PBS עם 2% FBS. שמור על קרח עד שניתן לרכוש נתוני הקרינה על cytometer זרימה.
    הערה: חשוב לי פרמטרים פיצוי מראש מותאמים עם רקמת הלימפה ואנטיגן שטח פני תא משותף (כמו CD4 או CD8) לפני הרכישה של נתוני הקרינה.
  4. כדי להגדיל את מספר התאים לזרימה במורד הזרם cytometry ניתוח, לרכוש נתונים מדגימות כל תאים מוכתמים.

7. ניתוח cytometry זרימת נתונים תוך שימוש בשיטות רגילה כדי להשיג את הצעדים המפורטים להלן

  1. ראשית, שער באזור הלימפוציטים של הפיזור קדימה(אזור) על ידי צד פיזור עלילה (אזור).
  2. לאחר מכן, בחר תאים בודדים באמצעות הפיזור קדימה (רוחב) על ידי צד פיזור (רוחב), כדי להימנע מניתוח כפילויות. זה גם יכול להיות מושלם עם גובה פיזור קדימה על ידי עלילת גובה פיזור צד.
  3. לאחר מכן, שער על שושלת (CD11b, CD11c, וCD45R / B220) -שלילי וCD3 חיובי אירועים, להוציא מקרופאגים, תאים דנדריטים, ותאי B, בהתאמה, ולתחום ניתוחים לתא תא T, אם המטרה היא, כפי שהוא כאן, על מנת להעריך חדירת תאי T.
  4. לאחר מכן, שער על תאי חיים שלא לכלול את הכתם החי / מת.
  5. לבסוף, שער על אוכלוסיית התא של עניין (ראה סעיף תוצאות נציג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Collagenase D טופל splenocytes מראה רמות דומות של α CD4 ו CD8 על תאי T בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופלה בתקשורת
ראשית, כל השפעות פוטנציאליות של collagenase D בשפע התדירות ופני שטח של סמני שושלת והפעלה בתת תא T הוערכו באמצעות רקמת הלימפה משנית כביקורת. השעיה של splenocytes התקבלה מעכברי ND4 ורחצה עבור שעה 1 עם תקשורת HBSS. לאחר מכן, מחצית התאים נתון של 0.7 מ"ג / מיליליטר Collagenas...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון שינויים בכדוריות דם לבנות עור-תושב במודלים של מכרסמים של מחלות עור כגון אטופיק דרמטיטיס או פסוריאזיס הוא חשוב להבנת קשרים בין מכניסטית זרם תא הדלקתי ופתולוגיה מחלה. כאן אנו מתארים טכניקה חסכונית לבודד את כדוריות דם לבנות מרקמת עור עם ציוד בסיסי שנמצא ברוב מעבדות מחקר ביו-רפואיות. טכניקה מהירה יחסית זה תמנע את השימוש במכונות רקמה יקרה ניתוק וצינורות מותאמים אישית וריאגנטים, עוזרת לשמר משאבים תוך מזעור ידיים על זמן על ספסל המעבדה. האנזימטית עדין לעכל והפרדת שיפוע רציפה להסיר א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש הסופרים לא כספיים או אחרים אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המכונים הלאומי לבריאות (NIH R15 NS067536-01A1 לDC), הלאומי וולוודיניה אגודה (הפרס לDC), ומקאליסטר המכללה תמכו ביצירה זו. CB קיבל מלגה מהתכנית בקמן חוקרי מקאליסטר המכללה, ממומנת על ידי ארנולד ומייבל בקמן הקרן. BTF וTM נתמכים על ידי JDRF 2-2011-662. אנו מודים לד"ר ג'ייסון Schenkel וד"ר יוליאנה לואיס לייעוץ טכני, וכל החברים הנוכחיים ולשעבר המעבדה Chatterjea לעזרה והתמיכה שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HBSS עם פנול אדום, ללא סידן, ללא מגנזיום, נוזלSigma Aldrich55021Cיש לשמור על סטרילי עד ליום השימוש.
HEPES, ≥ 99.5% (טיטרציה)Sigma AldrichH3375
EDTA תמיסת מלח דיסודיוםSigma AldrichE7889יש לשמור סטרילי עד ליום השימוש.
סרום בקר עוברי, USDA, מופעל בחום, Premium SelectMidSciS01520HIשמור על סטרילי עד יום השימוש.
פרקול, pH 8.5-9.5 (25° ג)סיגמא אולדריץ'P1644שמור על סטרילי. יש להפוך את פרקול לאיזוטוני עם PBS סטרילי 10X לפני השימוש.
ערכת גוזם משולבתקנט סיינטיפיקCL9990-1201 השתמש בגוזם הגדול יותר לגילוח האגף והגב.
4-אתוקסימתילן-2-פניל-2-אוקסזולין-5-אחדסיגמא אולדריץ'E0753-10Gמתמוססים ב-100% EtOH ב-50° C למשך 15 דקות על צלחת מסתובבת.
נוגדן מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161נוגדן המשמש לחסימת קשירת נוגדנים לא ספציפיים במהלך צביעת נוגדנים לזרימה ציטומטרית
אנטי-CD3ε-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטרית
אנטי-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטריה
אנטי-CD8&אלפא;-BV785 (53-6.7)BioLegend100749נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטרית
אנטי-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטריה
אנטי-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטרית
אנטי-CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971 נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטרית
אנטי-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטריה
אנטי-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטרית
אנטי-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטריה
אנטי-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)BioLegend108407נוגדן המשמש לצביעה של תאים לזרימה ציטומטריית זרימה
Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100צבע כדאיות לזרימה ציטומטריית
LSR FortessaBecton DickinsonN/Aמנתח תאים (18 פרמטרים)
קולגנאז D מ-Clostridium histolyticumRoche Applied Science11088858001Aliquot אנזים ליופילי ב-5 מ"ג/מ"ל ב-HBSS עם פנול אדום, ללא סידן וללא מגנזיום ל-1 מ"ל מינהל.  יש לאחסן מיד בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד שישה חודשים.
ND4 עכברים שוויצרייםHarlan0-32בני 8-12 שבועות; שוכנים באופן קונבנציונלי עם גישה חופשית למזון ומים ומשמשים בהתאם להנחיות IACUC של מכללת מקאליסטר.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029(2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311(2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803(2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673(2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Collagenase DCD45

מאמרים קשורים