הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53693

⸱

28 בינואר 2016

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

במאמר זה

סיכום

חלבונים משמשים לעתים קרובות לסימון פרוקי רגליים למחקר פיזור. מודגמות שיטות למתן סימני חלבון פנימיים וחיצוניים על פרוקי רגליים. טכניקות זיהוי סימני חלבון, באמצעות בדיקות אימונוסורבנט עקיפות או סנדוויץ' מקושרות לאנזים (ELISAs), מומחשות גם כן.

תקציר

תנועת פרוקי רגלי ניטור נדרשה לעתים קרובות כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה הקשורים האוכלוסייה, דפוסי פיזור, העדפות צמח מארח, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות. פרוקי רגליים בדרך כלל במעקב בטבע על ידי תיוגם עם סימן ייחודי ולאחר מכן לאורך זמן ובמרחבם כדי לקבוע את יכולות פיזורם באיסוף מחדש. בנוסף לתגים פיזיים ממשיים, כגון אבק או צבע צבעוניים, סוגים שונים של חלבונים הוכחו כיעילות מאוד לסימון פרוקי רגליים למחקר אקולוגי. יכולים להינתן חלבונים פנימיים ו / או חיצוני. אז יכולים להיות שזוהו החלבונים על פרוקי רגליים וכבשו עם assay חלבון ספציפי צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחוץ וכלפי פן תיוג פרוקי רגליים עם חלבון. שתי דוגמאות ניסיוניות פשוטות הם הפגינו: (1) סימן חלבון פנימי הציג לחרקים על ידי מתן תזונה מועשר בחלבון ו- (2) סימן חלבון חיצוני topicallypplied לחרקים באמצעות nebulizer רפואי. לאחר מכן, אנו מתייחסים מדריך צעד-אחר-צעד של הכריך ושיטות ELISA עקיפים משמשות לאיתור סימני חלבון בחרקים. בהפגנה זו, היבטים שונים של הרכישה והגילוי של סמני חלבון על פרוקי רגליים לסימן-שחרור-לכבוש מחדש, סימן-ללכוד, וסוגים-סימן-לכידה העצמית של מחקר הם דנו, יחד עם הדרכים השונות כי הליך immunomarking היה מותאם כך שיתאים למגוון רחב של מטרות מחקר.

מבוא

מעקב התנועה של מזיקי פרוקי רגליים, אויבים טבעיים (טפילים וטורפים), ומאביקים בטבע הוא חיוני להבנה טובה יותר כיצד לשפר את שירותי מערכת אקולוגית. המרכיב המרכזי במרבית הסוגים של מחקר הוא שיש פיזור שיטה אמינה כדי לתייג את פרוקי הרגליים (ים) של עניין. מגוון רחב של חומרים (לדוגמא, צבעים, צבעים, אבקות צבעוניות, תגים, אלמנטים נדירים, חלבונים) שימשו כדי לסמן פרוקי רגליים להעריך דינמיקת האוכלוסייה שלהם, יכולות פיזור, האכלת התנהגויות, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות 1,2.

נאותות סמן המשמש לכל מחקר פיזור נתון תהיה תלויים בסוג של מחקר שנערך. ישנם שלושה סיווגים רחבים לסימון פרוקי רגליים: (1) סימן-שחרור-לכבוש מחדש (MRR), (2) סימן-ללכוד, ו- (3) סימן-לכידה עצמית. למחקר סימן-שחרור-לכבוש מחדש, החוקר בדרך כלל מסמן את פרוקי הרגליים קולקטיבי בlaboratoר"י ומשחרר אותם בנקודה מרכזית בתחום. אז פרוקי רגליהם כבשו במרווחי מרחב ובזמן שונים באמצעות מכשירי אוסף שונים (בניכוי למשל, לטאטא, ואקום, מלכודת דביקה) 3,4,5. אז הדגימות כבשו נבחנות לסימן הספציפי להבחין שוחררו מאנשים מקומיים. למחקר סימן-ללכוד, החוקר בדרך כלל חל הסימן ישירות בציוד השדה באמצעות תרסיס (למשל, מרסס תרמיל, בום ומרסס זרבובית). הסמנים הטובים ביותר עבור מחקר סימן-לכידה זולים ובקלות להחיל בית הגידול של פרוקי הרגליים. למחקר-סימן-לכידה עצמית, החוקר בדרך כלל חל סימנים לכניסה פיתיון פרוקי רגליים 6,7 או 8 קן. בתורו, פרוקי הרגליים מסמנת את עצמו באופן פנימי על ידי טורף את הפיתיון המסומן או חיצוני על ידי "צחצוח" נגד סימן יציאתו לקן.

כפי שצוין לעיל, סוגים רבים של סמנים היואד לתייג מגוון מיני פרוקי רגליים. עם זאת, מעט מאוד שימושיים לכל שלושת קטגוריות מחקר פיזור אלה. הפיתוח של הליך immunomarking החלבון היה פריצת דרך משמעותית עבור סימון חרקים. Immunomarking מעמיד תווית חלבון על פרוקי רגליים פנימיים או חיצוני אשר, בתורו, הוא זוהה על ידי assay נגד חלבון מסוים צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). סמני החלבון הראשונים מסוג המשמשים היו אימונוגלובולינים ארנב (IgG) וIgG עוף / IgY 9,10. הם הוכיחו להיות יעילים מאוד סימנים לMRR ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון). למרבה הצער, חלבוני IgG / IgY הם יקרים ולכן אינם מעשיים למחקר סימן-לכידה ורוב הסוגים של מחקר-סימן-לכידה עצמית. בהמשך לכך, ELISAs זיהוי חלבון הדור השני פותחו עבור חלבונים כלולים בחלבוני ביצת עוף (אלבומין), חלב פרה (קזאין) וחלב סויה (חלבון מעכב טריפסין). כל assay הוא רגיש מאוד, ספציפי, והכיחשוב מכך, משתמש בחלבונים שהם הרבה פחות יקרים מאשר חלבוני IgG / IgY 11. חלבונים אלה הוכחו כיעילים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון).

במאמר זה, אנו מתארים ומדגימים כיצד לבצע מחקרי שימור המעבדה סימן חלבון. מחקרים כאלה הם השלב הראשון של המחקר הדרוש לכל סוג של מחקר פיזור שדה. באופן ספציפי, זה קריטי, כי חוקרים יודעים כמה זמן הסימן יישמר על מיני פרוקי רגליים הממוקדים לפני היציאה ללימודי פיזור שדה. כאן אנו מתארים ומדגימים כיצד פנימיים והן חיצוניים כדי לסמן חרקים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקרי שדה הסוג-סימן-לכידה עצמית. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד לזהות הנוכחות של הסימנים עם ELISAs העקיף וכריך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הפנימי מארק, שמירה, וזיהוי נוהל

  1. הליך סימון פנימי
    1. לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100 אנשים) ממושבת מעבדה גדלה על דיאטה מלאכותית או מהשטח ולחלק לשתי מכולות גידול נקיות.
    2. מניחים מנות רגילות 20 מיליליטר דיאטה (טיפול ביקורת שלילי לא מסומן) לאחת מהמכולות. להשלים מנה שנייה 20 מיליליטר מלאכותית דיאטה עם 1.0 מיליליטר של 1.0 מ"ג / מיליליטר IgG עוף / פתרון IgY, ומערבב היטב, ומניח אותו במכל האחר.
      הערה: אם החרק של עניין אין דיאטה מלאכותית, הסימן יכול להיות ממוקם באו בכל דיאטה שהם בדרך כלל נגרמו על (למשל, שעועית ירוקה, ביצי עש, מים, סוכר, דבש).
    3. לאפשר החרקים לחדש פעילות ההאכלה שלהם למשך 24 שעות.
  2. הליך שימור סימן פנימי
    1. הסר את מנות דיאטה מכל מכולה ולספק את החרקים wה- i אחר מקור מזון כדי לקיים אותם על משך הניסוי (למשל, שעועית ירוקה).
    2. לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים יומיים (או בכל פרק זמן רצוי) מכל טיפול ולהקפיא מייד ב -20 ° C.
  3. הליך ELISA כריך
    1. הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד עוף IgY העיקרי בדילול 1: 500 בטריס שנאגרו מלוח (TBS) היטב בכל microplate ELISA נקי ודגירה למינימום של שעה 1 ב RT (הערה: O microplates גם יכול להיות מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס).
    2. מחק את הנוגדן מהצלחת ולחסום כל טוב עם 300 μl של פתרון חלב יבש ללא שומן 1.0% למשך 30 דקות.
    3. בזמן ההמתנה לצעדי דגירה הקודמים, למקם את החרקים קפוא בנפרד ב1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge עם 1.0 מיליליטר של TBS.
    4. טוחנים כל חרקים עם העלי נקי עד הומוגני ביסודיות ולהוסיף של כל דגימה 100 μl ולבודד של ELISAצַלַחַת. אפשר הדגימות כדי לדגור על RT עבור שעה 1.
    5. להוסיף לשלילי (TBS בלבד) וחיוביים 100 μl (חלבוני ביצה בTBS) בקרות לבארות בעמודה הראשונה של כל צלחת ELISA. כמו כן, להוסיף בקרות חרקים שליליות (חרקים לא מסומנים) 100 μl לבארות 8 בטור האחרון של כל צלחת (איור 1). אפשר דגימות השליטה כדי לדגור על RT עבור שעה 1. שים לב שהתבנית הניתנת באיור 1 היא התבנית אנו משתמשים למבחנים הסטנדרטיים שלנו. המיקום של הדגימות בבארות הוא לשיקול דעתו של החוקר.
    6. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם מי מלח פוספט (PBS) -tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG אנטי-עוף ארנב / IgY מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: פתרון חלב 10,000 ב 1% ודגירה עבור שעה 1 ב RT.
    7. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של tetramethylbenzidine מצע (TMB) זה טוב.
    8. לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארותעם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר.

figure-protocol-1
איור 1. תרשים סכמטי המציג את הכינויים גם תקניים המשמשים ל96 טיפוסי גם microplate ELISA. כל צלחת מכילה 7 בארות מוקדשים לבקרה שלילית שנאגרו מלוחה-טריס (TBS), גם ייעודיות לשליטת חלבון חיובית (POS Ctrl), 80 בארות בודדות מוקדשת לחרקים כבשו מחדש (לדוגמא 1 ... 80), ו -8 בארות מוקדשים לבקרת חרקים לא מסומן (שלילית) (נג Ctrl 1 ... 8). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. החיצוני מארק, שמירה, וזיהוי נוהל

  1. הליך סימון חיצוני
    1. לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100יחידים) ממושבת מעבדה או מהשטח והמקום לשני מיכלי פלסטיק 1.0 L עם חור בקוטר 2.5 סנטימטר אגרוף מהצד השני של כל מכולה.
    2. ריסוס החרקים במכל הראשון עם 1.0 מיליליטר של DH 2 O (טיפול בקרה שלילי) באמצעות nebulizer רפואי. ריסוס החרקים במכל השני עם 1.0 מיליליטר של פתרון 5.0% מחלבוני ביצת עוף באמצעות nebulizer רפואי.
    3. צרף את הצינור של nebulizer לשקע אוויר מעבדה סטנדרטי ולאחר מכן הכנס את הפה של nebulizer לתוך חור 2.5 סנטימטר של המכל. לאחר מכן, להפעיל את יציאת האוויר בהדרגה עד nebulizer מייצר אדים.
    4. המשך ריסוס (סימון) עד פתרון חלבוני ביצה כבר לוותר (כ. 2-5 דקות).
    5. הסר את nebulizer ולמקם את פקק לתוך החור של מיכל הפלסטיק. לאפשר החרקים לעמוד על RT עד הפתרון התייבש לחלוטין.
  2. הליך שימור סימן חיצוני
    1. מניחים כל טיפול בחרקים היבש לתוך מיכל נפרד גידול נקי, כדי למנוע חשיפה נוספת לסימן.
    2. להוסיף מזון ומים למכל הנקי כדי לקיים את החרקים על משך המחקר.
    3. לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים מכל טיפול היומי ולהקפיא מייד ב -20 ° C.
  3. הליך ELISA עקיף
    1. מניחים את החרקים הקפואים בנפרד לתוך 1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולהוסיף 1.0 מיליליטר של TBS.
    2. משרים את הדגימות עבור שעה 1 בסט ייקר מסלולית ב 120 סל"ד.
    3. להוסיף בקרות שליליות וחיוביות כמתואר בשלב 1.3.5.
    4. לאחר ההשריה, פיפטה aliquot 100 μl מכל מדגם לאחד 80 בארות מדגם ייעודיות ובצלחת ELISA חדשה 96 כפי שמוצג באיור 1 אפשר הדגימות כדי לדגור במשך שעה 1 ב RT (הערה:. Microplates יכול להיות גם O מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס).
    5. לשטוף את הבארות שלוש פעמים עםPBS-tween ולאחר מכן להוסיף 300 μl של נאגר מלוח פוספט המכיל 1% אלבומין בסרום שור (PBS-BSA) זה טוב.
    6. לאחר 30 דקות ב RT לשטוף פעמיים עם PBS-tween.
    7. הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד ביצת אלבומין העיקרי בדילול 1: 8,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) לכל היטב דגירה עבור שעה 1 ב RT.
    8. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG נגד הארנב העז מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: 2,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) במשך שעה 1 ב RT.
    9. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של מצע TMB היטב כל אחד.
    10. לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארות עם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר.

ניתוח 3. נתונים

  1. לחשב את הערך הממוצע של ספיגת 8 החרקים ביקורת השליליים על כל צלחת ELISA ולאחר מכן לחשב את סטיית התקן בהתבסס על הפקדים השליליים נקוו הלוך ושובכל צלחות ELISA של מחקר ניתנו 12 מ '.
  2. להוסיף שש פעמים סטיית תקן ונקווה לממוצע המתקבל לכל צלחת ELISA להשיג ערך סף חיובי ELISA. כל מדגם חרקים מניב ערך הספיגה שווה או גדול מהערך הזה נחשב כחיובי לנוכחות של סימן החלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פנימי לציון:

תוצאות בדיקת שימור סימן הפנימית מוצגות באיור 2 א. ערך הסף המחושב ELISA הקריטי היה 0.054. בסך הכל (כל ארבעת תאריכי המדגם משולבים), החרקים טופלו ללא חלבון הניבו ערכים נמוכים באופן עקבי ELISA (x = 0.038 ± 0.002, n = 80). לעומת זאת, כל החרקים האכילו את הדיאטה העשירה החלבון הניבה ערכים חזקים באופן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הליך immunomarking חלבון פרוקי רגליים תואר לראשונה כמעט רבע מאה לפני 9. מאז, ההליך הותאם ללמוד את דפוסי הפיזור של מגוון רחב של פרוקי רגליים באמצעות IgG / IgYs מנוהל פנימי וחיצוני. חלבונים אלה הוכיחו סמנים איתנים למגוון הרחב של מיני חרקים נבדקו עד כה. עם זאת, כאמור לעיל, המגבלה העיקרית לשימוש בIgG / IgYs היא שהם יקרים מאוד. כתוצאה מכך, IgG / IgYs הם שימושי רק עבור MRR ומחקרי סוג סימון עצמי שבו קבוצות גדולות של חרקים יכולות להיות מסומנות בחלל קטן או יכולים להיות משולבות ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות האמריקאי. משרד החקלאות האמריקאי הוא ספק הזדמנות שווה ומעביד.

תודות

מימון ניתן על ידי משרד החקלאות האמריקאי כריס 5347-22620-021-00D ו, בחלקו, על ידי החקלאות ומזון מענק המחקר תחרותי היוזמה לא. 2011-67009-30141 מהמכון הלאומי USDA של מזון וחקלאות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של יוהנה Nassif. אנו מודים גם פול בייקר, דוד הורטון, דייגו Nieto, ופרנסס Sivakoff למתן חלק מהתמונות השתמשו באיור 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיכל אחסון מזון (לגידול חרקים)Rubbermaid/Tupperwareבגדלים שוניםיצרנים וספקים שונים. בד רשת מודבק בחלון
נבולייזר בנפח קטן (מיקרו ערפל)Teleflex-Hudson RCI1881זמין באינטרנט ובחנויות לציוד רפואי. מותגים אחרים יעבדו גם כן.
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.6 מ"ל עם פקקמוצרי מעבדה קונטיננטל4445.Xכל סוג דומה יעבוד. אנו מעדיפים מותגים שיש להם מכסים קלים לפתיחה.
קופסת אחסון קלקר לצינורות מיקרוצנטריפוגה (רשת 5x20)RPI Corp.145746עיצוב זה נחמד מכיוון שהוא לא גודש את הצינורות.
מתקן, משחזראפנדורף4982000322כל דבר דומה יעזור להאיץ את החלוקה.
Pestles, מטחנות טישו חד פעמיות מפלסטיק, 1.5 מ"לKimble Chase749521-1500זמין אצל ספקים שונים. ניתן לנקות עליים ולבצע חיטוי לשימוש חוזר.
צלחות BD Falcon ELISA, 96 בארות (תחתית שטוחה)BD351172
Ovation פיפטה, ידנית (20-200 ומיקרו; l)VistaLab1057-0200 או 1070-0200כל סוג דומה יעבוד. דגם זה ארגונומי.
מאגרים, מגיב סטריליVistaLab4054-1000כל דבר דומה יעבוד.
פיפטה אלקטרונית, 8 ערוצים (50-1,200 ומיקרו; l) (Biohit eLine)Sartorius730391אם היית צריך לבחור דגם אלקטרוני אחד, הגודל הזה הוא השימושי ביותר.
פיפטה אלקטרונית, 8 ערוצים (10-300 ומיקרו; l) (Biohit eLine)Sartorius730361כל דבר דומה יעבוד.
סעפת, מכונת כביסה מרובת צלחות (8 מצבים, ישר)סיגמא-אולדריץ'Z369802 כל דבר דומה יעבוד לשטיפת צלחות ידנית.
קורא מיקרו-פלטות עם זיהוי ספיגהמכשירים מולקולרייםSpectraMax 250כל דבר דומה יעבוד.
עוף IgG / IgYארצות הברית ביולוגיI1903-15Rזמין גם ממקורות אחרים
חנות מכולת חלבוני ביצה" כל הלבנים", " מקצפי ביצים", etc.מערבבים 5 מ"ל עם 95 מ"ל dH2O לתמיסה של 5%
Tris (Trizma Base)Sigma-AldrichT15032.42 גרם/ליטר להכנת TBS
נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS988829.22 גרם/ליטר להכנת TBS ו-8.0  g⁠/⁠ L עבור PBS
נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)Sigma-AldrichS08761.14 גרם/ליטר עבור PBS
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Sigma-AldrichP56550.2 גרם/ליטר עבור PBS
אשלגן כלורי (KCl)Sigma-AldrichP95410.2 גרם/ליטר עבור PBS
Tween 20, סיגמא-אולדריץ'P1379הוסף 0.5 מ"ל לליטר ל-PBS לאחר המסת מלחים.
PBS עם 1% BSASigma-AldrichP3688מערבבים שקיק 1 ב-1 ליטר dH2O
נוגדן נגד עוף IgY (IgG) (מולקולה שלמה) המיוצר בארנב (1:500)Sigma-AldrichC6409ערבוב 100 ומיקרו; l ב-50 מ"ל כף
חלב יבש, אבקת חלב או חלב טרי (1%)מכולתמערבבים 10 גרם עם 1 ליטר dH2O לתמיסה של 1%
נוגדן נגד עוף IgY (IgG) (מולקולה שלמה)-פרוקסידאז המיוצר בארנב (1:10,000)Sigma-AldrichA9046Mix 100 & l ב -1 ליטר של חלב 1%
נוגדן אלבומין ביצת עוף המיוצר בארנב (1: 8,000)Sigma-AldrichC6534מדולל 125 ומיקרו; l ב-1 ליטר PBS-BSA
עיזים נגד ארנב IgG Peroxidase מצומד (1:2,000)Sigma-AldrichA6154מדלל 0.5 מ"ל ב-1 ליטר PBS-BSA, ואז מוסיפים 1.3  מ"ל Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) קופולימר סיליקון-פוליאתרזרעי LehleVIS-01הוסף כמרכיב אחרון
TMB Microwell רכיב אחד מצע פרוקסידאזSurModicsTMBW-1000-01
בדרגת EIA

מקורות

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ELISAIgYSandwich ELISAIndirect ELISA
ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.