גירוי ישיר שוטף הקלטת מערך רבה-אלקטרודה של פעילות כמו-תפיסת עכברי הכנת פרוסת המוח

Summary

מחקרים הראו שגירוי זרם ישר טרנס-גולגולתי קתודלי יכול לייצר השפעות מדכאות על התקפים עמידים לתרופות. במחקר זה, תוכנן מערך ניסוי במבחנה שבו הוערכו גירוי הזרם הישר ורישום מערך מרובה אלקטרודות של פעילות דמוית התקף בהכנת פרוסות מוח של עכברים. פרמטרי הגירוי בזרם ישר הוערכו.

Abstract

Cathodal transcranial גירוי ישיר הנוכחי (tDCS) גורם תופעות מדכאות על התקפים עמידים לתרופות. כדי לבצע פעולות אפקטיביות, פרמטרי הגירוי (למשל, נטייה, עוצמת שדה, ומשך גירוי) צריכות להיבחן בהכנות פרוסות עכברי מוח. בדיקה וסידור שמיקומו ביחס האלקטרודה אל המיקום של פרוסת מוח עכברים הם ריאליות. השיטה הנוכחית שומרת על מסלול thalamocingulate כדי להעריך את ההשפעה של DCS על פעילויות, כמו תפיסת cingulate קורטקס. התוצאות של הקלטות מערך רב ציינו כי cathodal DCS משמעותית את המשרעת של עורריו תגובות הגירוי ומשך 4-aminopyridine ו bicuculline מושרה הפעילות כמו אפילפסיה. גם במחקר זה נמצא כי יישומי DCS cathodal ב 15 דק 'גורמים לדיכאון לטווח ארוך במסלול thalamocingulate. המחקר הנוכחי בוחן את ההשפעות של DCS על thalamocingulatדואר הפלסטיות הסינפטית ופעילויות, כמו תפיסת הכדור פנימה. ההליך הנוכחי יכול לבחון את פרמטרי גירוי האופטימליים כולל התמצאות, עוצמת שדה, ומשך גירוי במודל עכבר במבחנה. כמו כן, השיטה יכולה להעריך את ההשפעות של DCS על פעילויות קליפת מוח, כמו תפיסה בשתי רמות הסלולר ורשת.

Introduction

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית נפוצה. שלושים אחוז מהחולים עם אפילפסיה סובלים מהתקפים עמידים לתרופות¹. גירוי זרם ישר טרנס-גולגולתי (tDCS) מספק גישה לא פולשנית לשליטה או שינוי פעילויות רשת על פני אזורי מוח גדולים, כגון התקפים. מחקרים קליניים הראו כי tDCS מטפל ביעילות בהתקפים עקשניים² ויכול לייצר השפעות מדכאות לטווח קצר וארוך על התקפים^3-5. אולם המנגנון הטיפולי של פעולות tDCS עדיין לא ברור. מודל פרוסת המוח המוצג הוא שיטה חוץ גופית לחקירת האופן שבו המנגנון הטיפולי של פעולות tDCS משנה את הסימפטומים של פעילויות מוח דמויות התקף. בהתאם לכך, כדי להשיג את ההשפעות האופטימליות, יש לבדוק פרמטרים ספציפיים של גירוי כולל התמצאות, עוצמת שדה ומשך הגירוי במודל ניסיוני. מחקרים קודמים הראו כי כיוון השדה החשמלי חשוב להשגת השפעות טיפוליות⁶. לפיכך, בדיקה וסידור כיוון האלקטרודות ביחס למיקום פרוסת המוח שנבדקה ניתנת לביצוע.

אפילפסיה של האונה הקדמית והתקפי פיתול החגורה הקדמי (ACC) הם לרוב עמידים לתרופות^7,8. כמה מחקרים דיווחו על יישום של tDCS בקליפת המוח החגורה^9-11. הוכח כי tDCS משפיע על ערנות, קבלת החלטות ורגש באמצעות שינוי פעילויות ACC, ויכול לווסת את הריגוש העצבי ופעילות ההתקפים באזור מוח זה¹². לכן, השפעות מדכאות של tDCS על התקפי ACC עשויות להיות מועילות לטיפול קליני ולהערכת טיפולים אלטרנטיביים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת האלקטרודה בתא ההקלטה ל-DCS של פרוסת מוח ואת השפעתה על רישום פעילות דמוית התקף עם מערך רב-אלקטרודות (MEA).

Protocol

נהלים אשר נכללים בהם בני חיה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת ניצול, Academia Sinica, טייפה, טייוואן.

1. הכנת פתרון וציוד הניסיונות עבור הקלטת Array multielectrode

1. הכן נוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF; 124 מ"מ NaCl, 4.4 מ"מ KCl, 1 מ"מ לאא ₂ PO _3, 2 מ"מ MgSO _4, 2 מ"מ CaCl _2, 25 mM NaHCO _3, ו -10 גלוקוז מ"מ, מבעבע עם 95% O ₂ ו 5% CO _2).
2. השתמשו שני סוגים של בדיקות MEA: 6 x 10 MEA מישוריים 8 x 8 MEA. החללית לשעבר מכסה את האזור המהווה את קליפת המוח, הסטריאטום, ו התלמוס. החללית האחרונה מכסה רק באזור קליפת המוח.
3. השתמש מגבר 60 ערוצים עם מסנן הלהקה עוברים להגדיר בין 0.1 הרץ ו -3 קילוהרץ ב -1,200 הגברה. רוכש את הנתונים בקצב דגימה של 10 קילוהרץ.
4. מניח שני חוטי כסף מצופים AgCl בתוך חדר MEA עבור DCS. השתמש AgClחוטי כסף מצופים לייצר שדות חשמליים המופקים על ידי ממריץ מבודד.
5. מניחים אלקטרודה טונגסטן (בקוטר 127 מיקרומטר, אורך, 7.62 ס"מ; 8 ° קצה קוני AC; התנגדות, 5 MΩ) לגירוי התלמוס, ולמקם את האלקטרודה התייחסות בתא MEA. לספק את הזרמים של אלקטרודה טונגסטן באמצעות ממריץ מבודד כי הוא נשלט על ידי גנרטור הדופק.

2. הכנת פרוסת המוח

1. השתמש זכר C57BL / 6J, בן 4-8 שבועות. בית החיות בחדר ממוזג (21-23 מעלות צלזיוס; 50% לחות; 12 שעות / 12 שעות אור / חושך מחזור, האורות דולקים בשעה 8:00 בבוקר) עם גישה חופשית למזון ומים.
2. קחו aliquot 250 מ"ל של aCSF כי היה מוכן בשלב 1.1, ולמקם אותו בתוך כוס המכילה קרח. במקביל, לאספקת גז רציפה המורכבת 95% O _2, 5% CO _2.
3. כִּירוּרגִיָה
   1. להרדים את החיה עם isoflurane 4% בכוסקופסא כ 3 דקות. ברגע החיה מגיעה לעומק של הרדמה כירורגית (מסומן על ידי חוסר תגובה קמצוץ הבוהן), והנח אותו על מגש שטוח כי הוא מלא קרח כתוש, ולהסיר את הראש באמצעות מספריים.
   2. לחשוף את הגולגולת, חתוך את השריר הנותרים. לאחר מכן, באמצעות rongeurs, לקלף את פני השטח הגבי של הגולגולת מן המוח. חתוך משם בצידי הגולגולת באמצעות rongeurs. לעקר את כל מכשירי ניתוח עם פתרון אתנול 75%.
   3. בעזרת מרית, לחתוך את נורות חוש הריח ואת קשרים עצביים לאורך משטח הגחון של המוח, ולהסיר את המוח. לאחר עריפת הראש, במהירות להעביר את מוח כוס המלאה aCSF מחומצן קר כקרח.
4. הכנת המדיאלי התלמוס (MT) -ACC המוח Slice
   הערה: כן פרוסות המכילות את הנתיב מעבר מן MT ¹³ ACC.
   1. יד-חותכים את גוש המוח עם שני חתכים sagittal 2.0 מ"מ לרוחב קו האמצע בכל חצי הכדורכדי להציג את האנטומיה קורטיקליים. ואז לעשות שני חתכים זוויתי. הפוך את ההקבלה חוצה לחתוך הראשונה בדרכי הסיבים הגלויות בסטריאטום.
   2. הפוך את הניסור השני מהחיבור בין המוח הקטן ואת קליפת ראייה אל נקודת האמצע בין השלכתי הקדמי ודרכי אופטיים כי הם גחון ובמקביל מסלול thalamocingulate.
   3. צרף בלוק מוח צלחת זוויתי (~ 120 °) עם דבק cyanoacrylate, ולעשות חתך בדיוק מעל נקודת המפנה של המסלול. לפתוח את הצלחת, לשטח אותו, ודבק אותו לבמת לשכת vibratome.
   4. הפוך פרוס מוח התלמוס-ACC המדיאלי (500 מיקרומטר עבה) ולאחר מכן לטבול אותם פרוסות aCSF.Transfer מחומצן קר כקרח לתא ההקלטה, ולשמור על 32 מעלות צלזיוס מתחת זלוף רציף (12 mL / min) עם aCSF מחומצן עבור 1 hr.

3. הכנת לשכת זלוף עבור מערך multielectrode הקלטה

1. הכנהשל זלוף קאמרית
   1. מניחים החללית MEA על מערכת רב ערוצית, ולהשתמש שני צינורות פוליאתילן נפרד להתחבר החללית למשאבה peristaltic. השתמש צינור אחד שינחה את aCSF לתוך תא MEA ואת הצינור האחר כדי להנחות את aCSF מתוך החדר. לבסוף, ברציפות perfuse ההכנה עם חם aCSF מחומצן (29-30 מעלות צלזיוס) (8 מ"ל / דקה).
2. עבר פרוסת מוח MEA. החזק את פרוסת המוח על MEA באמצעות מקלון צמר גפן רטוב. בזהירות להזיז את פרוסת המוח כדי להבטיח את ACC מכוונת מעל אלקטרודות.
3. השתמש ערכות עוגנות פרוסות וחזק ומורד ללחוץ על פרוסת המוח. צעד זה מבטיח חיבור חשמלי טוב בין הפרוסה ואלקטרודות.

דור 4. של שדות חשמליים על ידי DCS

הערה: ההגדרה של האוריינטציה השדה החשמלי התבססה על הכיוון של ציר axodendritic ב ACC. האוריינטציות של תאי דנדריט סומה היואשר באמצעות Golgi מכתים ^12.

1. מניח את האלקטרודה AgCl (מוגדר האנודה) הפרוקסימלי ACC, ולמקם את האלקטרודה האחר (מוגדר הקתודה) דיסטלי ACC. רשום את עוצמת השדה שנוצר על ידי שתי האוריינטציות שדה (מקבילים, מאונכים לסיבי axodendritic ACC) על ידי MEA, ולספק הזרמים של שדות חשמליים באמצעות ממריץ.
2. תקן את המרחק של אלקטרודות AgCl (כ 1.5-2 ס"מ), ולהתאים את הכוח הנוכחי של ממריץ להפוך את DCS בין 0.5 ו -2 מילי-אמפר.

5. תגובות חשמליות נגרמות שנמדד

הערה: להשרות תגובות הסינפטי ב ACC על ידי גירוי חשמלי של MT, שבו גנרטור גירוי חשמלי לתכנות מייצר פולסים הנוכחי biphasic מלבני.

1. סעיף 3 חוזר לעיל.
2. מניחים אלקטרודה טונגסטן ב MT, ולספק פולסים מן ממריץ אל Thalבאזור Amic של פרוסות באמצעות אלקטרודות טונגסטן דו קוטבית.
3. השתמש עוצמות נוכחיות שונות כדי לקבוע את הסף הזה מעורר תגובת ACC. הנה, להשתמש בעוצמה של ± 150 מיקרו-אמפר ומשך 200 μsec, אשר עורר תגובה מקסימלי 80% ב ACC ברוב פרוסות.
4. הזז את אלקטרודת טונגסטן לאורך מסלול thalamocingulate (מ MT כדי כפיס המוח) של הפרוסה MT-ACC להשיג את הפרופילים מענה מיטבי.
5. הפוך 10-20 מטאטא תגובות ACC, ולהשתמש בתוכנה באופן אוטומטי סכום ממוצע של כל ACC עורר על ידי גירוי MT. התוצאה ISS התגובות סינפטי ACC המושרה מגירוי MT ידי מסלול MT-ACC.

חשמלית הנגרמת 6. פעילות התקפים דמויי

הערה: פעילות התקפים דמויות הושרה על ידי היישום של 4-aminopyridine (4-AP: 250 מיקרומטר) bicuculline (5 מיקרומטר). מחקרי זמן שליטה קודמים הראו כי תגובות מקסימליים ויציבות הופיעו2-3 שעות לאחר יישום הסמים ^14.

1. סעיף 5 חוזר לעיל.
2. להוסיף תרופות הפתרון זלוף. השתמש 4-AP (250 מיקרומטר) bicuculline (5 מיקרומטר). מערבבים את התרופות באופן אחיד, ולהמשיך זלוף במשך 2-3 שעות.
3. כדי להקל כמו פעילות התקף, לשמור על המשאבה זלוף בקצב זלוף מהיר יחסית (8 מ"ל / דקה), אשר גם יכול לעזור למנוע הצטברות של שיפוע pH.
4. מניחים אלקטרודה טונגסטן ב MT, ולספק גירוי חשמלי (150 מיקרו-אמפר, 200 μsec משך) כדי לקבל פרופילים בתגובה ACC.
5. הפוך 10-20 מטאטא ומחשב את הממוצע של התגובות.
6. החלף את הפתרון זלוף עם aCSF טרי לשטוף את התרופות. חזור על שלב 6.5.

7. משפיע בדיקה של DCS על מעוררים תגובות קורטיקלי

1. סעיפים חוזרים 3 ו -4 ודאו ששדות החשמליים האחידים נוצרים על ידי העברת זרמים בין שני חוטי כסף במקביל AgCl מצופים אשר ממוקמים בתוך Mתא EA. אם אין בעיות, קל DCS נשאר בין 0.5 ו -2 מילי-אמפר.
2. כבה את DCS, ומניחים אלקטרודה טונגסטן כדי לעורר את התלמוס (± 150 מיקרו-אמפר, 200 μsec משך). כדי לקבל תגובות הסינפטי מכסימלי ACC, לעשות 10-20 מטאטא ומחשבים את הממוצע של התגובות.
3. במקביל להפעיל את DCS (2 mV / מ"מ כוח DCS) וגירוי התלמוס (350 מיקרו-אמפר, 200 μsec משך). להעריך את השינויים של משרעת התגובה ACC התלמוס עורר גירוי במהלך DCS.
4. כבה את DCS, ולהוסיף 4-AP (250 מיקרומטר) bicuculline (5 מיקרומטר) לפתרון זלוף. ואז לחכות 2-3 שעות. כאשר התרופות משפיעות על פרוסת המוח, הפרוסה מייצרת תגובות לתפיסת קליפת מוח.
5. הפוך 10-20 מטאטא תגובות ACC, ולאחר מכן למדוד את משרעת ומשך תגובות תפיסת קליפת מוח חשמל עוררת.
6. לאחר שלב 7.5, לפנות בו זמנית על DCS (2 mV / כוח מ"מ DCS) וגירוי התלמוס (150 מיקרו-אמפר, 200 duratiעל μsec). להעריך את השינויים משרעת ומשך תגובות תפיסת קליפת מוח עורר במהלך יישום DCS.
7. החלף את הפתרון זלוף עם aCSF טרי לשטוף את התרופות, וחזור על שלבים 7.2 ו -7.3.
8. לאסוף את כל נתוני ההקלטה ולאחר לקבץ את הנתונים לתוך תנאי ניסויים שונים. להעריך את משרעת ומשך תגובות תפיסת קליפת מוח תחת תנאי ניסויים שונים.

ניתוח 8. נתונים

1. השתמש בתוכנה (למשל, תוכנת Rack MC) סכום ממוצע התגובות שנרשמו אוטומטית, ולייצא את הנתונים הגולמיים לגיליון אלקטרוני. לנתח את המשרעת ומשך את הנתונים הגולמיים וליצור דמויות צבע.
2. כדי לזהות אירועי תפיסה תנודתית, להשתמש בתוכנה כדי למדוד את ערך הבסיס וסטיות תקן (SD). גדר 3 SD של רמת הרעש הוא הסף. אמפליטודות של פסגות במהלך אירוע תנודה כי יעלה את הסף הזה הם מזהים באופן אוטומטיed.
3. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות -test t של סטודנט.
4. מדידות אקספרס וניתוח חד סטרי של שונות (ANOVA) תוצאות בטקסט כממוצע ± SE, עם n המציינים את מספר פרוסות למדו ^12.

Results

הכנה של תכנית התקנת מערכת הקלטת Thalamocingulate לחתוך MEA

פרוסת MT-ACC מהעכברים היא תכשיר פרוסה מיוחד המאפשר חקירה של התכונות אלקטרו של מסלול thalamocingulate. איור 1 א מציג את האופן שבו פרוסת MT-ACC הוכנה. המוח של העכבר הוסר במהירות והמשיך aCSF מחומצן מגניב (איור 1 א, א, ב). כדי לחשוף האנטומיה קורטיקליים, המוח נח...

Discussion

במחקר הנוכחי, את ההשפעות של המשך והכיוון של DCS על פעילות התקפים דמויים ACC נבדקו. כדי לקבל נתונים יציבים פרוסות העכבר המוח, כיצד לשמור על שלמות של מסלול MT-ACC וכדי למנוע נזק זה הוא המפתח, במיוחד את הצעדים בהם שני חתכים הגחון זוויתי חתך הגבי של קליפת מבוצעים. יתר על כן, את הזמן כדי להכין את פרוסת המוח יכול גם להשפיע על הפעילות של פרוסת המוח, אשר אמור להיות בזמן הקצר ביותר האפשרי כדי לשמור על המוח, רעננים וחזק. מחקר קודם הראה כי ניזק אלקטרוכימיים לרקמות ממוקדות יכול להתרחש הכנת

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<הרדמה חזקה>חזקה:
תאגיד מוצרי הלוקרבון	איזופלורן	NDC 12164-002-25	4%
שם	Company	Catalog Number	Comments
aCSF (סה"כ:1 ליטר):
D(+)-גלוקוז	MERCK	1.08337.1000	10 מ"מ
נתרן מימן פחמתי	MERCK	1.06329.0500	25 מ"מ
נתרן כלורי	MERCK	1.06404.1000	124 מ"מ
(+)-נתרן L-אסקורבט, >=98%	SIGMA	A4034-100G	0.15 גרם/2 סמ"ק
מגנזיום גופרתי, נטול מים, ריאגנטפלוס	SIGMA	M7506-500G	2 מ"מ
סידן כלורי דיהידרט	MERCK	1.02382.1000	2 מ"מ
נתרן דימימן פוספט מונוהידראט	MERCK	1.06346.1000	1 מ"מ
אשלגן כלורי	מאי & בייקר בע"מ Dagenham אנגליה	MS 7616	4.4 mM
שם	חברה	מספר קטלוגי	>Comments
Drugs:
(+)-Bicuculline	TOCRIS	0130	5 µ M ב- aCSF
4-Aminopyridine	TOCRIS	0940	250 ומיקרו; M ב-aCSF
Name	>Company	Catalog Number	Comments
Brain Slice הכנה:
Vibratome	Vibratome	סדרה 1000	חיתוך בלוק ל-500 ומיקרו; m פרוסות עבות
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
><חזק>מערכת MEA:
מערך רב אלקטרודות (MEA) בדיקות: 6 x 10 מערכות	רב-ערוציות	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	קוטר אלקטרודה, 30 ומיקרו; m; מרווח אלקטרודות, 500 ומיקרו; m; עכבה, 50 kΩ ב-200 הרץ
בדיקות מערך רב-אלקטרודות (MEA): 8 x 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	אלקטרודה בצורת פירמידה; קוטר, 40 ומיקרו; m; גובה קצה, 50 ומיקרו; m; מרווח אלקטרודות, 200 ומיקרו; m; עכבה, 1,000 KΩ ב-200 הרץ
נעשה שימוש במגבר 60 ערוצים עם מסנן פס-פס שהוגדר בין 0.1 הרץ ל-3 קילו-הרץ בהגברה של 1,200X	מערכות רב-ערוציות	MEA-1060-BC
MC תוכנת ארון תקשורת בקצב דגימה של 10 קילו-הרץ		רב-ערוציות	לאיסוף נתונים והקלטות
בקרה של מחולל דופק	מערכות רב-ערוציות	STG 1002
ערכות עיגון פרוסות והחזקות	וורנר אינסטרומנטס	SHD-26H/10; WI64-0250
משאבה פריסטלטית-מיניפולס3	MINIPULS3	גילסום	: 8 מ"ל/דקה
<חזק>שם<חזק>	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>מערכת גירוי:
ממריץ מבודד	A-M Systems	דגם 2100	עוצמה של ± 350 μ A , משך 200 μ סק
אלקטרודה טונגסטן	A-M Systems	575300	מונחת בתלמוס