הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53716

⸱

24 במרץ 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Pharmacology, Duke University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בדיקת תפוקה גבוהה לבדיקת העדפות הטלת ביצים של Drosophila melanogaster ברזולוציה של בעל חיים יחיד. בדיקה זו מספקת פלטפורמה פשוטה, יעילה וניתנת להרחבה לזיהוי גנים ורכיבי מעגלים השולטים בתהליך קבלת החלטות פשוט.

תקציר

לאחרונה, העדפת הטלה של תסיסנית התפתחה כמודל צייתן גנטי ללמוד את הבסיס העצבי של תהליכי קבלת החלטות פשוטים. בעת בחירת אתרים מטילים את ביציהן, נקבות זבוב מסוגל בדירוג האטרקטיביות היחסית של האופציות שלהם ובחירת "יותר משני מוצרים." עם זאת, מבחני ההעדפה ביותר ההטלה אינם מעשיים אם רוצה לנקוט בגישת סריקה גנטית שיטתית לחיפוש הבסיס המעגל שבבסיס תהליך קבלת החלטות פשוט זו, כפי שהן מבוססות על אוכלוסייה ומייגעת להקים. כדי להגדיל את התפוקה של הלימוד של העדפות הטלה של נקבות אחת, פתחנו תאי מנהג שכל יכול העדפות assay בו זמנית הטלה של עד שלושים פרט עפו כמו גם פרוטוקול המבטיח לכל נקבה יש שיעור גבוה הטלה (כך העדפתם היא להבחין בקלות ועוד משכנע). הגישה שלנו היא פשוטה לביצועומייצר תוצאות מאוד עקביות. בנוסף, החדרים האלה יכולים להיות מצוידים עם קבצים מצורפים שונים כדי לאפשר ווידאו הקלטת חי ההטלה, וכדי לספק אור ללימודי optogenetics. מאמר זה מספק את השרטוטים בודים תאים אלה ואת הליך הכנת הזבובים להיות assayed בתאים אלה.

מבוא

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל גנטי רב עוצמה לחקר הבסיס העצבי של התנהגויות. ההתפתחות המהירה של כלים גנטיים למניפולציה של נוירונים באופן ממוקד והופעתם של כלי ניתוח התנהגות מתוחכמים שיפרו משמעותית את יכולתנו לנתח את מנגנוני המעגלים העומדים בבסיס תהליכי הטרנספורמציה החושית-מוטורית של מספר התנהגויות מולדות ונלמדות1-3.

הטלת ביצים של דרוזופילה היא מודל מתאים לחקר הבסיס העצבי של תהליכי קבלת החלטות פשוטים. בפרט, הוכח כי לנקבות דרוזופילה יש את היכולת להשוות ולדרג את האפשרויות שלהן לפני שהן "מתחייבות" להפקיד ביצית באפשרותנתונה 4-8. לדוגמה, כאשר ניתנים רק מצע רגיל (ללא סוכרוז) או רק מצע המכיל סוכרוז, הנקבות מקבלות בקלות כל אחת מהאפשרויות להטלת ביצים. עם זאת, כאשר מוצגות בפני שתי האפשרויות, נקבות חזקות דוחות את מצע הסוכרוז בהקשרים מסוימים7,9,10. עם זאת, מעט יחסית ידוע על המנגנונים העצביים המאפשרים לנקבות "לבחור את הגדול מבין השניים". מכשול מרכזי היה היעדר שיטה יעילה לבדיקת העדפות הטלת ביצים כך שניתן להשתמש בגישת סריקה גנטית שיטתית כדי לחקור בעיה זו.

בדוח זה, אנו מתארים את הפרוטוקול שפיתחנו המאפשר לבחון את העדפות הטלת הביצים של נקבות ברזולוציה של חיה בודדת ועם תפוקה ועקביות משופרים משמעותית בהשוואה לשיטות קודמות. באופן ספציפי, אנו מספקים את השרטוטים לבניית התאים שתכננו, את הפרוטוקול להכנת הנקבות כך שכל אחת מהן מוכנה להטיל ביצים רבות, ואת פרוטוקול השימוש בתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת זבובים להיות assayed

  1. תרבות עפה על מולסה הסטנדרטי / מדיה קמח תירס בבית החממה נקבעה על 25 מעלות צלזיוס ו -65% לחות. תשמור על עצמך כדי לא לגדוש הצלוחיות. לדוגמא, לשים 8 נקבות ו 6 זכרים לתוך בקבוקון מזון צר.
    הערה: "בקבוקון מזון צר" משמש כאן יש בקוטר פנימי של 2.3 ס"מ. אנחנו בדרך כלל לוותר על 10 מ"ל של אוכל לטוס לתוך בקבוקון אחד. המתכון אוכל לטוס השתמשנו מתואר כאן: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html.
  2. 2 - 3 ימים לאחר eclosion הנקבות, להכין צלוחיות עם רסק שמרים טריים כפי שמוצג באיור 1E. הפוך רסק שמרים טריים ידי ערבוב 6 גרם של שמרים פעילים עם 10 מ"ל של חומצה proprionic 0.5%. להשתמש במרית להחיל את הרסק שמרים על הדפנות של צלוחיות המזון. אסוף 30 - 35 נקבות eclosed יחד עם 20 - 25 זכרים לתוך צלוחיות.
    1. באופן כללי, לאסוף זכרים מאותו הבקבוקונים שבו הנקבות נאספות(כדי לחסוך זמן ומאמץ). עם זאת, אם קיים חשש לגבי הפוריות של גברים, להשתמש זכרי WT במקום. כמו כן, רסק שמרים חשוב מגרה ייצור ביצים ולכן להכין אותו טרי מדי יום.
  3. לשמור על נקבות / זכרים שנאספו על 25 מעלות צלזיוס, 65% לחות, אלא אם הזבובים הם טמפרטורה רגישה.
  4. לאחר ~ 4 - 5 ימים, לבדוק את הבקבוקונים כדי לראות אם נקבות מוכנות לניסויי הטלה. הם מוכנים כאשר השטח של המדיום מזון רטוב מן הזחלים נבירה פעיל בתחום המזון (ראה איור 1E - F).
    הערה: נקבות בדרך כלל לעכב ביצים שתחזינה השטח האוכל הופך להיות רטוב בהם זחלים. צעד זה מבטיח כי נקבות תהיינה מוכנות להטיל ביצים רבות כאשר הם נתקלים מצעים עם מרקם רצוי (למשל., ~ 1% agarose).

2. בנייה קאמרית, הרכבה, התקנת Assay

  1. יש חנות מכונית לבנות תאי אקריליק הטלה (אלחוטיאיור 1 א - ד). ציור ההנדסה של חלקים שונים הוצג משלים איור 1 -. 3 תמונות באיכות גבוהה ניתן למצוא גם כאן (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
  2. הכנס יריעות פלסטיק לתוך טעינה (למעלה) חתיכה של החדר כפי שמוצג באיור 1C. זה משמש את המשטח התחתון בזמן טעינת זבובים לתוך זירות ההטלה הפרט.
  3. להרדים נקבות על כרית CO 2 ומעלה אותם בנפרד לתוך אחד ממרכיבי הטלה. אפשר ~ 30 דקות לזבובים להתאושש CO 2 ולהפוך הסתגלו לסביבה החדשה.
  4. הכן את מצעי agarose.
    1. לנוחיותכם, להחזיק בקבוק התערובת של העוגיות של agarose 1% נמס בתוך אמבט מים 55 מעלות צלזיוס.
    2. מוסיפים את הכמות הרצויה של תמיסת סוכרוז המניות (2 מ ') לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו לערבב אותו עם כמות מתאימה של agarose. לדוגמה, כדי להכין את המצע סוכרוז 150 מ"מ, PLAce 750 μl של 2 M תמיסת סוכרוז לתוך הצינור ואז למלא את הצינור עם agarose אל 10 מ"ל סימן.
    3. מכין את המצע הרגיל באותו אופן, אלא להוסיף מים מזוקקים במקום תמיסת סוכרוז.
      הערה: הריכוז הסופי של agarose בפרוטוקול זה הוא מעט פחות מ -1%. מניסיוננו, הריכוז המדויק של agarose לא משנה כל עוד היא נשלטת להיות בתוך ~ 0.9 - 1.1%, וכי שני המצעים הם מאותו הריכוז agarose.
  5. קח את המצע (למטה) חתיכה של החדר ואת פיפטה 1,000 μl של המצע agarose לתוך כל שוקת כפי שניתן לראות באיור 1D.
  6. אפשר agarose כדי לחזק עבור ~ 30 דקות.
  7. לאחר המצעים וזבובי agarose מוכנים, להרכיב את כל שלוש החתיכות של חדר ההטלה ולאחר מכן להוציא את יריעות הפלסטיק.
  8. מניח את התאים באינקובטורים זבוב.
    הערה: אורך של ניסויי הטלה יכול להשתנות בהתאם expeהצרכים rimental. אנחנו בדרך כלל להפעיל את הניסוי O / N (14 - 16 שעות). כמו כן, אין השפעה משמעותית של עיתוי יממה על העדפות הטלה נצפתה.
  9. להרדים נשים על ידי הזרקת CO 2 לתוך התא. לפרק את התא, לבטל את הזבובים הרדימו לתוך מתי זבוב (כלומר., מקפה ריק יכול מלא מעט שמן תירס). צלמו תמונות של התוצאות עבור ניהול ספרים (ראה איור 2).
  10. ספירת הביצים ידנית ולחשב מדדי העדפה לניתוח. חישוב מדד העדפה לגבי (N א - N ב) / (N א ב + N) שבו N ו- B N לייצג מספר הביצים באתר א ב האתר לעומת, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי ההטלה מורכבים מכמה חתיכות: חתיכת מצע (למטה), מחיצה (באמצע) חתיכה, חתיכת טעינה (למעלה), ו -2 דלתות זזות (איור 1 א - ד). יצירות אלה משמשות זבובי התקנה באופן עצמאיים מצעים לפני ניסויי הטלה. איור 1F מראה כיצד בקבוקונים צריכים להיראות כאשר נקבות זבוב מוכנים-הטלה. כאשר זבובים מקבלים בחירה בין מצע פשוטו מצע המכיל סוכרוז, נקבות וחסונות עדיף המצע הרגיל עבור הטלה כפי שמוצג באיור 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לתאים ולפרוטוקולים המתוארים כאן יש מספר שיפורים לעומת בדיקות הטלת ביצים קודמות. ראשית, הם מגדילים את התפוקה של העדפות הבדיקה של בעלי חיים בודדים באופן משמעותי. כל תא יכול לבחון 30 נקבות בודדות ולוקח פחות משעה להקים. שנית, הם מגבירים את העקביות של העדפות הטלת הביצים על פני שיטות קודמות. הסטנדרטיזציה של מידות הזירה, גודל המצעים המטילים והמרחק בין המצעים מקלה על השוואת התוצאות בין ימי ניסוי שונים ומקבוצות מחקר שונות. שלישית, ניתן לצייד את התאים בקבצים מצורפים כדי להתאים לניתוח נוסף שרוצים להמשיך בו (איור משלים 4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לחנות הפיזיקה של דיוק, במיוחד לפיל לואיס, שעזר לנו לבנות את המנגנון ההתנהגותי וההחזקות ויצר את הציור. עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01GM100027.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרוז אולטרה-טהור Invitrogen16500-500
סוכרוזסיגמאS0389
אמבט מים Fisher15-462-6Q
LifeCam Cinema מצלמת רשתMicrosoftH5D-00013
נוריות LED אדומותCreeC503B-RAN-CA0B0AA1
תאי הטלת ביציםבהתאמה
מחזיקיבהתאמה
בהתאמה
(צר)ג'נסי32-116 לפנה"ס
מחזיקי מצלמה אישית LED אישית בקבוקוני זבוב אישית

מקורות

  1. Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
  2. Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  3. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
  4. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  5. Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
  6. Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
  7. Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  8. Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
  9. Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
  10. Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
  11. Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
  12. Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
  13. Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
  14. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
  15. Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.