מאמר שיטה

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

DOI:

10.3791/53692

⸱

2 בינואר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארים הפרוטוקולים הנוכחיים לשמירה על תאי אב אוטיים רב-פוטנטיים (iMOP) אימורטליים והתמיינות אוטית. תנאי תרבית וסמנים מולקולריים המצביעים על התמיינות לאפיתל חושי ונוירונים של גנגליון ספירלי (SGN) מודגשים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSC) או תאי גזע עובריים (ESC) לטיפולים בהחלפת תאים טומן בחובו הבטחה גדולה. מספר מגבלות, כולל תפוקות נמוכות ואוכלוסיות הטרוגניות של תאים ממוינים מעכבות את התקדמות הטיפולים בתאי גזע. קו תאי אב אוטי (iMOP) מוגבל גורל נוצר כדי להקל על התמיינות יעילה של מספר רב של תאי שיער פונקציונליים ונוירוני גנגליון ספירליים (SGN) לטיפולים להחלפת תאי אוזן פנימית. החל מתרביות מנותקות של תאי iMOP בודדים, תוארו פרוטוקולים המקדמים יציאה ממחזור התא והתמיינות על ידי נסיגה של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF). ירידה משמעותית בתאים המתרבים לאחר נסיגת bFGF אושרה באמצעות בדיקת התפשטות תאי EdU. במקביל לירידה בשגשוג, התמיינות מוצלחת הביאה לביטוי של סמנים מולקולריים ושינויים מורפולוגיים. צביעה חיסונית של Cdkn1b (p27KIP) ו-Cdh1 (E-cadherin) באוטוספירות שמקורן ב-iMOP שימשה כאינדיקטור להתמיינות לאפיתל תחושתי של האוזן הפנימית בעוד צביעה חיסונית של Cdkn1b ו-Tubb3 (β-טובולין עצבי) שימשה לזיהוי נוירונים שמקורם ב-iMOP. השימוש בתאי iMOP מספק כלי חשוב להבנת החלטות גורל התאים המתקבלות על ידי אבות נוירו-סנסוריים באוזן הפנימית ויסייע בפיתוח פרוטוקולים ליצירת מספר גדול של תאי שיער ו-SGN שמקורם ב-iPSC או ESC. שיטות אלו יאיצו את המאמצים ליצירת תאים אוטיים לטיפולים חלופיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איברי האוזן הפנימית, השבלול, הרחם, השק ושלוש תעלות חצי עגולות, מתווכים את יכולת השמיעה ושיווי המשקל. בתוך השבלול, תאי שיער ממירים צלילים לאותות חשמליים המועברים לתאי העצב של הגנגליון הספירלי (SGN). ה-SGNs יורים פוטנציאל פעולה כדי להפיץ אותות עצביים דרך מעגל השמיעה. מוטציות גנטיות, תרופות אוטוטוקסיות וחשיפה לצלילים חזקים תורמים למוות של תאי שיער ו-SGN הגורמים לאובדן שמיעה1-4. לאחר שאבדו, תאים אלה אינם מוחלפים. השימוש ב-iPSC ו-ESC ליצירת תאי שיער מתפתחים או SGNs טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפולים להחלפת תאי אוזן פנימית5-8. גל של התקדמות הראה שתאי גזע פלוריפוטנטיים ואבות אבות שמקורם באוזן הפנימית יכולים להתמיין לתאי שיער ו-SGNs בשלבים שונים של בגרות. ניתן להשתמש בתאי גזע עובריים של יונקים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) ליצירת תאי שיער פונקציונליים ו-SGNs9-11. תאי גזע ותאי אב שמקורם באוזן הפנימית של היונקים הוכחו גם כיוצרים תאי שיער ונוירונים בעלי תכונות של עמיתיהם התאיים in vivo 12-16.

שימוש באבות אוזניים שמקורם ב-iPSC או ESC כדי להחליף תאי שיער שאבדו ו-SGNs דורש התמיינות יעילה. התמיינות לא נכונה או המשך התפשטות של אבות מושתלים שמקורם בגבעול באוזן הפנימית עלולים להחמיר את תפקוד האוזן הפנימית ולהוות סיכון גידולי כגון היווצרות טרטומות באוזן הפנימית17. יש צורך ברור בפיתוח תנאי תרבות והבנת הבידול של אבות אוטיים. אסטרטגיה אחת בפיתוח שיטות אלה היא לסכם החלטות גורל תאים שהתקבלו על ידי אבות נוירו-חושיים במהלך התפתחות האוזן הפנימית. פרוטוקולים המונעים התפשטות ומכוונים אבות אוזניים לתאי שיער או SGNs יעזרו לשפר את הבטיחות כמו גם את היעילות של טיפולים חלופיים.

במהלך ההתפתחות, האוזן הפנימית מתחילה בעיבוי של אקטודרם פני השטח באזור מוגבל בין מעוינים 5 ו-6 כדי להפוך לפלאקוד האוטי. כאשר הפלאקוד האוטי פולש ליצירת אוטית, אוסף תאים באזור הקדמי של הכוס האוטית מוליד את התחום העצבי-חושי המוכשר (NSD), המכיל קודמים של תאי שיער ונוירונים של האוזן הפנימית18. מחקרי מיפוי גורל מעכברים, תרנגולות ודגי זברה המפתחים אוזן פנימית מצביעים על אוכלוסיות מרובות של אבות נוירו-חושיים המולידים את תאי השיער החושיים, המקיפים את התאים התומכים ונוירונים אוטיים19-22. גורם השעתוק של קבוצת הניידות הגבוהה, Sox2, היה מעורב במפרט תאי החישה ושימש כסמן לאבות האוזן הפנימית23,24. מוטציות היפומורפיות המפחיתות את רמות הביטוי של Sox2 באוזן הפנימית גורמות לאובדן תאי השיער, התאים התומכים ו-SGNs בשבלול25,26.

כדי לחקור תאי אב אוטיים העוברים החלטות גורל תאים, הוקם בעבר קו תאי אב אוטי רב-פוטנטי (iMOP) מוגבל גורל מ-Sox2 המבטא אבות שבלול. תאי iMOP הופקו במקור משבלול E12.5-13.5 עוברי ונדבקו ברטרו-וירוס c-Myc27. תאי iMOP יכולים להתרבות ללא הרף כתאים יוצרי מושבה המכונים אוטוספירות ויש להם את היכולת להתמיין לתאי שיער, תאים תומכים ו-SGNs27. הבנת היכולת של תאי iMOP להתמיין לשושלות אוזניות נפרדות מאפשרת יישום של ממצאים אלה ליצירת תאי שיער ו-SGNs שמקורם ב-iPSC או ESC. פרוטוקולי התמיינות יעילים יפתחו אפיקים חדשים לטיפולים בהחלפת תאים במחלות אוזן פנימית שאינן מתאימות לטיפולים קונבנציונליים. נושא מכריע ביצירת תאים אוטיים על ידי תרבית תאים במבחנה הוא סמני התמיינות המסייעים לקבוע אם תאים עוברים התמיינות. Cdkn1b (p27KIP) שימש באופן נרחב כסמן מוקדם להתמיינות בהתפתחות האוזן הפנימית, עם זאת, ביטוי של Cdkn1b בתאי iMOP וכיצד הוא מתאם להתמיינות לא טופל. במחקר זה מתוארים תנאי התרבות הנוכחיים וכיצד ביטוי Cdkn1b מתאם לסמנים אחרים של התמיינות iMOP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שמירה עצמית התחדשות בתאי IMOP

  1. הכן iMOP תקשורת ותרבות: DMEM / F12, תוספת 1X B27, 25 מיקרוגרם / מיליליטר וcarbenecillin 20 ng / ml bFGF. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP באמצעות ריאגנטים סטרילי. לחמם 49 מיליליטר של DMEM / F12 בחרוטי 50 מיליליטר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    1. תוספת ההפשרה 50X B27 ו- 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin aliquots-מעוקר מסנן במשך 5 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. להפשיר 100 מיקרוגרם aliquot / ml bFGF ב RT. הוסף 1 מיליליטר 50X B27, 10 μl של 100 מיקרוגרם / ml bFGF ו12.5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin לDMEM / F12.
  2. השתמש 3 מיליליטר של תקשורת בצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ לתאי iMOP culturing. הוסף מדיה טרי לתרבויות בכל יום אחר על ידי הכפלת הנפח של תקשורת. ודא כי הריכוז של bFGF לא לרדת מתחת 5 ng / ml.
    1. תאי iMOP תרבות במעלות צלזיוס 37 עם CO 2. תאי מעבר של 5% לאחר 5-7 ימים בתרבות כמפורט בשלבים הבאים. העברת תרבות ל15חרוטי מיליליטר באמצעות קצה פיפטה 10 מיליליטר.
  3. הפוך 1 mM EDTA בHBSS על ידי דילול 0.1 מיליליטר של 0.5 M EDTA pH 8.0 ל50 מיליליטר של HBSS. טרום החם mM EDTA 1 עשה בHBSS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  4. קציר תאים על ידי שיקוע כובד או צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות. ב RT. לשקיעה הכבידה, למקם את חרוטי 15 מיליליטר המכילים תרבויות בחממת 37 ° C 5 - 10 דקות. לאחר הזמן, להתבונן otospheres לאסוף בתחתית חרוטי 15 מיליליטר.
    הערה: כוח הצנטריפוגלי מוגזם יכולה לגרום נזק לתאים.
  5. זהירות לשאוב בילה מדיה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה מבלי להפריע תא גלולה. הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת 1 mM EDTA HBSS מראש חימם לתא גלולה. בעזרת פיפטה P1000, בעדינות pipet למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים. הנח חרוטי על 37 מעלות צלזיוס ודגירה של <5 דקות כדי להקל על ניתוק לתוך תאים בודדים.
  6. מערבולת בעדינות את פתרון התא כדי לקבוע אם otospheres הם ניתקו. אם לא Otoתחומים משקעים לתחתית חרוטי, התאים הם ניתקו. זמן דגירה עשוי להשתנות.
    הערה: דגירה ממושכת עם EDTA תגרום למות תא מוגזם.
  7. הסרת תאים מ -37 מעלות צלזיוס, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת לנטרל ולדלל את EDTA. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. לשאוב את דילול EDTA בעזרת פיפטה aspirating 2 מ"ל ולהוסיף 5 מיליליטר של 1X PBS לשטוף את התאים.
  8. ספין תאים למטה ב XG 200 במשך 5 דקות על RT ולשאוב את 1X PBS באמצעות פיפטה aspirating 2 מיליליטר. Resuspend התאים בעזרת פיפטה P1000 ב0.5 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים.
  9. ספירת תאים באמצעות מונה חלקיקי microfluidic עם הקלטות המתאימות 28. צלחת ומחוברות של תאי iMOP תכיל ~ 6 X10 6 תאים. לדלל תאי 1: 100 בתקשורת ולהוסיף 75 ul של פתרון נייד לתוך הקלטת לספירה. צלחת 1 x 10 6 תאים בצלחת 6 סנטימטר בcultu iMOPמחדש תקשורת (~ 1: 10 דילול). iMOPs מעבר כל 5 - 7 ימים.
    הערה: תאים היוצרים otospheres הגדול או לצרף לתחתית צלחת תרבית הרקמה יבדיל. תאים גם ימותו אם התרבויות הן מעל ומחוברות.

2. תאי IMOP הקפאה להפשרה

  1. הכן בינוני הקפאה סינתטית על ידי הפשרה וequilibrating הפתרון ל4 מעלות צלזיוס לפני תאי הקפאה.
  2. איסוף תאים מצלחת סנטימטר ומחוברות 6 תאי iMOP. השתמש פיפטה 10 מיליליטר ותאי העברה (~ 6 - 8 x 10 6 תאים) לחרוטים 15 מיליליטר.
  3. קציר תאים על ידי שיקוע כובד או צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. אם otospheres קטן, תאים לא יסתפקו בשקיעה הכבידה. אופציונאלי: ספירת תאים באמצעות צעד 1.9 כדי לקבוע כולל מספרים סלולריים.
  4. לשאוב בילה מדיה באמצעות 2ml aspirating פיפטה תוך השארת התא גלולה הרופפת מאחורי.
  5. להוסיף 0.25 מיליליטר של תקשורת הקפאה סינתטית לresuspend לסה"נLLS בצפיפות של ~ 5 x 10 x 5 3 10 6 תאים / מיליליטר. בעדינות פיפטה תאים עם טפטפת P1000. מעבירים את ההשעיה התא לבקבוקוני קריוגני בעזרת פיפטה P1000 עם 1 מיליליטר מסונן קצה.
  6. מניחים את הבקבוקונים במכל הקפאה נטולת אלכוהול ולמקם את מיכל ההקפאה ב -80 ° C כדי להפחית את מעלות צלזיוס בטמפרטורת 1 לדקה עד לטמפרטורה מגיעה -80 ° C.
  7. לאחסון לטווח הארוך של תאים, להעביר את הבקבוקונים לשלב האדים של טנק נוזל אחסון חנקן. להפשיר את תאים לתרבות, לאזן בקבוקון המכיל תאי קירור קפוא ב -80 ° C.
  8. תקשורת ותרבות iMOP טרום חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  9. להפשיר את הבקבוקון הקפוא במהירות על ידי מתערבל תחתית הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP מראש חימם לתאים מופשרים פעם גביש הקרח האחרון נעלם. העברת תאים לתוך חרוטי 15 מיליליטר ולהוסיף 4 מיליליטר נוסף של תקשורת בתרבות iMOP
  10. ספין שיתוף 15 מיליליטרnical במשך 5 דקות. ב XG 200 ולשאוב התקשורת בילתה. Resuspend התאים 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP ותאי צלחת בצלחת 6 סנטימטר. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 להרחבה.

3. ההתמיינות תאי IMOP לחושית epithelia

  1. הכן 50 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית iMOP: DMEM / F12, תוספת 1X B27, 25 מיקרוגרם / מיליליטר carbenecillin. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית iMOP. לחמם 49 מיליליטר של DMEM / F12 בחרוטי 50 מיליליטר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. תוספת ההפשרה 50X B27 ו- 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin aliquots במשך 5 דקות. באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מיליליטר 50X B27 ו12.5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin לDMEM / F12.
  2. תאים למסוק, לנתק, גלול ולספור חזרו על שלבים 1.4-1.9
  3. 1 x 10 6 תאי צלחת בצלחת 6 סנטימטר ביום -3 באמצעות iMOP תקשורת ותרבות. ביום 0, תרבויות העברה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לחרוטי 15 מיליליטר. לאסוף את Otoתחומים על ידי שקיעה הכבידה כאמור בשלב 1.6. לשאוב בילה מדיה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולהשאיר otospheres בתחתית חרוטי.
  4. בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית. העברת otospheres לצלחת 6 סנטימטר בעזרת פיפטה מיליליטר גדולה נשא 10.
    הערה: גז מכאני מpipetting הקשה יכול לנתק תאים מotospheres.
  5. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בידול אפיתל החושית הטרי לתרבויות בכל יום אחר. במידת צורך, ניתן לאסוף תאים על ידי שיקוע כובד ותקשורת הוחלף.
  6. לאסוף otospheres ביום 10 על ידי העברה לחרוטי 15 מ"ל ומאפשר לotospheres משקע כאמור בשלב 1.6.Aspirate התקשורת בילתה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולהשאיר otospheres באין מפריע.
  7. תקן otospheres ידי דוגרים בפורמלין 4% ב1X PBS במשך 15 דקות ב RT. הסר פתרון פורמלדהיד, לשטוף otospheres עם חיץ לשטוף (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני דוגרים בחסימת חיץ (1X PBS המכיל 10% עזים בסרום נורמלי ושל 0.1% Triton X-100) במשך שעה 1.
    1. החלף חיץ דגירה דגימות בחסימת חיץ עם נוגדן מדולל. דגירה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל 0.1% בכפוף Triton X-100 otosphere לimmunostaining 27. העברת otospheres ל1X PBS וotospheres מקום לתליית תקשורת בשקופית זכוכית בעזרת פיפטה P1000. שים coverslip על המדגם ולאפשר תקשורת הרכבה לייבוש על 4 מעלות צלזיוס.
  8. לרכוש תמונות epifluorescence באמצעות התקנת מיקרוסקופ הפוכה מצוידות במצלמת 16 ביט CCD וגם אוויר 20X 0.75 או אובייקטיבי טבילת שמן NA 40X 1.3. לאסוף הקרינה מערוצי צבע שונים באמצעות רשום (העירור ופליטה) אורכי גל: כחולה (377 ± 25 ננומטר / 447 ± 30 ננומטר), ירוק (475 ± 25 ננומטר / 540 ± 25 ננומטר), אדום (562 ± 20nm / ו625 20nm ±) ואינפרא-אדום (628 ± 20nm / ו692 ± 20ננומטר).

4. Assaying edu התאגדות

  1. ביום -3, צלחת 1 x 10 6 תאי iMOP בצלחת 6 סנטימטר. שלושה ימים לאחר מכן ביום 0, קציר, לנתק, גלול ולספור תאים על ידי חזרה על שלבי 1.4-1.9.
  2. צלחת 2.5 x 10 5 תאים בתקשורת ותרבות iMOP ו -5 5 תאים x10 בתקשורת בידול epithelia החושית בבארות שונות של צלחת 6 היטב.
  3. לקבוע את אחוז התאים בשלב S ידי התאגדות edu ביום 3 באמצעות assay התאגדות edu
    1. להוסיף מניית edu ישירות לתרבויות iMOP להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרומטר edu בתקשורת והתרבות.
    2. דגירה edu בתרבויות iMOP לשעה 2 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. קציר, תאים לנתק ולאסוף לחזור על שלבים 1.4-1.9. להוסיף בפורמלדהיד 4% ב1X PBS במשך 15 דקות. ב RT לתקן תאים. קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. הסר פתרון פורמלדהיד וproperly להיפטר.
    3. גרעיני תווית של תאים עם Hoechst ושולבו edu עם צבע-אזיד הקרינה ירוקה על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: כל שטיפות נעשות עם 1X PBS, תאי Tween 20. לשטוף 3 BSA% ו -0.1% עם 1X PBS פעמיים.
    4. תאי הר בשקופית באמצעות antifade מגיב ולמקם את זכוכית 1.5 כיסוי על המדגם. לרכוש תמונות ניאון של תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.

5. ההתמיינות נוירונים הנגזר IMOP

  1. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בידול העצבית: תקשורת Neurobasal, תוסף B27 1X, 2 מ"מ L- גלוטמין. בקבוק הפשרה של 50X B27 ו -200 המ"מ L- גלוטמין 37 ° C אמבט מים במשך 5 דקות. הוסף 1ml 50X B27 ו 0.5 מיליליטר 200 המ"מ L- גלוטמין ל48.5 מיליליטר של תקשורת Neurobasal.
  2. coverglass מעיל על ידי הצבת 12 מ"מ עגול 1.5 coverslips זכוכית בצלחת 10 סנטימטר סטרילי ולהוסיף 70% EtOH לצלחת לעיקור ולנקות את coverslips.
  3. בעדינות להתסיס את המפרץrslips כדי להבטיח שהם מכוסים באתנול. השאר את הצלחת במשך 10 דקות ב RT. יש לשטוף את coverslips 3 פעמים עם סטרילי 1X PBS לשטוף את אתנול נותר. יש לשטוף את coverslip פעם עם סטרילי H 2 0 לשטוף את שנותר 1X PBS.
  4. לשאוב H 2 0 באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולתת את coverslips יבש. לחשוף את coverslips לאור UV בברדס בתרבית רקמה במשך 15 דקות. חנות coverslips בסביבת סטרילית, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
  5. מניחים coverslip אחד 12 מ"מ עגול בכל טוב של צלחת 24 היטב. לנער את צלחת בעדינות כדי להבטיח שcoverslips לשכב על תחתית הבאר.
  6. הפשרת 2 מ"ג / מיליליטר poly-D- ליזין פתרון מניות ב RT ולדלל את ריכוז פולי-D ליזין / מיליליטר 10 מיקרוגרם ב1X PBS. להוסיף 0.25 מיליליטר של 10 פולי-D ליזין UG / מיליליטר לבארות. השאר את הצלחת בחממת 37 ° C עבור שעה 1.
  7. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם סטרילי 1X PBS. הפשרת 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות laminin ב RT ולדלל עד 10 מיקרוגרם / מ 'l ב1X PBS. להוסיף 0.25 מיליליטר של 10 מיקרוגרם laminin מיליליטר / עובד פתרון לטוב יחידה של מנה 24 רב גם. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה. לשאוב את פתרון laminin בעזרת פיפטה aspirating 2 מיליליטר.
  8. לשטוף את coverslip 3 פעמים עם 1X PBS על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1X PBS עם פיפטה P1000 והסרת PBS 1X ידי aspirating עם 2 מיליליטר aspirating פיפטה. השאר 1X PBS מלשטוף אחרון בבאר עד תאים מוכנים להיות מצופה. ליזום בידול עצבי על ידי קציר, מתנער וספירת תאים בשלבים 1 x 10 6 תאי 1.4-1.9.Plate בצלחת 6 סנטימטר ביום -3.
  9. ביום 0, קציר, לנתק ולספור תאים על ידי חזרה על 1.4-1.9. זרעים 1 x 10 5-1.5 x 10 5 תאי iMOP ל0.5 מיליליטר תקשורת עצבית בידול מחומם מראש לכל גם בצלחת רב גם 24. לשאוב ולהוסיף מדיה בידול עצבית מחוממת מראש לתרבויות בכל יום אחר.
  10. תקן נוירונים נגזר iMOP בפורמלין 4% במשך 15 דקות. אלא RT על פתרון פורמלדהיד 7. הסר יום, לשטוף נוירונים נגזר iMOP עם חיץ לשטוף (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני דוגרים בחסימת חיץ (1X PBS המכיל 10% עזים בסרום נורמלי ושל 0.1% Triton X-100) במשך שעה 1.
    1. החלף חיץ דגירה דגימות בחסימת חיץ עם נוגדן מדולל. דגירה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל טריטון X-100 תאים כפופים 0.1% לimmunostaining 27. שטוף את coverglass עם 1X PBS לפני הצבה על גבי מדיה הרכבה. לאפשר תקשורת ההרכבה לייבוש על 4 מעלות צלזיוס לפני רכישת תמונות epifluorescence כפי שמופיע בשלב 3.8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bFGF נסיגת ירידות הפצת נשק בתאי IMOP

כדי להקטין את יכולת השגשוג של תאי iMOP וליזום התמיינות של תאי iMOP, bFGF הוסר ממדפי התרבויות. כדי לוודא שנסיגת גורם גדילה יורדת התפשטות, התאגדות edu הועסקה כassay התפשטות. אחוז התאים ששולבו edu מotospheres תרבותי עם תקשורת ותרבות iMOP (המכיל bFGF) וotospheres תרבותי בתקשורת epithelia החושית (ללא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניטור תרבויות IMOP

פרוטוקול לשמירה על התחדשות עצמית וקידום הבידול של שורת תאי iMOP רומן מתואר ופורמטי ציפוי נוספים כלולים (טבלה 1). כמה שלבים קריטיים המסייעים בהרחבה והתמיינות של תאי iMOP שגרה הם ציינו. בדומה לתרביות תאי גזע pluripotent, יש תאי iMOP תיאורטי תוחלת חיים בלתי מוגדרת. כדי להבטיח שנשמרות שורות תאים כראוי, תרבויות iMOP מנוטרות באופן שיגרתי לכדאיויות תא, התחדשות עצמית ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה בחלקה על ידי קרן התרומות של יו"ר פיתוח הפקולטה של דאנקן וננסי מקמילן (K.Y.K.), מענק המחקר הביו-רפואי של בוש (K.Y.K.) ומענק פיתוח הפקולטה של ראטגרס (K.Y.K).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CoolCell LX מיכלי הקפאת תאים ללא אלכוהולBioCisionBCS-405
בקבוקונים קריוגניים (2 מ"ל) קורנינג430654
כיסוי זכוכית בעובי 1.5 (עגול 12 מ"מ)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Neurobasal MediumLife Technologies21103
פוספט חוצץ מלח (PBS) pH 7.4Life Technologies10010-023
האנק תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Life Technologies14025-092
תוסף B27 (50X) Serum FreeLife Technologies17504-044מאוחסן כ-1 מ"ל כמוסות
L-גלוטמין (200 מ"מ) Life Technologies25030-081מאוחסן כ-5 מ"ל כמוסות
Natural Mouse LamininLife Technologies23017-015מאוחסן כ-1 מ"ג/מ"ל כמוסות
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze Cryopreservation MediaLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-736מאוחסן כ-10 מ"ג/מ"ל 100 ומיקרו; l aliquots
Moxi Z מיני מונה תאים אוטומטיOrflo MXZ001
Moxi Z קלטת מסוג SOrflo MXC002
גורם גדילה פיברובלסטים עכבריים רקומביננטי, בסיסי (bFGF)Peprotech450-33מושעה ב-0.1% BSA ב-H20 ומאוחסן כ-20 מ"ג/מ"ל בכמות
פולי-D-ליזיןסיגמאP7886מושעה ב-1X PBS ומאוחסן כ-10 מ"ג/מ"ל 100 ומיקרו; l aliquots
קרבניצילין, מלח דיסודיוםThermo Fisher ScientificBP2648-1מושעה ב 10 מ"מ Hepes pH 7.4 ומאוחסן כ 100 מ"ג / מ"ל aliquots
5 מ"ל פיפט עטוף בנפרד כריכה רכה (200 / מארז)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 מ"ל פיפט עטוף בנפרד כריכה רכה (200 / מארז)Thermo Fisher Scientific1367811E
תרבית רקמות מטופלת ביוליט 24 בארות צלחתתרמו פישר תרבית רקמות מדעית130188
טיפול בביוליט 6 בארותצלחת תרמו פישר מדעי130184 
תרבית רקמות מטופלת 6 ס"מ צלחתתרמו פישר מדעי130181 
EMD Millipore Millex מזרק סטרילי PVDF מסנן גודל נקבוביות: 0.22 μ mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne טיפ פילטר טיפ 0.1 - 10 μ l קצה מסנן מוארךארה"ב סיינטיפיק1120-3810
טיפ טיפ מסנן אחד 1 - 20 μ l קצה מסנןארה"ב סיינטיפיק1120-1810
טיפטיפ פילטר מסנן אחד 1 - 200 μ l  טיפ מסנןUSA Scientific1120-8810
טיפ טיפ פיפט מסנן 101 - 1000 μ l טיפ מסנןUSA Scientific1126-7810
15 מ"ל צינורות חרוטיים סטריליים 20 שקיות של 25 צינורות (500 צינורות)USA Scientific1475-0511
50 מ"ל צינורות חרוטיים סטריליים 20 שקיות של 25 צינורות (500 צינורות)USA Scientific1500-1211

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314(2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289(2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33(2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

iMOPbFGFEdUCdkn1b Cdh1Cdkn1b Tubb3

מאמרים קשורים