וירותרפיה אונקוליטית נמצאת בפיתוח כתרופות חדשניות לטיפול בקרצינומה של הכבד (HCC). כאן אנו מתארים שיטה לטיפול מקומי ב-HCC באמצעות מתן עורקי כבד של נגיף אונקוליטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Transarterial מינהל oncolytic וירוסים לטיפול Locoregional של Orthotopic HCC אצל חולדות
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרצינומה הפטו-תאית (HCC) היא מחלה עם אפשרויות טיפול מוגבלות ופרוגנוזה גרועה. בשנים האחרונות, וירותרפיה אונקוליטית הוכיחה את עצמה ככלי פוטנציאלי רב עוצמה להילחם בממאירות. בשל אספקת הדם הכפולה הייחודית בכבד, ניתן ליישם טיפולים מקומיים לגידולי כבד אורתוטופיים, הניזונים בעיקר מזרימת דם עורקית. הראינו בעבר כי העברה עורקית בכבד של נגיפים אונקוליטיים מביאה ליעילות התמרה בטוחה ויעילה של נגעי HCC מולטיפוקליים, וכתוצאה מכך הארכה משמעותית של ההישרדות בחולדות בעלות יכולת חיסונית. הליך זה מחקה מקרוב את היישום של אמבוליזציה טרנס-עורקית בחולים, שהוא הטיפול הפליאטיבי הסטנדרטי הניתן לחולי HCC רבים. היכולת לתת טיפולים בגידול דרך עורק הכבד בחולדות מאפשרת מודל פרה-קליני מתוחכם ביותר להערכת וקטורים נגיפיים חדשים בפיתוח. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט למיקרו-דיסקציה של עורק הכבד לעירוי של וקטורים של וירוסים אונקוליטיים לטיפול ב-HCC אורתוטופי.
מבוא
Hepatocellular carcinoma (HCC) הוא הסרטן החמישי הנפוץ בעולם, ואת הסיבה השלישית למוות מסרטן, מה שהופך אותו דאגה בריאותית משמעותי 1,2. עבור חולים אשר אינם זכאים כריתה של הגידול, או אלה השתלת כבד ממתינה, טיפול locoregional מעורבים אמבוליזציה transarterial (TAE) או כימואמבוליזציה transarterial (TACE) מוחלים כמו טיפול פליאטיבי תקן 3,4. טיפולים אלה לנצל את התכונה הייחודית של אספקת דם כפולה בכבד לפיה גידולים ניזונים כמעט אך ורק על ידי זרימת דם בעורקים כבדה ואילו הכבד סביב מקבל את רוב אספקת הדם שלה מעורק הפורטל 5,6.
בשל efficacies המצומצם מאוד של טיפולים הוקמו עבור HCC, וירוסי oncolytic צמחו כמו רפוי אלטרנטיבה מבטיחה. JX-594, לאחרונה את השם Pexa-Vec, הוא וקטור vaccinia thymidine-deleted קינאז, חמוש-מ גרנולוציטacrophage גורם מגרה המושבה (GM-CSF), אשר השלימה ניסוי קליני שלב II עבור HCC 7. לאחרונה, וקטור וירוס stomatitis שלפוחי רקומביננטי (VSV) להביע אינטרפרון-בטא האדם נכנס לשלב הראשון של הניסוי הקליני עבור HCC sorafenib-עקשן (NCT01628640). כמו וירוסי oncolytic להתקרב קבלת אישור עבור יישומים קליניים עבור HCC בחולים, הצורך בחיפוש אחר דרך ניהול יעיל למקד מחל מולטיפוקליות ניכרת. בעוד משלוח מערכתי אינו יעיל בדרך כלל עקב תמרת גידול יעילה, יישומי intratumoral יכולים להגביל את היעילות של הטיפול אל הגידול המוזרק, עוזבים נגעים מיקרוסקופים uninjectable רגישים התקדמות מחלה.
הקמנו שיטה לבודד את עורק הכבד בחולדות לנהל טיפול וירוס oncolytic באופן locoregional למקד HCC orthotopic. אנחנו הוכחנו כי תוצאות תוואי הממשל הזה ב לבטוח ויעילve תמרה של גושי HCC מולטיפוקליות, וכתוצאה מכך הארכת הישרדות משמעותית בחולדות מוסמכות חיסוניות 8-10. כאן אנו מתארים את השיטה של גישה, לנתח, והזרקה לעורק הכבד בחולדות. סכימה של ההליך מוצגת באיור 1 (שפורסם בעבר 9)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: השלבים הבאים בוצעו בהתאם להנחיות של המוסד שלנו ואת השלטון המקומי בוואריה, גרמניה. כל הניסיונות לשחזר פרוטוקול זה חייבים להיעשות תוך הקפדה להנחיות המקומיות לטיפול האנושי של חיות, כפי שמכתיבים טיפול בבעלי חי ועדה מקומי שימוש. לדוגמא, מוסדות רבים דורשים כי כפפות סטריליות שחוקות במהלך הניתוח מכרסם. יתר על כן, עבודה עם וירוסים חייבת להתבצע בהתאם לתקנות מקומיות, מטפל לבטיחות אישית וסביבתית. יש להקפיד בנוגע להשלכה נכונה של פסולת מזוהמת לנקות מכשירים וסביבת עבודה (כלומר, על ידי מעוקר וניקוי עם חומר חיטוי אנטי המתאימה בהתאם להוראות היצרן).
1. הכנות לפני ניתוח החל
- לעקר מכשירי ניתוח (כלומר, על ידי מעוקר).
- לדלל את הנגיף approprריכוז iate, אשר ישתנה בהתאם הרעילות של הנגיף הספציפי שבשימוש ואת הרגישות של זן העכברים.
הערה: לדוגמה, בעת שימוש וירוס שלפוחי stomatitis ב חולדות זכרים באפלו, אנחנו בדרך כלל להזריק 10 7 pfu בנפח 1 מ"ל, המהווה את מינון נסבל מקסימום במודל זה.- מלא מראש את הנגיף (באמצעות טכניקה מזוהם) ב 1 מ"ל מזרקים, ולצרף 30 מחטים G, מקפיד לחסל האוויר מן מזרק ומחט.
- מכין את השטח כירורגי עם כל החומרים והציוד הנדרשים, ולרסס את האזור עם אתנול לחיטוי. מלאו כלי קיבול קטן עם תמיסת מלח סטרילית (0.9% NaCl) עבור הרטבת מטליות גזת אוזניים.
2. הכנת העכברוש
- נהל משכך כאבים (כפי שצוין על ידי הוועדה לטיפול ולשימוש המקומית בעלי חיים), על דק המתאים 30 מנה לפני תחילת ההליך הכירורגי. לדוגמה,לנהל מינון גבוה של דיפירון (100-200 מ"ג / ק"ג).
- להרדים חולדה באמצעות אינהלציה (isoflurane) או בזריקות (כלומר, תערובת של medetomidine (0.15 מ"ג / ק"ג), Midazolam (2 מ"ג / ק"ג), ו פנטניל (0.005 מ"ג / ק"ג), הידוע גם בשם MMF) הרדמה. נהל isolflurane דרך מאדה ב 1-3% ולהתאים לפי צורך כדי לשמור על נשימה נורמלית וקצב לב.
- לפני שאתה ממשיך, להבטיח כי החולדה היא מסוממת לגמרי ולא מסוגל לחוש כאב על ידי צובט את כרית כף הרגל וההתבוננות לתגובה.
- למרוח משחת עיניים וטרינרית כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה.
- לגלח את אזור הבטן מעצם החזה עד מעל איברי המין באמצעות גוזז שיער וטרינרים קטן. תשמור על עצמך כדי להשיג גילוח קרוב מבלי לפצוע את העור.
- תקן החולדה המיטה כירורגית באמצעות קלטת על הקדמי ו hindlimbs, ואם באמצעות הרדמה משאיפת, למקם את חוטמו לתוך חרטומו כראוי בגודל. הניחו כרית חימוםמלמטה העכברוש כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. לחטא את אזור הבטן באמצעות חיטוי כיתה כירורגית, ואחריו שטיפת אלכוהול ויישום של צבע חיטוי.
3. laparotomy
- באמצעות אזמל מעוקל קטן, כגון 15 #, לעשות חתך אנכי קטן בשכבת העור ישירות לאורך קו האמצע. הרחב את החתך עד תהליך xyphoid. בשלב הבא, לחתוך את שכבת השריר על ידי הרמת בעדינות עם זוג מלקחיים Adson לעשות חתך אזמל, ולאחר מכן להרחיב את החתך עד תהליך xyphoid עם מספריים כירורגיות. תשמור על עצמך לא לנקב את האיברים של חלל הבטן או לפגוע כלי הקטן משני צדי תהליך xyphoid.
- מניחים מפשק פני הבטן כדי להפיץ את השרירים והעור ולחשוף את אזור הבטן כולו.
- להרטיב שתי מטליות גזה 7.5 x 7.5 ס"מ 2 עם תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית להפיץ אחד לרוחב החלק העליון של כירורגיתפתיחה ואחד בחלקו התחתון, כפי שמוצג באיור 2 א.
בידוד 4. של עורק הכבד
- שימוש בשתי מטליות מוליך כותנה לחלחו טבולת תמיסת מלח פיסיולוגי סטרילית, בעדינות להרים את המעיים cecum מתוך חלל הבטן, ומניח אותם על ספוגית הגזה הנמוכה. מקפל את הגזה על מנת לשמור על האיברים לחים להחזיק אותם מהדרך.
- השימוש בשתי מטליות המוליך צמר גפן טבולה, בעדינות להרים את האונה הכבדה לרוחב שמאל, אשר תהיה באונה הדומיננטית ביותר להציג בשלב זה. תהפוך את האונה כלפי מעלה, ו, באמצעות מספריים קטנים באביב, לחתוך דרך הממברנה הסיבי על החלק התחתון של האונה, המאפשר באונה להיות התהפכה לחלוטין כלפי מעלה ולנוח על גבי מקלון הגזה להציב בעבר. מקפלים את ספוגית גזה על האונה כדי להחזיקו במקום.
- המשך עם האונה הקרובה (caudate הקדמי), הנמצא כעת באונה הקדמית ביותר לאור. עם הסיוע דואר של מיקרוסקופ לנתח מלקחיים בסדר, לנתח את הקרום הדק המקיף את האונה כדי לשחרר אותו ולאפשר לו להיות התהפך בחופשיות כלפי מעלה. מניחים את האונה מתחת ספוגית גזה יחד עם האונה לרוחב שמאל.
- שימו באונה caudate האחורי, אשר כעת יהיה גלוי. חזור על שלב 4.3 לנתח את אונת caudate האחורית לחלוטין להעיף אותו כלפי מעלה בתוך הגזה יחד עם האונה של הכבד להציב בעבר.
- רק מתחת למיקום המקורי של אונת caudate, למצוא את עורק הכבד הנפוץ, אשר יהיה גלוי כעת ומוכר בקלות על ידי הפעימה החזקה שלה. בעקבות עורק ימינה אנטומיים, להתבונן בחומר קרומי העבה מסתיר העורקים הכבדים gastroduodenal ונכונים מהעין. בעזרת מלקחיים בסדר, להרים את החומר הזה בעדינות לקרוע אותו, מקפיד להימנע מכל כלי קטן בתחום הזה. השתמש מטליות מוליך כותנה לעצור דימום שעלול להתרחש.
- אתר אסניפי rterial, אשר יהיו נראות בבירור בעזרת מיקרוסקופ לנתח כאשר הקרומים הם גזורים כמו שצריכים.
- שימוש בשני מלקחיים בסדר, atraumatic, בזהירות לנתח את עורק הכבד הנפוץ, עורק gastroduodenal, ואת עורק הכבד הראוי כזה שהם משתחררים מן הקרומים המקיפים (איור 2 ב).
5. הכנה של העורק עבור הזרקה
- לעבור תפר 7-0 Prolene מתחת עורק gastroduodenal, ולהשתמש מיקרו-מחט בעל לקשור ליגטורה קבעה בקצה הדיסטלי, רק מעל ההסתעפות (ראה איור 1 עבור מיקום נכון). יש להמתין לפחות 2 אינץ 'של חומר תפר הנותר על הקצוות, ו לצבוט אותם עם בעל מחט למשוך את העורק למד, כמו באיור 2C.
- מניחים מהדק קטן על עורק הכבד הנפוצה לחסום זמנית של זרימת הדם (איור 2 ג).
הערה: זהו שדortant למנוע דימום מסיבי פעם המחט יוסרה העורק. יתר על כן, מחסימת זרימת דם בעורקים תאפשר למנהל וירוס איטי ויעילות התמרה טובה יותר.- חשוב: לעבוד במהירות כדי לצמצם את כמות הזמן כי זרימת דם נעצרת - לבצע את זריקת הקשירה הבאה של העורק תוך 5 דקות של מהדק את עורק הכבד הנפוץ.
- במידת האפשר, להגדיל את ההגדלה על מיקרוסקופ לנתח, כך העורק gastroduodenal בפוקוס חד ומופיע גדול מספיק כדי להכניס את המחט 30 G במדויק. מניחים את המחט של המזרק זריקה לתוך לומן של עורק gastroduodenal ולאט לאט לדחוף את הבוכנה.
הערה: מיקום נכון של המחט תגרום הפתרון המוזרק זורם ישירות דרך עורק הכבד הראוי ולקראת הכבד.- בצע את הזריקה מאוד לאט כדי למקסם את היעילות התמר.
- לאחר עוצמת הזריקה כולו כבר מנוהל, לאט לחזור בו מחט מהעורק.
הערה: לא צריך להיות שום דימום מאתר ההזרקה. במקרה כי הדימום מתרחש, הוא מציין כי המהדק לא ממוקם כראוי צריך להיות מותאם במהירות.
סגירה 6.
- לעבור תפר שני 7-0 Prolene מתחת עורק gastroduodenal, ולקשור ליגטורה קבעה שנייה מעל הזריקה.
- הסר את מהדק מעורק הכבד הנפוץ. ודא זרימת הדם דרך עורק הכבד הראוי כלפי הכבד שוחזר.
- חותכים את הקצוות החופשיים של ליגטורה.
- ודא שאין דימום לפני החזרת במעיים ובכבד אל חלל הבטן. תשמור על עצמך כי נספח מוחזר הכיוון המקורי שלה.
- לתפור את השריר והעור בשכבות נפרדות באמצעות חומר תפר 4-0 vicryl עם מחט מעוקל. מקום continuouהתפרים של כ בנפרד 1 מ"מ ולמשוך בחוזקה.
- במהלך שלב התפירה, לנהל משכך כאבים כגון עצירות (0.05 מ"ג / קילו).
- הסר חולדה מן ההרדמה. אם isoflurane נוצל בעבר, החולדה צריכה להכרתו בתוך מספר דקות. אם MMF כבר משמש הרדמה בזריקות, להרגיז אותו עם הזרקה תת עורית של Atipamezole (0.75 מ"ג / ק"ג), פלומאזניל (0.2 מ"ג / ק"ג), ו הנלוקסון (9.12 מ"ג / ק"ג), אשר יהיה להפוך את ההשפעות של ההרדמה ולאפשר החיות להכרתו בתוך 20 דקות. שמור חולדות חמות עם מנורת התחממות אינפרא אדומה במהלך שלב ההתעוררות הראשוני.
- אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
- אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין.
- צג חולדות שלאחר ניתוח סימנים פתולוגיים של מצוקה, עקבועם משככי כאבים כנדרש על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית. לדוגמה, עצירות יכולה להינתן 0.05 מ"ג / ק"ג כל 12 שעות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם ניסיון, שיעור הצלחה של כמעט 100% (כלומר העורק היה גזור בהצלחה והזריק, וחית שרד ניתוח) יכול להיות מושגת. עם זאת, מצבו הבריאותי של החולדה לפני הניתוח (מידת נטל הגידול, תפקודי כבד הבסיסית, וכו ') ללא ספק ישחק תפקיד בתוצאה של התערבות כירורגית. לאחר ניתוח, ניתן לצפות חולדות לחוות הרזיה חולפת מעלה קל, חולף של אנזימי כבד, גם אם חיץ לבד, בלי וירוס, הוזרק.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות שהזרקה תוך-גידולית ישירה היא ללא ספק השיטה הפשוטה ביותר להביא להעברת גידול יעילה של גוש גידול יחיד, עירוי עורקי בכבד מייצג נתיב מתן אידיאלי להתמקדות ב-HCC מולטיפוקלי, אורתוטופי. שיטה זו הוכחה כבטוחה ויעילה לטיפול ב-HCC בחולדות בעלות יכולת חיסונית עם נגיפים אונקוליטיים. יתר על כן, מכיוון שחולי HCC מטופלים באופן שגרתי על ידי יישום טרנס-עורקי של כימואמבוליזציה, השיטה המתוארת כאן ניתנת לתרגום בקלות לסביבה קלינית.
חסרון ברור של מתן טיפולים בגידולים בעורקי הכבד במודלים פרה-קליניים של מכרסמים...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי תת-הפרויקטים SFB 824 C6 ו-C7 (DFG Sonderforschungsbereich 824), קרן המחקר הגרמנית, בון, גרמניה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קוצץ וטרינרי | Aesculap | GT415 | גוזם קטן ואלחוטי אידיאלי להסרת פרווה מאזור הניתוח |
| סטריאומיקרוסקופ | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G מחטים | בראון | 4656300 | 30 G x ½ " |
| 1 מ"ל מזרקים | בראון | 9161406V | מזרק טוברקולין |
| חד פעמי אזמל | נוצה | 2975# | 15#15 להב |
| מספריים כירורגיים | סטנדרטיים כלי מדע עדינים | 14001-13 | חד/קהה, לפתיחת עור ושרירים |
| מלקחיים של אדסון | Fine Science | Tools 1101-12 | עם שיניים, לאחיזת עור ושרירים |
| מפסק Alm | Fine Science Tools | 17008-07 | עם שיניים קהות, לפיזור חלל הבטן פתוח במהלך הניתוח |
| ספוגיות גזה | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 ס"מ x 7.5 ס"מ, יש לבצע חיטוי לפני השימוש |
| במקלוני אפליקטור עם קצה כותנה | Lohmann & Rauscher | 11970 | סטרילי |
| עדין קצה foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 מ"מ, קצה זוויתי, לניתוח עורק הכבד |
| Vannas מספריים קפיציים | Fine Science | Tools 91500-09 | לחיתוך עדין |
| מחזיק מיקרו-מחט | Fine Science Tools | 12076-12 | לקשירת עורק תריסריון |
| מחזיק מחט | Fine Science Tools | 12005-15 | לסתות טונגסטן קרביד |
| 7-0 תפרי פרולן | Ethicon | 8648H | תפר פוליפרופילן עם מחט מעוקלת, לקשירת עורק התריסריון |
| 4-0 תפרי ויקריל | Ethicon | V3040H | עם מחט מעוקלת מחוברת |
| מנורת התחממות אינפרא אדום | Beurer | IL11 | לשמירה על טמפרטורת הגוף לאחר הניתוח |
מקורות
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
- Breedis, C., Young, G. The blood supply of neoplasms in the liver. Am J Pathol. 30, 969-977 (1954).
- Nakashima, T., Kojiro, M. Pathologic characteristics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 6, 259-266 (1986).
- Heo, J., et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer. Nat Med. 19, 329-336 (2013).
- Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma. Mol Ther. 18, 275-284 (2010).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus. Mol Ther. 9, 368-376 (2004).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV. Hepatology. 41, 196-203 (2005).
- Altomonte, J., et al. Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats. Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
