Method Article

HSV בתיווך ביטוי transgene של מבנים Chimeric ללמוד לתפקד ההתנהגות של Heteromers GPCR עכברים

DOI:

10.3791/53717

⸱

July 9th, 2016

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neurology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר כיצד להזריק וקטורים ויראליים לתוך קליפת המוח הקדמית בעכבר כדי לבדוק מבחני התנהגות הדורשים heteromeric היווצרות GPCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קומפלקס הקולטנים ההטרומרי בין 5-HT2A ל-mGlu2 היה מעורב בחלק מהפנוטיפים ההתנהגותיים במודלים של פסיכוזה בעכברים1,2. כתוצאה מכך, חקירת פרטים מבניים של האינטראקציה בין 5-HT2A ו-mGlu2 המשפיעים על התנהגויות הקשורות לסכיזופרניה מייצגת כלי תרגומי רב עוצמה. כפי שהוצג קודם לכן, תגובת עווית הראש (HTR) בעכברים נגרמת על ידי סמי הזיה ותגובה התנהגותית זו נעדרת בעכברי נוקאאוט 5-HT2A (KO)3,4. בנוסף, על ידי ביטוי מותנה של קולטן 5-HT2A רק בקליפת המוח, הוכח כי מסלולי איתות תלויי קולטן 5-HT2A על נוירונים פירמידליים בקליפת המוח מספיקים כדי לעורר התנהגות של עווית ראש בתגובה לתרופות הזיה3. לבסוף, הוכח כי התגובה ההתנהגותית של עווית הראש הנגרמת על ידי סמי ההזיה DOI וחומצה ליסרגית דיאתילאמיד (LSD) מופחתת באופן משמעותי בעכברי mGlu2-KO5. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-mGlu2 נחוץ לפחות בחלקו להשפעות התנהגותיות דמויות פסיכוזה תלויות בקולטן 5-HT2A הנגרמות על ידי סמים דמויי LSD. עם זאת, זה לא מספק ראיות האם קומפלקס הקולטן 5-HT 2A-mGlu2 נחוץ לפנוטיפ התנהגותי זה. כדי לענות על שאלה זו, נעשה שימוש במבנים של וירוס הרפס סימפלקס (HSV) כדי לבטא mGlu2 או mGlu2ΔTM4N (מבנה כימרי mGlu2/mGlu3 שאינו יוצר את קומפלקס הקולטן 5-HT2A-mGlu2) בקליפת המוח הקדמית של עכברי mGlu2-KO כדי לבחון אם קומפלקס הטרומרי GPCR זה נחוץ להשפעות ההתנהגותיות הנגרמות על ידי תרופות דמויות LSD6.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזיה, כגון LSD, פסילוסיבין מסקלין לגרום לשינויים משמעותיים בתודעה האנושית, קוגניציה ורגש 7-9. איון של איתות קולטן הסרוטונין 5-HT 2A באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות גורם נחלש במידה ניכר תגובות התנהגותיות הזיה בשני המודלים המכרסמים 3,10 ובני אדם 11. למרות הזיה לאגד תת קולטן אחר 8, הקולטן 2A 5-HT נחשב הכרחי לפעילות התנהגותי הייחודית של הכימיקלים האלה.

קבוצת II קולטני גלוטמט metabotropic (כלומר., MGlu2 ו mGlu3) היה היעד של תשומת לב רבה לגבי המנגנון המולקולרי של הזיה לבין התפקיד האינטגרלי ש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הנהלים לרבייה החי אכפת נערכו על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הסדרת אייקן הספר לרפואה הר סיני. הקפד להשתמש בכפפות סטריליות לאורך כל ההליך.

תרופות וירוסים 1. הכנה

  1. הכנת תרופות
    1. הכן 15.0 מ"ל קטמין / xylazine הרדמה ידי המסת 1.35 מ"ל של 100 מ"ג / מ"ל ​​קטמין ו 0.75 מ"ל של 20 מ"ג / xylazine מ"ל ב 12.9 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%. לערבב ביסודיות פתרון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ממצאים קודמים מראים כי ראש-עווית תגובה התנהגותית בעכברים הוא באמינות וחסונה שהושרו על ידי הזיה, והיא נעדרת 5-HT 2A -KO עכברים 3. יתר על כן, הוכיח כי תגובת ראש העווית שהושרה על ידי אגוניסטים 2A 5-HT הזית DOI ו LSD ירדה משמעותית mGlu2-KO עכברים 5. עם זאת, למרות ממצאים קודמים משכנעים להוכיח כי 5-HT 2A ו mGlu2 מורכבים כמתחם heteromeric במבחנה בתאים transfected 1,2,15, אם סדר מבנ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יחד עם ממצאים קודמים mGlu2-KO עכברים 5, את התוצאות עם mGlu2 ו mGlu2 / mGlu3 בונה כימרי כי לא יוצרים במתחם הקולטן 5-HT 2A -mGlu2 בתאים בתרבית מראים כי 2A 5-HT -mGlu2 מורכב קולטן heteromeric ב קליפת המוח הקדמית העכבר יש צורך להשרות התנהגות ראש עווית על ידי אגוניסטים לקולטן 2A 5-HT הזיה דמויי LSD. הגבלה של שיטה זו היא שהיא אינה מודדת קרובה קרבה מולקולרית ברמת subcellular ברקמת ילידים. בנוסף, יש נקודות קריטיות שונות שיירשמו. בגלל העכברים מוז.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R01MH084894 השתתף במימון מחקר זה. ברצוננו להודות בני זוג. יסמין הרד וסקוט רוסו בהר סיני הספר לרפואה על התרומה של עכברי השימוש במתקני הניתוח והתנהגותם במהלך הצילומים של עבודה זו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mGlu2 וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV) MIT CoremGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף ניתן לפנות למנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)
mGlu2Δ TM4N וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV) MIT CoremGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף, אנא צרו קשר עם מנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)
GFP וקטור וירוס הרפס סימפלקס ביציטרוני (HSV) MIT CoremGlu2 ו-mGlu2DTM4N שובטו לתוך וקטור הנגיף הביסיסטרוני HSV-GFP p1005+ HSV המבטא GFP תחת שליטת מקדם ה-CMV. חלקיקים נגיפיים הופקו על ידי מתקן הליבה הנגיפי במכון מקגוורן (MIT). למידע נוסף ניתן לפנות למנהלת ד"ר רחל נווה (rneve@mit.edu)
קסילזין רשימת לוידמס' 4811-20 מ"ל, NADA #139-236, קוד NDC: 61311-481-101.35 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל) + 0.75 מ"ל קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) מדוללים ב-12.0 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%
קטמין VedcoKetaVed-10ml, NADA #200-029, קוד(ים) NDC: 50989-161-061.35 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל) + 0.75 מ"ל קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) מדוללים ב-12.0 מ"ל של תמיסת מלח 0.9%
ג'ל עינייםFisher ScientificNC0550805
Burret clipsFisher ScientificNC9268369
להב כירורגי נוצותFisher ScientificNC9032736
מימן מי חמצןפישר סיינטיפיק19-898-919 
מזרק המילטוןפישר סיינטיפיק14815203
Hamilton™ מחטים נשלפות רכזת קטנה (33 Ga)Fisher Scientific14816206
אלחוטי מיקרו מקדחהFisher ScientificNC9089241
Dermabond דבק עוריFisher ScientificNC0690470
(±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI)Sigma-Aldrich42203-78-1מומס בתמיסת מלח של 0.9% לריכוז של 2.0 מ"ג/ק"ג

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fribourg, M., et al. Decoding the Signaling of a GPCR Heteromeric Complex Reveals a Unifying Mechanism of Action of Antipsychotic Drugs. Cell. 147 (5), 1011-1023 (2011).
  2. Gonzalez-Maeso, J., et al. Identification of a ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GPCR HeteromersHSV Transgene ExpressionFrontal Cortex InjectionHead Twitch ResponseStereotactic SurgerymGlu2 Knockout Mice5 HT2A ReceptorBehavioral PhenotypesImmunocytochemistryWestern Blot

Related Articles