מאמר שיטה

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

DOI:

10.3791/53743

⸱

16 במרץ 2016

 ,  , 
1Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך ההתפתחות העצבית, אקסונים גדלים מתרחבים למספר שותפים סינפטיים על ידי הרחבת ענפים אקסונליים. הסתעפות אקסון מקודמת על ידי רמזי הנחיה חוץ-תאיים כמו נטרין-1 ומביאה לעלייה דרמטית בשטח הפנים של קרום הפלזמה האקסונלי. הסתעפות אקסון תלויה ב-Netrin-1 כרוכה ככל הנראה בבקרה זמנית ומרחבית של התרחבות קרום הפלזמה, שמרכיביה מסופקים באמצעות איחוי שלפוחית אקסוציטית. לאירועי היתוך אלה קדמה היווצרות קומפלקסים של SNARE, הכוללים V-SNARE, כגון VAMP2 (חלבון ממברנה 2 הקשור לשלפוחית), ו-t-SNAREs של קרום פלזמה, סינטקסין-1 ו-SNAP25 (חלבון 25 הקשור לסינפטוזומלי). מפורט כאן הוא גישה רב-כיוונית המשמשת לבחינת תפקידה של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסון. כוחה של הגישה המשולבת הוא רכישת נתונים במגוון רזולוציות מרחביות וזמניות, החל מהדינמיקה של אירועי איחוי שלפוחית בודדת בנוירונים בודדים ועד להיווצרות מורכבת SNARE והסתעפות אקסונים באוכלוסיות של נוירונים מתורבתים. פרוטוקול זה מנצל גישות ביוכימיות מבוססות לבדיקת רמות של קומפלקסים אנדוגניים של SNARE ומיקרוסקופיה של פלואורסצנציה פנימית כוללת (TIRF) של נוירונים בקליפת המוח המבטאים VAMP2 המתויג עם GFP רגיש ל-pH (VAMP2-pHlourin) כדי לזהות שינויים תלויי נטרין-1 בפעילות אקסוציטית בנוירונים בודדים. כדי להבהיר את התזמון של הסתעפות תלויה ב-netrin-1, נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) של נוירונים בודדים בסדר גודל של שעות. אימונופלואורסצנציה קבועה של תאים בשילוב עם נוירוטוקסינים של בוטולינום המבקעים את מנגנון SNARE וחוסמים אקסוציטוזיס מדגים כי הסתעפות אקסון תלויה ב-netrin-1 דורשת פעילות אקסוציטית בתיווך SNARE.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכות אחרונות מצביעות על כך שהמוח האנושי מכיל 1011 נוירונים עם 1014 קשרים סינפטיים1, מה שמדגיש את החשיבות של הסתעפות אקסונים in vivo. רמזי הנחיית אקסונים חוץ-תאיים כגון netrin-1 מנחים אקסונים לשותפים סינפטיים מתאימים וממריצים הסתעפות אקסונלית, ובכך מגדילים את הקיבולת הסינפטית2-5. ארבוריזציה אקסונלית תלויה ב-Netrin-1 כרוכה בהרחבה משמעותית של ממברנת פלזמה6, ששיערנו שדורשת אספקה של רכיבי ממברנה נוספים באמצעות היתוך שלפוחית אקסוציטית תלוי קומפלקס SNARE7.

חקירת התפקיד של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסון תלויה ב-netrin-1 מסובכת על ידי מספר גורמים. ראשית, ההטרוגניות של נוירונים בקליפת המוח מגדילה את גודל המדגם הנדרש לזיהוי השפעות משמעותיות, מה שמסבך טכניקות של תא בודד כמו הדמיה. שנית, למרות שטכניקות ביוכימיות מאפשרות תצפית על שינויים המתרחשים ברמת האוכלוסייה, הן חסרות את הרזולוציה הזמנית והמרחבית הדרושה כדי למקם את התרחבות קרום הפלזמה לאקסון במסגרת הזמן של הסתעפות האקסון. לבסוף, למרות שענפי אקסון נוצרים במשך שעות, השינויים התאיים התורמים להתפשטות אקסונלית עשויים להתחיל תוך דקות ולהתרחש בסדר גודל של שניות, ובכך להרחיב את הטווח הזמני לשיקול ניסוי.

אנו מתארים גישה רב-טכנית המתייחסת לסקאלות הזמן והמרחב המגוונות הללו של אקסוציטוזיס והסתעפות אקסונים, ובכך משפרת את הבנתנו את המנגנונים התאיים הבסיסיים. שימוש בגישות אלה מספק ראיות התומכות בתפקיד קריטי לאקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרה של אתיקה של מחקר: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים המפורטים כפופים לכללים והתקנות של ועדת UNC על טיפול בבעלי חיים בסטנדרטים NIH לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת ציפוי של נוירונים ניתק קורטיקלי

  1. להרדים נשים בהריון בעיתוי משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. סר המוח כולו מן הגולגולות של 15.5 היום עוברי (E15.5) הקורטקס עכברי microdissect מן אונה כל. לקבלת הוראות מפורטות לגבי microdissection של קליפת עכבר עוברית עיין Viesselmann ואח 8.
  2. מניחים לא יותר מ -4 הקורטקס ב 1 מ"ל של התקשורת לנתח בתוך microtube 1.6 מ"ל סטרילי. להוסיף 120 μl של 10x טריפסין להפוך את הצינור 3 - 5 פעמים כדי לערבב.
  3. באמצעות hemocytometer, לספור תאי זרע מנות תרבית תאים. הערה: 1 בחצי הכדור קליפת המוח מספק approximately שלוש מיליון תאים.
    1. עבור assay SDS עמיד המלכודת ביוכימיה המורכבת, צלחת שישה מיליון תאים לכל 35 צלחת מ"מ ולנצל שתי מנות לכל מצב. הערה: זו היא פשוטה באמצעות 6 צלחות גם כאשר משווים תנאים מרובים.
    2. עבור מבחני הסתעפות, נוירונים צלחת על חומצה חנקתית שטף coverslips עגול בצפיפות של 250,000 תאים לכל 35 מ"מ צלחת, הדמיה דסק"ש של צלחת הסתעפות האקסון בצפיפות של 150,000. צפיפויות אלו נמנעות צפיפות ולפשט ניתוח.
  4. עבור מיקרוסקופיה TIRF תא חי, resuspend שני מיליון נוירונים לכל transfection בתמיסה nucleofection ב RT.
    1. הוספת 100 μl של ההשעיה התא microtube המכיל 10 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי VAMP2-pHlourin ו electroporate עם Nucleofector פי היצרן פרוטוקול 9.
    2. לאחר transfections מייד להוסיף 500 μl של תקשורת מרווה טריפסין, להסיר השעיה מתא קובט הצליח ב מאורהצפיפות של 400,000 תאים לכל 35 מ"מ זכוכית PDL מצופה צלחת תחתית.
  5. פלייט כל נוירונים בקליפת המוח ב 2 מ"ל של תקשורת חופשית בסרום.

2. מלכודת Assay גיבוש Complex

הערה: מתחמי SDS עמידי מלכודת עובדו ונותחו כמתואר במקור 10 בשינויים המפורטים להלן. עבור נוגדנים אלטרנטיבה תוקף לאלה המשמשים כאן, עיין בסעיף חומרים.

  1. לעורר נוירונים בקליפת המוח E15.5 2 ימים במבחנה (DIV) עם 250 שליטה netrin-1 או אחיזת עיניים ng / ml עבור שעה 1 לפני תמוגה.
  2. לפני דגימות עיבוד, צנטריפוגות מגניב 4 מעלות צלזיוס, והטמפרטורה באמבט מים מוגדר 37 מעלות צלזיוס, ואת גוש חום עד 100 מעלות צלזיוס.
  3. הסר מנות תא מן החממה ומניח על קרח.
    1. התקשורת לשאוב מתאי, להחליף עם ~ 2 בופר פוספט קר מ"ל קרח (PBS) בעדינות 2 פעמים במשך 1 - 2 דקות לכל לשטוף.
    2. עבור assay זה, השתמש 2 בארות לכל מנצחition.
    3. לשאוב PBS מן הבאר הראשונה של מצב ולהחליף עם 250 חיץ המגון μl. השאר על קרח למשך 5 דקות, ולאחר מכן באמצעות מרים תא, homogenize תא על קרח.
    4. לשאוב PBS מהבאר הבאה של אותו המצב ומוסיף את התערובת הומוגני לאחרונה אל הבאר. זה יגביר ריכוזי חלבון. חזור על הפעולה עבור כל תנאי.
    5. בסיום, פיפטה הומוגני פתרון microtube מראש מקורר 1.6 מ"ל על הקרח ולהוסיף 20% TritonX-100 כדי להגיע לריכוז סופי של 1% TritonX-100. Triturate לערבב 10 פעמים עם 1,000 פיפטה μl תוך מזעור בועות.
  4. דגירת צינורות על קרח במשך 2 דקות כדי solubilize חלבונים. לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 6,010 RCF ב 4 ° C עד גלולת חומר שאינו solubilized. הזז supernatant lysate לתוך צינור 1.6 מ"ל מקורר חדש על הקרח.
  5. ביצוע ניתוח ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד 11 ו לדלל דגימות פינהריכוז l חלבון של 3 - 5 מ"ג / מ"ל ​​עם הנותרים חיץ המגון בתוספת 1% TritonX-100 לבין חיץ מדגם 5x בתוספת B-Mercaptethanol (BME).
  6. מחלקים כל מדגם ניסיוני שווה ל -2 צינורות. דגירת מדגם אחד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (מתחמי מלכודת), והשני ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (מונומרים מלכודת). היפוך צינורות לסירוגין לשמור דגימות בתמיסה.
  7. להקפיא דגימות ב -20 ° C עד מוכן להפריד באמצעות SDS-PAGE. לפני הפעלת דגימות באמצעות אלקטרופורזה באמצעות טכניקות סטנדרטיות, להרתיח מחדש דגימות מבושלות בעבר במשך 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס, אך להפשיר 37 ° C דגימות ב RT.
  8. כפילויות הפעל של דגימות (30 - 40 מיקרוגרם חלבון לכל מדגם) משני 8% ו ג'ל 15%; 8% מספקים הפרדה אידיאלית של המתחם, ואילו 15% משמשים לכמת מונומרים חלבון מלכודת (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kDa). לשמור על מקור כוח ב 70 V עד קו הצבע הוא דרך stacהמלך ג'ל ומתח עליה כדי 90V. הפעל ג'לים עד לצבוע בורח.
  9. כדי לשמר מונומרים, להעביר חלבונים 0.2 מיקרומטר קרום nitrocellulose על הקרח באמצעות חיץ העברת קר עם 20 מתנול% (MeOH) הוסיף, ב 70 V עבור 45 דקות.
  10. קרום יבש בצלחת מכוסה במשך שעה 2 ל O / N ב RT (O / N מספק את התוצאות הטובות ביותר).
  11. בלוק המלכודת ממברנות מורכבים ב 10% שור סרום אלבומין (BSA) במשך שעה 1 ב RT.
  12. כן נוגדנים ראשוניים (הכרת רכיבים מורכבים ספציפיים מלכודת) בדילול של 1: 1,000 ו חללית O / N ב 4 ° C על שייקר רוטרי.
    1. לשטוף כתמים טריס בופר בתוספת 0.1% Tween-20 (TBS-T) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  13. הכינו פתרונות נוגדנים משני ניאון בדילול של 1: 20,000 ב BSA 1% ב TBS-T ו- בדיקה עבור שעה 1, מכוסה ב RT. 2.12.1 חזור על שלב אחרי 1 hr.
  14. כתמי תמונה על במכונת שיקוף פלואורסצנטי מצוידים חבילת תוכנות ולכמת הוא שיתוף חלבון המלכודתmplex (להקות immunoreactive מעל 40kDa) ולהקות מונומר (להקות immunoreactive ב 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa עבור SNAP-25, VAMP2 ו syntaxin-1, בהתאמה) באמצעות הוראות היצרן עבור ציור ROIs מלבני.

3 אירועים הדמיה Exocytic באמצעות מיקרוסקופית TIRF

הערה: פרוטוקול זה דורש ציוד מיקרוסקופיה מיוחד כולל בתא סביבתי כדי לשמור על טמפרטורה, לחות ו- CO 2, מיקרוסקופ TIRF הפוך מצויד תאורת epifluorescent, בהגדלה גבוהה / צמצם מספרי גבוה (NA) מטרת TIRF, שלב XYZ אוטומטי, ו מכשיר תשלום מצמידים רגיש (CCD) גלאי. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ הפוך אוטומטי לחלוטין מצויד 100x 1.49NA TIRF מטרת ליזר מדינת 491 ננומטר מוצק ו CCD הכפלת אלקטרונים (EM-CCD). כל הציוד נשלטת על ידי תוכנות שליטה הדמיה לייזר. לפני תחילת כוח פרוטוקול הדמיה על envirקאמרית, במת onmental, מנורה, מחשב, ואת המצלמה.

  1. מטרה בחר בתוך תוכנת הדמיה. ברגע המטרה היא במקום, להדק את דוד המטרה מסביב לצווארון.
  2. אשר המטרה כי הוא הוריד לגמרי לפני הבטחת החממה הבמה בחריץ הבמה. יוצקי מים מזוקקים לתוך פתחי כניסת חממת הבמה באופן שווה כדי למנוע דליפה.
  3. הפעל את מערכת הדגירה. פתח את השסתום אל טנק CO 2 ולאשר את הלחץ הוא מתאים למערכת לפי הוראות יצרן. אפשר קאמרי קצת זמן להגיע 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. לפני הוספת מנת ההדמיה, למקם קערה ריקה בחממה כדי למנוע התעבות מים על המטרה.
  4. כוח על מקור לייזר.
  5. חממה במה פתוחה ולהוסיף שמן טבילה העדשה. מניחים מדגם באינקובטור ולייצב בזרועות יציבות או משקל המנה. הרם את המטרה עד שהשמן הופך במגע עם החלק התחתון של המדגם. switch כדי תאורת אור המועבר ולמצוא מישור מוקד עצבי דרך oculars.
  6. התחל תוכנה לייזר ולהתחבר תוכנות שליטה לייזר. הגדר תאורה כדי widefield ובחר את המטרה בשימוש (1.49 100X NA TIRF מומלץ). מקדמים שבירת גדר של המדגם (תאים ~ 1.38). התאם עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון "תקשורת" עבור לייזר 491 ננומטר. התאם את המחוון 100 ואז להביא אותה בחזרה למטה לערך בין 20 - 40%. בדוק שוב "TTL".
  7. פוקוס על מדגם שוב תאורת אור מועברת. עבור אל תוכנת הדמיה ובחר 491 ננומטר תאורה לייזר תריס פתוח. פיין להתאים את נקודת המוקד של לייזר על התקרה ומרכז את הצבע על מרכז הסרעפת שדה סגור עם הקבל הסיר. מניח קבל במהופך על הספסל האופטי, כדי לא עדשה מאפסת.
  8. חלף קבל וללכת תוכנת TIRF ועומק חדירה להגדיר (PD) ל -110 ננומטר. עבור מ- תאורה widefield כדי TIRF תאורה פנימיתמצב ination הדמיה.
  9. מצא VAMP2-pHluorin לבטא בתאי דרך oculars באמצעות epifluorescence widefield עם מקור האור epifluorescent.
    1. להתאים את הפרמטרים הדמיה (זמן חשיפה, רווח וכוח לייזר) על מנת למקסם יחס אות לרעש וטווח דינמי באמצעות זמן חשיפה מינימלית עוצמת הלייזר כדי להפחית photobleaching ו phototoxicity (למשל: חשיפה בין 50 - 100 msec, עם -15 - 30 רוכש 30% כוח ליזר מרבי).
    2. פוקוס אוטומטי רציף גדר לכל תא. רכישה לרכוש תמונת timelapse משובצת המתרחשת כל 0.5 שניות למשך 5 דקות. עבור תנאי מגורה-1 netrin, להוסיף 500 netrin-1 ng / ml כדי צלחת של תאים במנדף זרימה למינרית ולהחזיר את התבשיל כדי בחממה במשך שעה 1 לפני הדמיה.
  10. כדי לכמת את תדירות אירועי exocytic מנורמלים ליחידת שטח תא וזמן, ערימות תמונה פתוחות ImageJ ידי גרירת הקובץ לתוך החלון או מעבר אל הקובץ> פתח> שם קובץ (איור0; 2A הבלעה 1).
    1. כדי להסיר אותות ניאון יציבה שאינו מייצג אירועי איחוי שלפוחית, ליצור הקרנת z ממוצעת של הערימה כולה באמצעות תמונה> סטאק>-Project ת '> סוג הקרנה: עצמה ממוצעת. הפחת תמונה זה אומר מ לכל תמונה ב- timelapse באמצעות תהליך> מחשבון תמונה> Image1: מבצעת המחסנית שלך: נפחית Image2 הקרנת z ממוצע חדש שנוצרה. זה מדגיש אירועים exocytic (איור 2 א הבלעה 2 - 3).
    2. רוזן אירועי היתוך exocytic לפי עין. אירועים Exocytic מוגדרים כמו המראה של אות הקרינה מוגבל עקיפה, אשר מפזרת במהירות VAMP2-pHluorin מפזרת בתוך קרום התא (6 איור 2A הבלעה).
    3. השתמש בפקודת הסף כדי להדגיש את התמונה הראשונה באמצעות תמונה> התאם> סף> להתאים מחוון עד התא כולו הוא הדגיש סף (איור 2 א הבלעת 7 - 8).
    4. תחת אנהlyze, לבחור SetMeasurements ולבדוק באזור ותווית התצוגה. בחר את אזור הסלולר thresholded שימוש באפשרות עקיבת שרביט ו 'מ' לחץ כדי למדוד (איור 2 א הבלעת 7 - 8).
    5. העברת שני האירועים היתוך exocytic לספור, המדידות שטח התא, והזמן שחלף הדמיה לגיליון אלקטרוני לחשב מספר אירועים exocytic / 2 מ"מ / שעה (איור 2 א הבלעה 9).

4. התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) Timelapse מיקרוסקופית של אקסון מסעף

הערה: פרוטוקול מלא והדגמה עבור גישה כללית ההדמיה דסק"ש זמין 12. בעוד פרוטוקול זה מנצל דסק"ש, שיטות מיקרוסקופיה אור מסורות אחרות עשויות לשמש לאותן מטרות (למשל: לעומת שלב).

  1. בשעה 2 DIV, צלחת הדמיה תחתית זכוכית המקום המכיל נוירונים untransfected בתא מחומם מראש הסביבה לשמור על env לחironment עם 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. לנצל מיקרוסקופ מצויד עדשה אובייקטיבית 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA דסק"ש קבל NA גבוה עבור איכות תמונה הטובה ביותר ואת הפתרון.
  2. התאם את מישור המוקד למצוא נוירונים דרך oculars באמצעות תאורת אור מועברת.
  3. השימוש בפונקצית רכישת שטח רבה על תוכנת הדמיה, למצוא ולשמור את מיקומי XYZ של 6 תאים לפחות. מקם את הבמה כך נוירונים של לנכון עניין בתוך שדה הראייה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
    1. לגרות עם 250 ng / ml netrin-1 ולחץ על 'להתחיל רכישת שטח רב'. ברצף לרכוש תמונות בכל עמדה כל 20 שניות למשך 24 שעות, משתהה ברכישת refocusing לפי צורך.
  4. בדוק את התמונות בתוכנת הדמיה באמצעות Apps> סקור Multi נתונים מימדי> שם קובץ פתוח. זהה סניפי האקסון יציבים (20 מיקרומטר ארוך) הטופס כי במהלך פגישת ההדמיה. השתמש בכלי קו תיקו למדוד stableaxon branch מן הבסיס ב האקסון אל קצה על מנת להבטיח את ההסמכה אורך 20 מיקרומטר הוא נפגש.
    1. בגיליון אלקטרוני, לרשום את מספר מסגרת לאחר גירוי netrin כאשר בליטות קרום ליזום באזורים שבהם סניפים מאוחר יותר ליצור, כמו גם את מספר מסגרת לאחר גירוי netrin כאשר סניפים המתהווה להגיע ל -20 מיקרומטר באורך.
    2. להכפיל את מספר מסגרות בין בליטת היווצרות ענף ב -20 שניות כדי לחשב את זמן היווצרות לסניף.

5. מניפולציות הרעלן Immunofluoresence סלולרי קבוע

  1. בשעה 2 DIV, לטפל נוירונים בתנאי ניסוי עם 250 ng / ml netrin-1 ו / או 10 ננומטר בוטולינום טוקסין (BoNTA), אשר וחותך את SNAP25 חלבון המלכודת וביעילות מעכב בתיווך המלכודת exocytosis 13, בתוספת 250 ng / ml netrin- 1. השאר קבוצה אחת של נוירונים לא מטופל כמו מצב שליטה.
    זהירות: BoNTA מחייב שימוש עין להגנת נשימה בעת הכנה ושימושפתרונות. שמור את כל חומרים מזוהם כחומר חיטוי ביולוגי מסוכנים בהקדם האפשרי.
  2. בשעה 3 DIV (טיפול פוסט 24 שעות) התקשורת לשאוב, ומיד להחליף עם לפחות 1 מ"ל של תיקון PHEM (ראה טבלה 1 לפרטים נוספים) חימם עד 37 מעלות צלזיוס. דגירה של 20 דקות בחושך ב RT.
  3. לשטוף 3x עם PBS (עבור חותם לשימוש עתידי עם parafilm ולאחסן ב 4 ° C).
  4. coverslips מקום בתא מכתים כהה, humidified ו permeabilize קרום התא למשך 10 דקות ב 0.2% TritonX-100 בדילול הטרי PBS (עשויות 10% TritonX-100 מניות).
  5. הסר פתרון permeabilization ולשטוף עם 50 μl של 1x עם PBS. בלוק למשך 30 דקות ב ~ 50 μl של 10% שור סרום אלבומין PBS (BSA-PBS) או 10% מבושל דונקי סרום PBS ב RT.
  6. לשטוף עם 1x PBS שוב. דגירת coverslips ב 50 μl של נוגדן ראשוני (1: טובולין βIII 1,000, כדי לאשר את זהות עצבית) ב 1% BSA-PBS עבור שעה 1 ב RT, בחושך.
  7. בצע 3x 5 שטיפות דקות ב PBS. דגירה coverslips ב 50 μl של נוגדנים משני-מובחנת ספקטרלית עבור טובולין (1: 400), ו phalloidin ניאון (משתנה בהתאם עירור: 488 phalloidin ב 1: 400, 647 phalloidin ב 1: 100) ב 1% BSA-PBS עבור שעה 1 .
  8. לשטוף 3x 5 דקות 1x PBS ו הר coverslips על שקופיות במדיה גוברים.
  9. תקשורת הרכבה עודפת אבק מן הקצוות של coverslip ואת החותם עם לק ברור.
  10. איסוף תמונות epifluorescence widefield על מיקרוסקופ הפוכה עם מטרה 40X 1.4NA, יכולות epifluorescent ו-CCD EM.
    1. ידני לנתח הסתעפות באמצעות ImageJ. ערימות פתח את התמונה ImageJ ידי גרירת הקובץ לתוך חלון או מעבר אל קובץ> פתח> שם הקובץ (הבלעה 4A איור 1).
    2. באמצעות קו> קו מקוטע, להתחקות אחר האקסון, מוגדר neurite הארוך המשתרע סומה (איור 4 א ההבלעה 2 - 3).
    3. שימוש לנתח> כלים> מנהל ROI, להציל את האקסון התחקות כאזור של עניין. עקבות ולשמור בכל סניף האקסון, המוגדר מיקרומטר neurite ≥20 באורך. כולל את מערך סניפים עיקריים בלבד (בצמחי הנבטה ישירות האקסון) ב (הבלעת 4A איור 3 - 4) ניתוח.
    4. 'מ' לחץ כדי למדוד את האזורים השמורים של עניין, ולהעביר אורכי בפיקסלים לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את האורך ב מיקרומטר.
    5. מחלקים את מספר הסניפים האקסון ≥20 מיקרומטר אורך, לפי אורך של האקסון מיקרומטר מחולק 100 כדי לקבל מספר הסניפים האקסון לכל אורך 100 מיקרומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניצול טכניקות ביוכימיות במבחנה assay את כמות מתחמי מלכודת עמידה SDS בקרב אוכלוסייה של נוירונים. איור 1 מציג את הכתם מערבי וכתוצאת ההשלמה הבאה של assay SDS העמיד המלכודת המורכבת תרה אחרת SNAP-25, syntaxin1A ו VAMP2.

מיקרוסקופיה TIRF על הממברנה של התאים הבזליים מספקת תמונות ברזולוציה גבוהות של אירועי היתוך exocytic פרט תאים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסתעפות אקסונים היא תהליך נוירו-התפתחותי בסיסי והיא עומדת בבסיס הקישוריות העצבית העצומה של מערכת העצבים של היונקים. הבנת המנגנונים המעורבים בהתרחבות מקומית של קרום הפלזמה היא חלק בלתי נפרד מהבנתנו את ההתפתחות הנוירולוגית הנורמלית והפתולוגית כאחד. השימוש בגישה רב-כיוונית המשלבת מתודולוגיות ברמת האוכלוסייה וברמת התא הבודד משפר את יכולת השחזור ומגדיל את הרזולוציה המרחבית והזמנית מבלי לפגוע בניתוח רמת האוכלוסייה. ברמת התא הבודד, שימוש בגישות תאים קבועים וחיים לבחינת הסתעפות אקסונים תלויי נטרין מספק יתרון משולש: היכולת לאסוף ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות: RO1-GM108970 (SLG) ו F31-NS087837 (CW).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות מטופלות בתרבית רקמות 6 בארותOlympus Plastics25-105
כיסויי זכוכיתFisher Scientific12-545-8112CIR-1.5; יש לטפל בחומצה חנקתית במשך 24 שעות, לשטוף במי DI פי 2 ולייבש לפני השימוש. יש לצפות ב-1 מ"ג/מ"ל פולי-די-ליזין ולשטוף לפני ציפוי התאים.
תמיסת נוקלאופקציה AmaxaLonzaVPG-1001100 מ"ל/טרנספקציה
Amaxa Nucleofector/electroporatorתוכנית LonzaO-005
35 מ"מ תחתית זכוכית צלחות הדמיה של תאים חייםMatek Corporationp356-1.5-14-Cחייבות להיות מצופות ב-1 מ"ג/מ"ל פולי-די-ליזין ולשטוף לפני ציפוי התאים
אולימפוס IX81-ZDC2 מיקרוסקופ הפוךאולימפוס
Lambda LS קסנון מנורתSutter Instruments החברה
סביבתית הבמה העליונה חממהTokai Hit
100x 1.49 NA TIRF אובייקטיביאולימפוס
אנדור iXon EM-CCDAndor
Odyssey Licor מערכת הדמיה אינפרא אדוםLI-COROdyssey CL-Xמשמש לסריקת כתמים
סטודיו תמונה חבילת התוכנהLI-CORמשמשת לסריקה במערכת האינפרא אדום Odyssey; Image studio lite המשמש לניתוח לא מקוון של כתמים
Metamorph for OlympusMolecular devices, LLCגרסה 7.7.6.0תוכנה המשמשת לכל ההדמיה וניתוח של תוכנת בקרת DIC TIMELAPSE
CELL TIRFאולימפוסהמשמשת לשליטה בלייזרים להדמיית TIRF
פיג'י (תמונה J)NIHImageJ גרסה 1.49t
60x תוכנית אפוכרומט 1.4 NA מטרהאולימפוס
40x 1.4 NA תוכנית אפוכרומט אובייקטיביאולימפוס
מדיה נוירובזאליתGIBCO21103-049פתרון בסיס הן למדיה נטולת סרום והן לחומר מרווה טריפסין
תוסף B27GIBCO17504-044500 מ"ל/50 מ"ל מדיה ללא סרום וחומר מרווה טריפסין
L-גלוטמין35050-0611 מ"ל/50 מ"ל מדיה ללא סרום
אלבומין סרום בקרBio Basic Incorporated9048-46-8תמיסה של 10% ב-1x PBS לחסימת החלקות כיסוי; תמיסה של 5% ב-TBS-T לחסימת ממברנות ניטרוצלולוזה.
10x  טריפסיןסיגמא59427C
HEPESCELLGRO25-060-Cl
תמיסת מלח פוספט חוצץ (DPBS) של Dulbecco + Ca + MgCorning21-030-cm
סרום בקר עובריCorning/CELLGRO35-010-CV
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)Corning/CELLGRO20-021-CV
NaClFisher scientificBP358-10
EGTAFisher scientificCAS67-42-5
MgCl2Fisher scientificBP214-500
TRIS HClSigmaT5941-500
TRIS baseFisher scientificBP152-5
N-Propyl GallateMP Biomedicals102747
גליצרול בדרגה פוטומטריתAcros Organics18469-5000
גליצרול (לא בדרגה אופטית)פישר מדעיCAS56-81-5
B-mercaptoethonalFisher scientificBP176-100
SDSFisher ScientificBP166-500
מים מזוקקים GIBCO152340-147
פולי-D-ליזיןסיגמאp-7886מומס במים סטריליים במינון 1 מ"ג/מ"ל
בוטולינום A רעלן BoNTAList מעבדות ביולוגיות128-A
ארנב פוליקלונלי אנטי אנושי VAMP2איתות תאים11829
עכבר חד שבטי אנטי חולדה Syntaxin1Aסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-12736
עיזים פוליקלונל אנטי אנושי SNAP-25סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-7538
עכבר חד שבטי אנטי אנושי ובטא; III-טובולין CovanceMMS-435P
Alexa Fluor 568 ו-Alexa Fluor 488 phalloidin, או Alexa Fluor 647Invitrogen
LI-COR IR-dye נוגדנים משניים LI-CORP/N 925-32212, P/N 925-68023, P/N 926-68022800 חמור נגד עכבר, 680 חמור נגד ארנב, 680 חמור נגד עזים
0.2 μ m נקבוביות גודל ניטרוצלולוזה ממברנהBiorad9004-70-0
Tween-20Fisher scientificBP337-500
מתנולפישר מדעיS25426A
ברומפנול כחולסיגמאB5525-5G
סוכרוזפישר מדעיS6-212
ParaformaldehydeFisher מדעיO-4042-500
Triton-X100Fisher scientificBP151-500
TEMEDFisher scientificBP150-20
40% Bis-AcrylimideFisher scientificBP1408-1
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>אלטרנטיבי נוגדנים מאומתים
עכבר חד-שבטי אנטי-סינטקסין HPC-1 שיבוטסיגמא אולדריץ'S0664
  עכבר מונוקלונלי Synaptobrevin 2 (VAMP2)מערכות סינפטיות104-211
עכבר חד-שבטי SNAP25מערכות סינפטיות111-011
תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
  4. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  5. Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
  6. Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
  7. Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
  8. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Axon BranchingNeuronal MorphogenesisSNARE Mediated ExocytosisTIRF MicroscopyVAMP2 pHlourinDIC ImagingWestern BlotBotulinum ToxinNetrin 1 StimulationCortical Neurons

מאמרים קשורים