HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

Summary

מאמר זה מתאר כיצד להזריק וקטורים ויראליים לתוך קליפת המוח הקדמית בעכבר כדי לבדוק מבחני התנהגות הדורשים heteromeric היווצרות GPCR.

Abstract

קומפלקס הקולטנים ההטרומרי בין 5-HT_2A ל-mGlu2 היה מעורב בחלק מהפנוטיפים ההתנהגותיים במודלים של פסיכוזה בעכברים^1,2. כתוצאה מכך, חקירת פרטים מבניים של האינטראקציה בין 5-HT_2A ו-mGlu2 המשפיעים על התנהגויות הקשורות לסכיזופרניה מייצגת כלי תרגומי רב עוצמה. כפי שהוצג קודם לכן, תגובת עווית הראש (HTR) בעכברים נגרמת על ידי סמי הזיה ותגובה התנהגותית זו נעדרת בעכברי נוקאאוט 5-HT_2A (KO)^3,4. בנוסף, על ידי ביטוי מותנה של קולטן 5-HT_2A רק בקליפת המוח, הוכח כי מסלולי איתות תלויי קולטן 5-HT_2A על נוירונים פירמידליים בקליפת המוח מספיקים כדי לעורר התנהגות של עווית ראש בתגובה לתרופות הזיה³. לבסוף, הוכח כי התגובה ההתנהגותית של עווית הראש הנגרמת על ידי סמי ההזיה DOI וחומצה ליסרגית דיאתילאמיד (LSD) מופחתת באופן משמעותי בעכברי mGlu2-KO⁵. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-mGlu2 נחוץ לפחות בחלקו להשפעות התנהגותיות דמויות פסיכוזה תלויות בקולטן 5-HT_2A הנגרמות על ידי סמים דמויי LSD. עם זאת, זה לא מספק ראיות האם קומפלקס הקולטן 5-HT 2A-mGlu2 נחוץ לפנוטיפ התנהגותי זה. כדי לענות על שאלה זו, נעשה שימוש במבנים של וירוס הרפס סימפלקס (HSV) כדי לבטא mGlu2 או mGlu2ΔTM4N (מבנה כימרי mGlu2/mGlu3 שאינו יוצר את קומפלקס הקולטן 5-HT_2A-mGlu2) בקליפת המוח הקדמית של עכברי mGlu2-KO כדי לבחון אם קומפלקס הטרומרי GPCR זה נחוץ להשפעות ההתנהגותיות הנגרמות על ידי תרופות דמויות LSD⁶.

Introduction

הזיה, כגון LSD, פסילוסיבין מסקלין לגרום לשינויים משמעותיים בתודעה האנושית, קוגניציה ורגש ^7-9. איון של איתות קולטן הסרוטונין 5-HT _2A באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות גורם נחלש במידה ניכר תגובות התנהגותיות הזיה בשני המודלים המכרסמים ^3,10 ובני אדם ^11. למרות הזיה לאגד תת קולטן אחר ^8, הקולטן _2A 5-HT נחשב הכרחי לפעילות התנהגותי הייחודית של הכימיקלים האלה.

קבוצת II קולטני גלוטמט metabotropic (כלומר., MGlu2 ו mGlu3) היה היעד של תשומת לב רבה לגבי המנגנון המולקולרי של הזיה לבין התפקיד האינטגרלי שלהם שבבסיס פסיכוזה ^12. בעבר, הוכח כי עכברים ללא ביטוי של חלבון mGlu2 (mGlu2-KO עכברים) אינם רגישים להשפעות הסלולר והתנהגותיים של האלlucinogens ^5. כמו כן הוצע כי _2A 5-HT ואת קולטני mGlu2 צורה מורכבת heteromeric ספציפי שדרכו הליגנדים סרוטונין גלוטמט לווסת את דפוס של צימוד חלבון G בתאים חיים ^1,2.

מבחינה מבנית, הטרנסממברני (TM) תחומים 4 ו -5 של mGlu2 לשחק תפקיד מהותי במבנה heteromeric עם קולטן 5-HT _2A ^5. בנוסף, בדיקה נוספת הוכיחה כי שלוש שאריות הממוקמות בקצה התאי של TM4 של mGlu2 נחוצות כדי ליצור את heterocomplex הקולטן 5-HT _2A -mGlu2 בתאים חי ^6.

בהתבסס על ממצאים אלו נצפו במערכות ביטוי Heterologous, כאן אנו מתארים את השימוש בביטוי HSV בתיווך של mGlu2 wild-type mGlu2 / mGlu3 בונה כימרי בקליפת המוח הקדמית של עכברים mGlu2-KO לבחון האם היווצרות heteromeric בין 5-HT _2A ו mGlu2 הכרחיראש עווית התנהגות מושרה על ידי אגוניסטים לקולטן הזית 5-HT _2A.

Protocol

הערה: כל הנהלים לרבייה החי אכפת נערכו על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הסדרת אייקן הספר לרפואה הר סיני. הקפד להשתמש בכפפות סטריליות לאורך כל ההליך.

תרופות וירוסים 1. הכנה

1. הכנת תרופות
   1. הכן 15.0 מ"ל קטמין / xylazine הרדמה ידי המסת 1.35 מ"ל של 100 מ"ג / מ"ל ​​קטמין ו 0.75 מ"ל של 20 מ"ג / xylazine מ"ל ב 12.9 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%. לערבב ביסודיות פתרון.
2. הכנת וירוס
   1. לשכפל את mGlu2 ו mGlu2ΔTM4N בונה לתוך וירוס הרפס סימפלקס bicistronic (HSV) וקטור בא פרוטוקולים סטנדרטיים שתוארו לעיל ^6. ארוז את חלקיקים נגיפיים כפי שתואר לעיל ^6,13,14. חילוף של שאריות עלא-677 ^4.40, עלא-681 ^4.44 ואת Ala685 ^4.48 ב mGlu2 עבור Ser686 ^4.40, Ph^4.44 e690 ו גלאי-694 ^4.48 ב mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) תוארו בעבר ^6.
      הערה: זה הודגם בעבר שהמבנה כימרי HA-mGlu2ΔTM4N מתבטאת קרום הפלזמה עם שלם G חלבון תלוי איתות ^6.
   2. אחסן וקטורים ויראליים ב -80 ° C כאשר אינו בשימוש. וקטור ויראלי להפשיר על הקרח, ולאחר מכן aliquot לתוך 10 aliquots μl. עבור ההליך הכירורגי, ולשמור על הקרח.

2. כירורגיה

1. הכנת חדר ניתוח
   1. לשקול עכבר להזריק עכבר עם מינון מתאים של קוקטייל קטמין / xylazine (לפרטים ראה 1.1.1).
   2. בדוק עכבר כדי לראות אם מורדם כראוי, לסחוט רגל וזנב לתגובת כאב, אם אין אפשרות לבצע לעורר תגובה, העכבר הוא מורדם כראוי.
   3. לגלח עכבר ראש מבסיס הגולגולת עד קצה האף באמצעות קוצץ. החל ג'ל עיניים אל af העכברterward למנוע עיוורון של העכבר.
   4. טען מזרק אחד על מסגרת stereotaxic. ואז להטות חלק בניצב של כל זרוע של המסגרת stereotaxic כך שהם 10 מעלות מן הרגיל. ודא כי הזרועות מוטות, כך המחטים זה מול זה.
   5. נקה מזרק אחד על ידי מילוי את המחט עם אתנול 70%. מלא את המחט לפחות שלוש פעמים כדי לוודא כי המזרק נקי.
   6. לאחר המחט נוקתה, לשטוף את המחט על ידי מילוי את המחט עם כפול מזוקקי H ₂ O. לאחר סמוק, ממלא כל מחט עם 1.3 μl של H המזוקק פעמים ₂ O. לסובב את הבוכנה של המזרק כדי לשחרר 0.3 μl של H המזוקק פעמים ₂ O. אם חרוזי מים על קצה המחט, בזהירות לנגב מים. אם שום דבר לא יוצא של המזרק, לדחוף את הבוכנה לגמרי למטה ולאחר מכן חזור על ניקוי של מזרק.
   7. לאחר מילוי עם מים, ואז למשוך את המזרק ממלא את המזרק עם0.5 μl של אוויר.
   8. ברגע שהאוויר והמים הם בתוך המזרק, למלא את המזרק בזהירות עם 1.3 μl של פתרון וירוס. בשלב זה להבטיח כי הנפח הכולל בתוך המזרק הוא 2.8 μl. שוב לסובב את קצה המזרק לשחרר 0.3 μl של הנגיף. אם חרוזי נזילות קצה המחט, בזהירות למחות נוזלי. אם שום דבר לא יוצא של המזרק, לדחוף את הבוכנה לגמרי למטה ולאחר מכן חזור על ניקוי של מזרק.
2. כִּירוּרגִיָה
   1. הצמד את העכבר על מסגרת stereotaxic, והקפד להתאים את מסגרת stereotaxic כך הגולגולת היא ברמה ושטוחה. החל povodine-יוד על הקרקפת החשופה. באמצעות אזמל, לעשות חתך sagittal לאורך קו האמצע של הגולגולת בתוך האזור המגולח החשוף. ואז לצרף את מהדק buret על העור במקום החתך לוודא כי הגולגולת נשאר חשוף.
   2. השתמש H ₂ O ₂ כדי לפזר משם את periosteum לחשוף את התפרים שלגולגולת. עכשיו כי גבחת והתפרים גלויות, הקפד להתאים את מסגרת stereotaxic לוודא כי הגולגולת היא ברמה.
   3. יישר את הטיפים מחט של מזרקים עם גבחת ולהקליט את הקואורדינטות של גבחת. לחשב את הקואורדינטות של איפה מחטים הולכים להיות מוכנס.
      1. עבור המטוס המקורי-Cauldal (RC), להוסיף 1.6 מ"מ לקואורדינטות גבחת RC רשמו (1.6 מ גבחת). עבור המטוס הגבי-הגחון (DV), לחסר 2.4 מ"מ מן הקואורדינטות גבחת DV רשמה (-2.4 מ גבחת).
      2. לבסוף, עבור לרוחב המדיאלי (ML) מטוס, להוסיף 2.6 מ"מ לקואורדינטות גבחת ML רשמה (2.6 מ גבחת). עבור כל הקואורדינטות הקפידו להקליט הן קואורדינטות על ימין ועל שמאל, שכן פעולה זו מהווה הזרקה דו-צדדית.
   4. תביא את המחטים לקואורדינטות הרצויות. סמן את המקומות היכן המחטים הולכות להיות מוכנסות עם מקדחה, לקדוח באזורים המסומנים.
   5. עם wi המוליך כותנה טיפpe משם כל שבר דם או עצם עודף.
   6. תביא את המחטים לגולגולת שבו קצות המחטים נגיעת פני השטח של המוח. ואז להוריד את המחטים לקואורדינטות הרצויות הורידו אותם לאט.
   7. לאחר המחטים נמצאות הקואורדינטות הרצויות, לאט להזריק את תכולת המזרק על ידי סיבוב הבוכנה של 0.1 μl המחט לדקה במשך 5 דקות (ב 0.5 μl בסך הכל).
   8. לאחר ההזרקה נעשתה לעזוב את המזרק בקורטקס לעוד 5 דקות.
3. סגירת השכמה / טיפול
   1. הסר את המחטים מהקורטקס עכבר בהתמדה ובאיטיות. ואז להסיר את העכבר מהמסגרת stereotaxic.
   2. החל cyanoacrylate (דבק עורי) אל דשי בסיס של העור מפני חתך ולאחר מכן עם מלקחיים לתפוס את קפלי עור ומניחים אותם יחד.
   3. אפשר cyanoacrylate להתייבש. מניח את העכבר בכלוב על כרית חימום (כרית חימום היא אופציונלית אם Surgחבילת iCal נשמרת תחת RT של 37 מעלות צלזיוס - אחרת לא הכרחי). הקפידו למקם את העכבר על מגבת נייר כדי לוודא כי מצעים לא לדבוק באתר כירורגית.
   4. בהתאם לאורך של ההליך הכירורגי, להבטיח כי העכברים הם מהרדמה בתוך 30 - 60 דקות לאחר הליך. לאחר הניתוח, החיה מושם בכלוב משלה במעקב עד שהוא הופך מודע לפני החזרה לחדר שלה להתאושש. אין משככי כאבים משמשים שלאחר ניתוח, משום שהם עשויים לשנות את התוצאות של הניסויים שלנו על ידי שינוי חלק הביוכימיים במוח. עם זאת, בעלי חיים מנוטרים עד שהם להתאושש מן ההרדמה ביום הניתוח, ופוסט מבצע יומי סימנים של זיהום והערכה של כאב / מצוקה.

3. ניסוי תגובת עווית הראש

1. להכין
   1. לבצע את כל בדיקות התנהגותיות 10:00-14:00, 2 - 3 ימים לאחר stereotaהזרקת ctic של חלקיקים נגיפיים.
   2. ממיסים (±) -1- (2,5-dimethoxy-4-iodophenyl) hydrochloride -2-aminopropane (DOI) לתוך תמיסת מלח 0.9% עד 2.0 מ"ג / ק"ג. כמו כן להכין תמיסת מלח 0.9%.
   3. הכינו בכלוב בבית (28 x 18 x 15 ס"מ) ללא כל המצעים ושימוש-pod תלת, התאמת המצלמה כך שהנוף מצלמת וידאו היא ישירות מעל לכלוב בבית.
   4. להרגיל העכברים לחדר לפחות 4 שעות לפני תחילת הניסוי.
   5. הגדרת מצלמת וידאו כדי להקליט את עווית הראש.
2. לְנַסוֹת
   1. מקם את המצלמה כך שזה בדיוק מעל כלוב הביתה. כייל את המצלמה כך את הכלוב הביתה כולו נמצא בשדה הראייה.
   2. לשקול העכבר להזריק עכבר intraperitoneally עם המינון המתאים של תמיסת מלח או 0.9% או DOI (0.01 מ"ל / g). הערה: אם עכבר שוקל 25 גרם, לנהל המינון כדי בהיקף כולל של 0.25 מ"ל.
   3. מניח כל עכבר לכלוב ביתם FOr 10 דקות. לאחר 10 דקות, העכבר במקום למרכז את הכלוב הביתה בידיים ולאמת שאין כתמים עיוורים בתחום הראייה של המצלמה. שיא לחץ על מצלמת וידאו. עזוב את החדר.
      הערה: תנועות עכבר ותגובות התנהגותיות שונות בה (... הראש להתעוות, שריטת אוזן, וכו 'עיין נוסף לנתונים בטבלה 1 של גונזלס-Maeso ואח 2007 רשימה מלאה של תגובות התנהגותיות מושרה על ידי DOI) ^3, יתועד עבור 30 דק '. לכן, חשוב אין כתמים עיוורים בתחום המבט המוקלט.
   4. לאחר 30 דקות לעצור את ההקלטה על העכבר המצלם ומקום לכלוב בית המקורי. חזור על תהליך זה עבור כל עכבר.
3. סקירה
   1. יש כל בחינת שופט הקלטות עיוורות תנאי הניסוי של עכבר (כלומר., תרופות המשמשות במהלך הראש להתעוות ניסוי או וירוס שימוש במהלך הזרקה תוך גולגולתי)). ידני להקליט כל ראש להתעוות througHout הוידאו.
      הערה: ראש-עווית מוגדרת כתנועת ראש הטלטול מהירה שערכה עכבר (וידאו משלים).
   2. עבור כל עכבר, ממוצע תגובת HTR הסופית משלושת הסיכומים של השופטים העיוורים. לאחר מכן קבץ ערכים אלה על ידי תנאי הניסוי ולבצע ניתוח סטטיסטי (כלומר., מבחן t או ANOVA).

Results

ממצאים קודמים מראים כי ראש-עווית תגובה התנהגותית בעכברים הוא באמינות וחסונה שהושרו על ידי הזיה, והיא נעדרת 5-HT _2A -KO עכברים ^3. יתר על כן, הוכיח כי תגובת ראש העווית שהושרה על ידי אגוניסטים _2A 5-HT הזית DOI ו LSD ירדה משמעותית mGlu2-KO עכברים ^5. עם זאת, למרות ממצאים קודמים משכנעים להוכיח כי 5-HT _2A ו mGlu2 מורכבים כמתחם heteromeric במבחנה בתאים transfected ^1,2,15, אם סדר מבנ...

Discussion

יחד עם ממצאים קודמים mGlu2-KO עכברים ^5, את התוצאות עם mGlu2 ו mGlu2 / mGlu3 בונה כימרי כי לא יוצרים במתחם הקולטן 5-HT _2A -mGlu2 בתאים בתרבית מראים כי _2A 5-HT -mGlu2 מורכב קולטן heteromeric ב קליפת המוח הקדמית העכבר יש צורך להשרות התנהגות ראש עווית על ידי אגוניסטים לקולטן _2A 5-HT הזיה דמויי LSD. הגבלה של שיטה זו היא שהיא אינה מודדת קרובה קרבה מולקולרית ברמת subcellular ברקמת ילידים. בנוסף, יש נקודות קריטיות שונות שיירשמו. בגלל העכברים מוז...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mGlu2 וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV)	MIT Core		mGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף ניתן לפנות למנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)
mGlu2Δ TM4N וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV)	MIT Core		mGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף, אנא צרו קשר עם מנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)
GFP וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV)	MIT Core		mGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף ניתן לפנות למנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)
קסילזין	רשימת לויד	מס' 4811-20 מ"ל, NADA #139-236, קוד NDC: 61311-481-10	1.35 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל) + 0.75 מ"ל קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) מדוללים ב-12.0 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%
קטמין	Vedco	KetaVed-10ml, NADA #200-029, קוד(ים) NDC: 50989-161-06	1.35 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל) + 0.75 מ"ל קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) מדוללים ב-12.0 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%
ג'ל עיניים	Fisher Scientific	NC0550805
Burret clips	Fisher Scientific	NC9268369
להב כירורגי נוצות	Fisher Scientific	NC9032736
מימן מי חמצן	פישר סיינטיפיק	19-898-919
מזרק המילטון	פישר סיינטיפיק	14815203
Hamilton™ מחטים נשלפות רכזת קטנה (33 Ga)	Fisher Scientific	14816206
אלחוטי מיקרו מקדחה	Fisher Scientific	NC9089241
Dermabond דבק עורי	Fisher Scientific	NC0690470
(±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI)	Sigma-Aldrich	42203-78-1	מומס בתמיסת מלח של 0.9% לריכוז של 2.0 מ"ג/ק"ג