פרוטוקול זה מתאר בדיקת תפוקה גבוהה לבדיקת העדפות הטלת ביצים של Drosophila melanogaster ברזולוציה של בעל חיים יחיד. בדיקה זו מספקת פלטפורמה פשוטה, יעילה וניתנת להרחבה לזיהוי גנים ורכיבי מעגלים השולטים בתהליך קבלת החלטות פשוט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
לאחרונה, העדפת הטלה של תסיסנית התפתחה כמודל צייתן גנטי ללמוד את הבסיס העצבי של תהליכי קבלת החלטות פשוטים. בעת בחירת אתרים מטילים את ביציהן, נקבות זבוב מסוגל בדירוג האטרקטיביות היחסית של האופציות שלהם ובחירת "יותר משני מוצרים." עם זאת, מבחני ההעדפה ביותר ההטלה אינם מעשיים אם רוצה לנקוט בגישת סריקה גנטית שיטתית לחיפוש הבסיס המעגל שבבסיס תהליך קבלת החלטות פשוט זו, כפי שהן מבוססות על אוכלוסייה ומייגעת להקים. כדי להגדיל את התפוקה של הלימוד של העדפות הטלה של נקבות אחת, פתחנו תאי מנהג שכל יכול העדפות assay בו זמנית הטלה של עד שלושים פרט עפו כמו גם פרוטוקול המבטיח לכל נקבה יש שיעור גבוה הטלה (כך העדפתם היא להבחין בקלות ועוד משכנע). הגישה שלנו היא פשוטה לביצועומייצר תוצאות מאוד עקביות. בנוסף, החדרים האלה יכולים להיות מצוידים עם קבצים מצורפים שונים כדי לאפשר ווידאו הקלטת חי ההטלה, וכדי לספק אור ללימודי optogenetics. מאמר זה מספק את השרטוטים בודים תאים אלה ואת הליך הכנת הזבובים להיות assayed בתאים אלה.
מבוא
Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל גנטי רב עוצמה לחקר הבסיס העצבי של התנהגויות. ההתפתחות המהירה של כלים גנטיים למניפולציה של נוירונים באופן ממוקד והופעתם של כלי ניתוח התנהגות מתוחכמים שיפרו משמעותית את יכולתנו לנתח את מנגנוני המעגלים העומדים בבסיס תהליכי הטרנספורמציה החושית-מוטורית של מספר התנהגויות מולדות ונלמדות1-3.
הטלת ביצים של דרוזופילה היא מודל מתאים לחקר הבסיס העצבי של תהליכי קבלת החלטות פשוטים. בפרט, הוכח כי לנקבות דרוזופילה יש את היכולת להשוות ולדרג את האפשרויות שלהן לפני שהן "מתחייבות" להפקיד ביצית באפשרותנתונה 4-8. לדוגמה, כאשר ניתנים רק מצע רגיל (ללא סוכרוז) או רק מצע המ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת זבובים להיות assayed
- תרבות עפה על מולסה הסטנדרטי / מדיה קמח תירס בבית החממה נקבעה על 25 מעלות צלזיוס ו -65% לחות. תשמור על עצמך כדי לא לגדוש הצלוחיות. לדוגמא, לשים 8 נקבות ו 6 זכרים לתוך בקבוקון מזון צר.
הערה: "בקבוקון מזון צר" משמש כאן יש בקוטר פנימי של 2.3 ס"מ. אנחנו בדרך כלל לוותר על 10 מ"ל של אוכל לטוס לתוך בקבוקון אחד. המתכון אוכל לטוס השתמשנו מתואר כאן: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 ימים לאחר eclosion הנקבות, להכין צלו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאי ההטלה מורכבים מכמה חתיכות: חתיכת מצע (למטה), מחיצה (באמצע) חתיכה, חתיכת טעינה (למעלה), ו -2 דלתות זזות (איור 1 א - ד). יצירות אלה משמשות זבובי התקנה באופן עצמאיים מצעים לפני ניסויי הטלה. איור 1F מראה כיצד בקבוקונים צריכים להיראות כאשר נקבות זבוב מוכנים-הטלה. כאשר זבובים מקבלים בחירה בין מצע פשוטו מצע המכיל סוכרוז, נקבות וחסונות עדיף המצע הרגיל עבור הטלה כפי שמוצג באיור 2.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לתאים ולפרוטוקולים המתוארים כאן יש מספר שיפורים לעומת בדיקות הטלת ביצים קודמות. ראשית, הם מגדילים את התפוקה של העדפות הבדיקה של בעלי חיים בודדים באופן משמעותי. כל תא יכול לבחון 30 נקבות בודדות ולוקח פחות משעה להקים. שנית, הם מגבירים את העקביות של העדפות הטלת הביצים על פני שיטות קודמות. הסטנדרטיזציה של מידות הזירה, גודל המצעים המטילים והמרחק בין המצעים מקלה על השוואת התוצאות בין ימי ניסוי שונים ומקבוצות מחקר שונות. שלישית, ניתן לצייד את התאים בקבצים מצורפים כדי להתאים לניתוח נוסף שרוצים להמשיך בו (איור משלים 4
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לחנות הפיזיקה של דיוק, במיוחד לפיל לואיס, שעזר לנו לבנות את המנגנון ההתנהגותי וההחזקות ויצר את הציור. עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01GM100027.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אגרוז אולטרה-טהור | Invitrogen | 16500-500 | |
| סוכרוז | סיגמא | S0389 | |
| אמבט מים | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema מצלמת רשת | Microsoft | H5D-00013 | |
| נוריות LED אדומות | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| תאי הטלת ביצים | בהתאמה | ||
| מחזיקי | בהתאמה | ||
| בהתאמה | |||
| (צר) | ג'נסי | 32-116 לפנה"ס |
מקורות
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
