הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיפול בעכברי SCA1 עם תרכובות מסיסות במים ל- Non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי

10.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53758

⸱

22 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול ביוכימי והתנהגותי להערכת היעילות של תרכובות מסיסות במים ממוקדות מיטוכונדריה לטיפול באטקסיה ספינוצרבלרית מסוג 1 (SCA1) ומחלות ניווניות אחרות של המוח הקטן.

תקציר

תפקוד המיטוכונדריה ממלא תפקיד משמעותי בתהליך ההזדקנות במחלות ניווניות כוללים כמה ataxias spinocerebellar התורשתי והפרעות תנועה אחרות בסימן ניוון הדרגתי של המוח הקטן. מטרת פרוטוקול זה היא להעריך תפקוד המיטוכונדריה ב אטקסיה spinocerebellar סוג 1 (SCA1) ולהעריך את היעילות של מיקוד תרופתי נשימה מטבוליים באמצעות חומצת succinic תרכובת מסיסה במים כדי להאט את התקדמות מחלה. גישה זו ישימה מחלות אחרות של מוח קטנות והוא יכול להיות מותאם כדי שורה של טיפולים מסיסים במים.

Ex vivo ניתוח הנשימה המיטוכונדריאלי משמש כדי לזהות ולכמת את השינויים הקשורים למחלות במיטוכונדריה. עם ראיות גנטיות (נתונים שלא פורסמו) וראיות proteomic של תפקוד המיטוכונדריה במודל עכבר SCA1, אנו להעריך את היעילות של טיפול עם הים מאיץ מטבולית מסיס במיםחומצה uccinic ידי המסת תרכובת זו ישירות אל תוך מי השתייה בכלוב בבית. היכולת של התרופה כדי לעבור את מחסום דם המוח אפשר להסיק דרך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). יעילותה של תרכובות אלה לאחר מכן ניתן לבדוק באמצעות פרדיגמות התנהגותיים מרובות כולל rotarod המאיץ, מבחן בקורה וניתוח טביעת רגל. שלמות Cytoarchitectural של המוח הקטן ניתן להעריך באמצעות מבחני immunofluorescence המאתרות גרעיני תאים פורקינג דנדריטים תא פורקינג סומה. שיטות אלה הן טכניקות חזקות לקביעת תפקוד המיטוכונדריה ואת יעילות הטיפול עם תרכובות מסיסות במים במחלת ניוון עצבית במוח קטן.

מבוא

המיטוכונדריה הם המפיקים המפתח של אדנוזין אדנוזין (ATP), גידול אנזים חיוני האנרגיה התאית, עם רוב ATP במיטוכונדריה המיוצר באמצעות זירחון חמצוני (OXPHOS) באמצעות שרשרת העברת אלקטרונים. המוח, נתון דרישות מטבוליות הגבוהה שלה הסתמכותו על זירחון חמצונים להפעלת פעילות עצבית, הוא רגיש מאוד תפקוד המיטוכונדריה. כתוצאה מכך, תפקוד המיטוכונדריה הופעל במהלך תהליך ההזדקנות 1 והוא מעורב בפתוגנזה של מחלות ניווניות מספר 2, 3, 4. לכן, המסקנה היא כי המיטוכונדריה הם מטרות טיפוליות אטרקטיבית ניווניות של מערכת העצבים.

בפרוטוקול זה, אימצנו את השימוש בסוג אטקסיה spinocerebellar 1 (SCA1) כמחלה ניווניות מודל לחקר המיטוכונדריהl תפקוד והתפתחות טיפולים במיקוד המיטוכונדריה. SCA1 נגרמת על ידי מוטציה הרחבת חוזרים polyglutamine (polyQ) במוצר הגן ataxin-1 אשר מפעילה ניוון הדרגתי של נוירונים פורקינג של המוח הקטן ונוירונים של אזורי מוח אחרים. שורת העכבר המהונדסת משמשת כאן (יועד עכבר SCA1), אשר מבטאת transgene polyQ מוטנטי ataxin-1 תחת השליטה של מקדם ספציפי תאי פורקינג, מאפשרת ניתוח הממוקד של רכיב פורקינג התאים של SCA1 5. עכברים SCA1 לעבור ניוון פורקינג תא הדרגתי ולפתח הילוך 6 Ataxic.

תפקוד מורכב מיטוכונדריאלי ואת יעילות טיפול במיקוד המיטוכונדריה ניתן להעריך עם סוללה של מבחנים מולקולריים והתנהגותיים. תפקוד מורכב מיטוכונדריאלי נמדד לשעבר vivo על ידי מבחני נשימה מאתרים צריכת חמצן שינתה בתוך רקמת המוח הקטנה בבנוכחות מצעים ומעכבי שרשרת העברת אלקטרונים 7. מבחני נשימה בעבר שימשו עם רקמת permeabilized, מבודד המיטוכונדריה, ושלמים רקמות 7, 8, 9. הם מאפשרים הערכה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בניגוד לשיטות איסוף נתונים מורפולוגיים כגון מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים או מכתים immunofluorescence. השימוש כולו רקמות ולא המיטוכונדריה מבודד ומונע מבחר מוטה של המיטוכונדריה בריאה שעלולות להתרחש במהלך תהליך הבידוד 7. כאשר המותאמים פרוטוקול כמוצג, assay הנשימה היא שיטה ערך לאיתור תפקוד המיטוכונדריה במדינות מחלות ניווניות של המוח הקטן.

activators שאינו ספציפי של חילוף חומרים שניתן להשתמש בם כדי להסיק תפקוד המיטוכונדריה במודלי עכברים מהונדסים של diseas ניווניותדואר וסיוע בפיתוח טיפולים חדשים. קוורצטין, קואנזים Q10 ו קריאטין כל הוכח כדי לשפר פתולוגיה מחלות ניווניות בחולים והן במודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. כאן אנו מציגים מפעיל מטבולית הרומן, חומצה succinic, להגברת חילוף החומרים ואת להגביר את תפקוד המיטוכונדריה מחלות ניווניות. כדי להבטיח כי מפעיל חוצה את מחסום דם המוח, הועסקה HPLC לזהות למסירת רקמה עצבית בעכברים שטופלו 17.

כדי להעריך את ההשפעות הטיפוליות של תרכובות מסיסות במים ממוקדים מבחינת מטבולית כגון חומצת succinic, סוללה של פרדיגמות התנהגותיים ומחקרי immunopathological ניתן להשתמש. duדואר אל גירעונות הקואורדינציה המוטורית שמוצאים במחלת ניוון עצבה מוח קטן, assay מסלול הסימן עקב, assay assay קורה המוט מסתובב מאיץ המשמש לאיתור הצלה של פתולוגיה התנהגותית 6, 18, 19. אמצעים אלה הם השלימו עם הערכת immunopathological של cytoarchitecture המוח הקטן על ידי הערכת עובי שכבה מולקולרית (מוגדר אורך סוכת הדנדריטים תא פורקינג) וספירת סומה תא פורקינג בתוך אונה מוגדרת של מוח קטן רקמות 6, 20, 21. כאן אנו מציגים שיטות נוירו והתנהגותיים מרובות לאיתור וטיפול תפקוד המיטוכונדריה עם תרכובות מסיסות במים ממוקדים מבחינה מטבולית.

אנו משתמשים בניתוח vivo לשעבר של הנשימה המיטוכונדריאלי לנתח תפקוד המיטוכונדריה של טראן SCA1עכבר sgenic. יתר על כן, אנו מראים כי תסמיני המחלה והפתולוגיה משתפרים על ידי חומצה succinic המאיץ המיטוכונדריה מסיסים במים, עוד להפליל תפקוד המיטוכונדריה בהתקדמות המחלה SCA1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות IACUC ב סקידמור קולג לעבודה עם עכברים.

1. טיפול עם תרכובות מסיסות במים

  1. ממיסים חומצה succinic לריכוז של 0.75 מ"ג / מ"ל ​​במי השתייה כלוב. שים לב כל תרכובת מסיס במים עניין בריכוז הרצוי יוכל להחליף אותו בשלב זה. מערבבים פתרון לוודא כי המתחם נמס לגמרי.
  2. לאחר עכברים מגיעים לגיל הטיפול הרצוי, להחליף את המים לשתייה בכלוב בבית של הקבוצה במצב הטיפול עם הפתרון בשלב 1.1.
  3. מדדו את המשקל של שניהם בקבוקי מים קבוצת הטיפול והביקורת היומית על מנת להבטיח כי הן טופלו עכברים שליטה שותים אותה כמות של מים. השתמשו בשיטת מדידה אלה כדי לחשב מינון התרופה הכולל לכל כלוב. יש להתמיד בטיפול לאורך משקל בקבוק הניסוי וצג.

2. ניתוח Footprint

  1. מניחים את המסלול על הרצפה אושולחן בחדר סגור. הגדר את המסלול בזווית קלה כלפי מעלה לכיוון התיבה הביתה מרופד מזון מצעים ותגמול (למשל דגני בוקר ממותקים). קו אורך המסלול עם גיליון נייר לבן. אפשר הנושא להסתגל בתיבת הבית למשך 5 דקות.
  2. הסר את הנושא מהתיבה הביתה ולצייר על ימין ועל שמאל רגליים אחוריות, בהתאמה, עם צבע על בסיס מים כחול ואדום רעיל. מדפיסת הצבע תשמש לחישוב מדידות התנהגותי פלט מספר.
  3. מניח את הנושא בתחילת המסלול ולאפשר בכפוף ניגש אל הקופסה הביתה. לאחר הנושא הגיע תיבת הביתה, לסגור את הדלת מלכודת, ולאפשר את הנושא להישאר בתוך הקופסה הביתה למשך דקה אחת לפני החזרה לכלוב בבית בהתאמה. נקה את תיבת המסלול הביתה עם אתנול 30% ולהחליף את המצעים, לתגמל מזון, ונייר מסלול לנושא הבא.
  4. לכמת מספר צעדיו, רוחב השער, זווית הצעד, מספר הסיבובים נלקחולפי נושא לפי שיטות אנליטיות שתואר לעיל 6. ניסוי טביעת רגל מוצלח מוגדר מינימום של 5 עקבות רציפות שבו הסובייקט הוא ללכת לכיוון תיבת המטרה בלי להסתובב או לעצור.

3. ניתוח Beam

  1. הגדרת מנגנון קרן על פי מפרט בר הצלב שתואר לעיל 6 עם הקורות 6 הבאים: קרן 1 = מלבני, 28 מ"מ רוחב; קרן 2 = עגול, 28 מ"מ קוטר; קרן 3 = מלבני, 12 מ"מ רוחב; קרן 4 = עגול, 12 מ"מ קוטר; קרן 5 = מלבני, 6 מ"מ רוחב; קרן 6 = עגול, בקוטר 6 מ"מ. בקצה אחד של הקורה, להקים תיבה הביתה חשוך עם אוכל גמול.
  2. כדי להכשיר נושאים על הקורה, להרכיב את המנגנון עם קרן 3. נח בעדינות את הנושא על קצה היפך הקרן לתיבת הבית ולאפשר את הנושא לחצות. אפשר כל נושא עד שלושה ניסויי 2-דקות כדי להשיג ריצה מוצלחת, המוגדר חציית קרן והזנת תיבת הביתה בתוך 2 דקות. בין הניסויים, ולתת לשאר הנושא בתיבה הביתה למשך 2 דקות. בין הנושאים, לנקות את תיבת הקורה בבית עם 30 אתנול% ולהחליף את האוכל גמול כהכנה לנושא הבא.
  3. חזור על שלב 3.2 פעם ביום במשך הימים הבאים ובסך הכל של 3 ימי הדרכה רציפים. יום בדיקות, יום 4, צריך ברצף בצע את ימי הדרכה.
  4. כדי לבדוק את הנושאים שעל יום 4, ראשון להרכיב את המנגנון עם קרן 1 ולהגדיר את הקופסה הביתה כמתואר בשלב 3.1. מניח מצלמת וידאו מול המנגנון ולוודא כי מנגנון הקורה המלא ניתן ללכוד בבירור על וידאו. בגין הקלטה והניח הנושא הראשון על היפך קרן אל התיבה הביתה, המאפשר עד 3 ניסיונות 2-דקות כדי להשלים משפט בהצלחה. בין ניסויים, לאפשר נושא לנוח 2 דקות בתיבה הביתה.
  5. ממשיך לבחון נושא על כל אחד מששת הקורות בסדר מספרים,המאפשר את הנושא לנוח במשך 2 דקות בתיבה הביתה לפני תחילת הקורה הבא. בין הנושאים, לנקות כל קרן ותיבת הביתה עם אתנול 30% ולהחליף את האוכל גמול כהכנה לכל נושא.
    1. ווידאוטייפ כל ניסוי ולהקליט את מספר ניסויים מוצלחים לכל נושא לכל הקורה כדלקמן: '1' מציין את הנושא היה מוצלח על המשפט הראשון, '2' מציין את הנושא היה מוצלח על המשפט השני, '3' מציין את הנושא היה מוצלח על המשפט השלישי והאחרון, ו '4' מציין את הנושא היה לא מוצלח על כל אחד משלושת הניסויים.
  6. השתמש בהקלטות וידאו של footslips מידת ניסויים על ידי ציונים אשר מסונוורים על תנאי הניסוי של הנושא. גדר footslip כמו hindfoot כי הוא לאור ישיר של טבילת המצלמה מתחת קו אמצע תיאורטי על פני האורך של הקורה. עשרות footslip ממוצע הציונים מרובים.
  7. כדי לנתח את מספר היםניסויים ומספר uccessful של נתוני footslips, לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן בתוך כל גנוטיפ עוקבת תנאי ניסוי. השוואה בין חד סטרי ANOVA מרובים פוסט הוק ניתוח כדי לקבוע אם קיימת השפעה של טיפול גנוטיפ על מספר ניסויים מוצלחים ומספר footslips.

4. האצת Rotarod

  1. לאקלם נושאים אל assay בחדר 10 דקות לפני תחילת הניסוי. במהלך תקופת הסתגלות זו, להכין את מנגנון rotarod, ניקוי בנתיב אחד של המנגנון עם 30% אתנול.
  2. פתח את תוכנת rotarod ולהגדיר להתחיל בהגדרות עד 4 סל"ד, הגדרות האצה עד 5 דקות ומהירות סופית הגדרות ל -40 סל"ד. הגדרות אלה מספקים האצה מתמדת מצד 4 - 40 סל"ד במשך 5 דקות. עכברים יכולים להישאר על rotarod ב 40 סל"ד במשך 5 דקות נוספות מעבר לתקופת האצה עבור אורך ריצה מרבי של 10 דקות.
  3. פוסט הסתגלות, נושאים במקום on כדי rotarod במסלולים שלהם בעוד המוט מסתובב ב 4 סל"ד. לאחר כל הנושאים נמצאים הנתיבים שלהם, להתחיל בניסוי הראשון. רשום את חביון ליפול באמצעות תוכנת המכשיר; יכול להיות מועסק טיימר משנית כגיבוי.
  4. לאחר השלמת הניסוי, לאפשר לכל נושא לנוח במאגרי השביל שלהם במשך עשר דקות לפני המשפט הבא כדי למנוע עייפות.
  5. חזור על שלבים 4.3 ו -4.4 עבור סכום כולל של ארבעה ניסויים.
  6. חזור על שלבי 4.3 - 4.5 בסך הכל ארבעה ימים רצופים, משך טיפול לאורך תקופת הניסיון. בסיום, לכמת חביון ליפול המוט מסתובב עבור כל ניסוי לכל נושא 6.

5. הפקת המוח הקטן ו קיבוע

  1. להרדים עכברים באמצעות מחנק פחמן דו חמצני על פי הנחיות IACUC מוסדיים. מניח נושא לתוך תא פחמן דו חמצני, ולשחרר פחמן דו חמצני לתוך התא. שעוןהחיה בכל העת במהלך השלב והרדמת החסד ואינה להשאיר את החיה ללא השגחה.
  2. לאחר נשימה חדל ונושאים מראים תפיסת כאב שנותר על ידי לחץ ברגל אחורי, להסיר נושא קאמרי לעשות חתך קו אמצע מעולה דרך רקמת האפיתל מאמצע הגולגולת caudally לבסיס הגולגולת דרך רקמות אפיתל.
  3. בעזרת מספריים לנתיחה, לחתוך את הגולגולת מהבסיס אל חוט השדרה באמצעות תפר sagittal כדי גבחת. גזור רוחבי דרך כל תפר עטרה לפני מסירת העצמות החזיתית, הקודקודית interparietal באמצעות מלקחיים בוטים.
  4. שימוש במלקחיים בוטה לנתק לרוחב העצם אל המוח הקטן. שימוש במלקחיים כדי להפריד בין המוח הקטן מן colliculi ובגזע המוח ואת extrude זה משאר הרקמה. הפרד את המוח הקטן לתוך ההמיספרות על ימין ועל שמאל עם מלקחיים.
  5. מיד למקום הנכון cerebelli לתוך חנקן נוזלי כדי לחסוך עבור HPLC anaתמוגה cerebelli שמאל לתוך paraformaldehyde% 4 מראש צונן (PFA) עבור קיבעון רקמות. קציר כל רקמה אחרת של עניין לפני הניתוק האאורטה ולהשאיר את הפגר על פי כללי IACUC מוסדיים.
    זהירות: PFA הוא רעיל, דליק מאוד, ומאכל.
  6. עשרים וארבע שעות לאחר חילוץ, לשטוף רקמות קבועות PFA (4% ב PBS) בופר פוספט (PBS) (שלוש פעמים, 5 דקות / לשטוף) לפני הצבת את הרקמה לתוך סוכרוז 30% ב 4 ° C עד 2 שבועות.

6. Assay Immunopathology

  1. צרף צינורות של מזחלת microtome לברז בכיור וקופסת בקרת טמפרטורה. השתמש בתיבת בקרת טמפרטורה לקרר את הבמה microtome ל -25 ° C. כוון את חוגת עובי חתך 50 מיקרומטר.
    הערה: אם את החוגה על מזחלת microtome לא להגיע ל -50 מיקרומטר, להגדיר את חוגת הגדרה רזה להכפיל את העובי ידי הסטה את ההגדרה בהתאם (למשל להגדיר את דIAL עד 10 מיקרומטר ולהעביר חמש פעמים לפני חתך עבור לעובי כולל של 50 מיקרומטר).
  2. טובל בו חלק אגורה בגודל של חיתוך טמפרטורה אופטימלי (OTC) פתרון לבמה. לפני OTC קופא, להשתמש במלקחיים כדי למקם את האונה כך את פני השטח חתך sagittal באמצע נמצא כשפניו למטה על שכבת OTC. עבודה במהירות, כוון את רקמת בעדינות עם מלקחיים כך קצה לרוחב של האונה הוא הצביע לכיוון הלהב, נעלה על הבמה. אפשר OTC להקפיא לחלוטין.
    1. עבודה בשכבות, להוסיף OTC נוסף סביב הרקמה המאפשר OTC להקפיא לחלוטין לפני הוספת השכבה הבאה. הוספת שכבה דקה של OTC על גבי הרקמה ולהקפיא.
  3. סעיף הרקמה, המחלק את משקל הגוף שווה על להב חיתוך תוך חתך. אסוף סעיפים באמצעות מכחול אמן בסדר ומקום לתוך צלחת היטב שכותרתו כראוי המכיל 1x PBS. בין הסעיפים, להגדיר מחדש את עובי חיתוך עלסלדג בחיוג microtome, במידת צורך, עד 50 מיקרומטר.
  4. החזר את PBS היטב בכל צלחת היטב עם תמיסת אוריאה [0.01 אוריאה M ב PBS] ומניחים את הצלחת על קרח. כאשר מוכן, להסיר את הצלחת ממקטעי קרח לרתיחה בתמיסת אוריאה שלוש פעמים במשך 15 שניות בכל פעם לחשוף אפיטופים עבור immunolabeling. שלב זה יכול להיות מושלם בקלות על ידי הצבת את הצלחת על בלוק חימום מוגדר רותחים בטמפרטורה. בין כל שלב רותח, לקרר את הצלחת המכילה את קטעי רקמה על קרח.
    הערה: אם ביצוע אוריאה, חסימה, נוגדן ראשוני, נוגדנים משני צעדים DAPI בצלחת 96-היטב, השתמש -100 כרכים μL לאורך כל הדרך. אם באר בגדלים שונים משמש, להתאים את הכרכים מגיב בהתאם. במקום בלוק חימום, מיקרוגל יכול לשמש כדי להרתיח דגימות רקמת אוריאה. דגימות מיקרוגל על ​​מתח גבוה הגדרה במרווחים של שלושה 15 שניות.
  5. רתיחה פוסט, לשטוף חלקים שלוש פעמים, בכל פעם הסרת פתרון נוכחי, החלפת הפתרוןעם 1x PBS להסעיר במשך 10 דקות.
  6. סעיפי בלוק עם פתרון חמור בדם (חמור בדם נורמלי 3%, טריטון 0.3% X-100 ב PBS) על ידי דוגרי רקמות בסרום עבור שעה אחת עם תסיסה עדינה בטמפרטורת חדר. הסר פתרון חמור בדם.
  7. סעיפי תווית עם 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי calbindin ו -1: 2,000 אנטי ataxin-1 נוגדנים (11NQ) 16 בתמיסה חמורה בדם דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות עם תסיסה עדינה.
  8. לשטוף חלקים עם PBS כמו בשלב 6.5 לפני דוגרי פרקים, נוגדנים משני המתאימים (1: 500 אלקסה פלואוריד-488-אנטי-עיזים 1: 500 אלקסה פלואוריד-594-נגד ארנב נוגדנים בדילול מלא בתמיסה חמורה בדם) בשעה 4 ° C במשך 48 שעות עם תסיסה עדינה.
  9. לשטוף חלקים שלוש פעמים עם PBS כמו בשלב 6.5 לפני גרעיני תאים תיוג עם DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) פתרון מדולל לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב PBS. דגירת DAPI לא תעלה על עשר דקות. הסר solution ולשטוף עם PBS כמו בשלב 6.5.
  10. הר רקמות על גבי שקופיות ג'לטין מצופה 2% עם הרכבה בינונית להפחית photobleaching. Coverslip וסוגרים עם לק.
  11. עם סריקת מיקרוסקופ confocal לאתר את הסדק הראשוני של המוח הקטן תחת אור brightfield. עם מטרה 10X UIS2, לסרוק ברצף לרגש DAPI, AlexaFluor-488 ו AlexaFluor-594 ערוצים באמצעות לייזר דיודה 405 ננומטר, לייזר גז ארגון 488 ננומטר דיודת לייזר 559 ננומטר, בהתאמה, בשילוב עם ננומטר DM488 / 559 מפצל קרן dichroic. נפרדים ולאסוף נפלט אור באמצעות SDM490 ו מפצלי קרן SDM560 ומסנן bandpass BA575-675, בהתאמה.
    1. עבור כל ערוץ, לבנות Z- מחסנית בתוך הבקע הראשוני עם z = 20 מיקרומטר צעד = 0.1 מיקרומטר. השתמש בתוכנה שלאחר העיבוד מסופקת עם מיקרוסקופ confocal להוסיף סמן גדל את התמונה הסופית.
      הערה: לייזרים אלטרנטיביים, מסנני fluorophores ניתן להחליף מבוססים על availability. אם AlexaFluor-488 או AlexaFluor-594 איתור הוא חלש, זרח גליום (Gaasp) גלאי רגישות גבוהה יכולים להיות מועסקים על מנת להגביר את האות אם הוא זמין.

7. עובי שכבת כימות מולקולרית פורקינג מספרים סלולריים

  1. באמצעות ImageJ, לפתוח תמונת Z- מחסנית של פיסורה העיקרי מוכתם ולפצל כל תמונה לאפיקים אדומים, כחולים וירוקים שלה על ידי בחירת "תמונה" משורת התפריטים, 'הצבע' מכרטיסיית התמונה ו 'ערוצי פיצול' מהצבע כרטיסייה.
  2. צור הקרנת Z מקסימום של אחד מערוצים פוצלו. כאשר תמונת ערוץ העניין פתוחה, בחר 'תמונה' מתוך שורת התפריטים, 'סעיפים' מכרטיסיית התמונה ו 'Z-הפרויקט' מהכרטיסייה 'הסעיפים'. בתוך התפריט "Z-פרויקט" הפקודה, בחר 'הקרנת מקס Z' ולחץ על 'אוקיי'. חזור על הפעולה עבור כל ערוץ.
  3. פתח את תוסף Cell מונה על ידי בחירת 'תוספים' מ הבר דואר תפריט, 'ניתוח' מתוך הכרטיסייה תוספים ו "תא מונה" מהכרטיסייה לנתח.
    הערה: ImageJ ואת תוסף Cell מונה ImageJ ניתן להוריד בכתובת האתרים המופיעים בטבלה של חומרים וציוד.
  4. לכמת את מספר התאים פורקינג ידי ספירת שכותרתו ataxin-1 גרעינים המצויים לאורך קטע שנקבע מראש 200 מיקרומטר באורכים הקדמי וגם האחורי של הבקע העיקרי. השתמש במפת הסף על ידי בחירה "תמונה" משורת התפריטים, 'התאם' מכרטיסיית התמונה ו 'הסף' מהכרטיסייה התאם לעשות מפת סף של ערוץ עניין (האדום במקרה של גרעיני ataxin-1 שכותרתו ).
    1. בחר טווח פיקסל שניתן מנורמל לאורך כימות (31-225 פיקסלים למשל). בטל רעש מהתמונות על ידי סימון התיבה "רקע כהה" בחלון הסף. אות תמונה יכולה להיות הפוכה על מנת להקל על יד נטויה.
  5. לכמת thic השכבה המולקולריתkness בערוץ הירוק שימוש באפשרות 'ערוצי פיצול' ו 'מפת סף "כמו שלבים 7.1 ו -7.2. באמצעות הסמן גדל על כל תמונה כמדריך, למדוד באופן אקראי שלושה אורכי שכבה מולקולריים בתוך כל אחת משני מיועד 200 מיקרומטר משתרע על כל תמונת פיסורה עיקרית. לבצע מדידות מסוף הפרוקסימלי של סוכת הדנדריטים פורקינג בבסיס סומה פורקינג אל הקצה הדיסטלי של סוכת הדנדריטים פורקינג.
  6. שיא פורקינג ספירת תאי ועובי השכבה המולקולרית כאמצעי פלוס מינוס סטיית התקן. בצע ANOVA חד כיווני עם השוואות מרובות ניתוח פוסט הוק כדי לבחון את ההשפעה של תנאי הטיפול או גנוטיפ על מספר התאים ואת אורכו של סוכת הדנדריטים.

8. ניתוח HPLC של טיפול-פוסט ריכוזי המוח הקטן Succinic חומצה

  1. הכנת דגימה לצורך ביצוע אנליזה
    1. לשקול אונה כל מוח קטן תקינה שנקטפה לפנילהשתמש בניתוח HPLC. לרכך חצאים חצאי המוח אחד בכל פעם בתוך homogenizer dounce מראש צונן ולהוסיף 0.5 מ"ל של 75:25 (לפי נפח) מים: פתרון מתנול לכל חצי הומוגני 17.
    2. באמצעות homogenizer מראש צונן צרה, גס להתפרק רקמה עם 5 משייכות dounce. המשך דק לרכך כל דגימת רקמה עם homogenizer רחב יותר, החלת 20 משיכות dounce.
    3. מעבירים את homogenates טרום מקורר צינור microcentrifuge. לאחר כל דגימה, יש לשטוף את homogenizer עם 0.5 מ"ל מים קרים כקרח: פתרון מתנול ולהוסיף את לשטוף את צינור microcentrifuge.
    4. צנטריפוגה homogenate דגימות ב 1,300 XG במשך 30 דקות ב 25 ° C ו לאסוף את supernatant בצינור microcentrifuge נקי.
    5. סנן את supernatant באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי שוכנה עם מסנן תאי מחדש של 10 kilodalton (KDA) מגבלת משקל מולקולרית נומינלית. אם לא מייד לרוץ ניתוח HPLC, חנות מסוננת דגימות ב -80 °ג
  2. Instrumentation HPLC והגבלות
    1. צרף טור כרומטוגרפיה הדרה יון עם אורך של לפחות 30 ס"מ גודל החלקיקים של 7 מיקרומטר כרומטוגרף נוזלי בעל יעילות גבוהה.
    2. כן ודגת כמות מספקת של חיץ יצטט 1 מ"מ המותאמת pH של 5.
    3. הגדר את HPLC עם מהירות הפאזה ניידת של 0.8mL / min. אם באמצעות גלאי UV-VIS, בחר אורך גל גלאי של 224 ננומטר. פעמי elution אופייניות עבור חומצת succinic בתנאים אלה הן בין 10 ל -12 דקות.
  3. ביצוע וניתוח לתקני דוגמאות
    1. להכין סט של סטנדרטים בשלב נייד חיץ יצטט עם ריכוזי חומצת succinic בין 0 ל -250 חל"מ.
    2. הפעל כל תקן ולהכין עקומת כיול באמצעות אזור השיא נמדד כל סיבוב.
    3. ברגע עקום סטנדרט מדויק מתקבל, להפעיל דגימות בעבר הכינו מדוללות במאגר יצטט.עבור דיוק המדידה גדול, דוגמאות ניתן מתובל ריכוזים ידועים של חומצת succinic כי כבר מדוללים בשלב הנייד. הפעל את כל הדגימות בשלושה עותקים.
    4. לנתח chromatograms HPLC כדי לקבוע את ריכוז חומצת succinic של הדגימות באמצעות עקומת הכיול והכפלת התוצאה נפח דגימה על ידי חלוקת מסת מדגם מקורית.

9. ניתוח גופיים של פונקציונליות מיטוכונדריאלי המוח הקטן באמצעות יחידת בקרת אלקטרודה חמצן

  1. צור אלקטרודה קלארק מסוג באמצעות מערכת זמינה מסחרי על ידי היישום הראשון ירידה של אשלגן כלורי (50% KCl w / v) פתרון קתודת הפלטינה, חיתוך חתיכה 1.5 סנטימטר 2 של טבק מסחרי נייר גלגול בעדינות והנחית את הנייר מעל קתודת הפלטינה.
    1. מכסים את הקתודה לבין האנודה שמסביב עם חתיכת 2.5 ס"מ 2 נייר polytetrafluoroethylene (PTFE) ו מלבב בהבטחת membRanes עם טבעות O, מוודא שאין קיפולים או בועות בתוך ממברנות. לטפטף 50% פתרון KCl לתוך שמסביב היטב.
  2. אבטח את האלקטרודה התערובת של העוגיות לתוך תא assay וממלאים במים רווי-אוויר. מחממים את החדר עד 30 מעלות צלזיוס, להוסיף בר ומערבבים 0.8 ס"מ לפתרון ומערבבים ב 70 סל"ד באמצעות תוכנת המכשיר. כייל את החדר על ידי הקמת חמצן אפס. לשם כך, באופן סדרתי להוסיף כמה גבישים של dithionite נתרן סוכן ההפחתה לפתרון.
    1. לאחר כיול מושגת, שטפו את החדר פעם אחת עם 70% אתנול, ולאחר מכן לשטוף שש פעמים עם מים ללא יונים לפני המאפשר לתא להסתגל ב 1.5 מ"ל של חיץ הנשימה (5 מ"מ MgCl 2, 60 mM KCl, 100 מ"מ מניטול, 10 מ"מ 4 KH 2 PO, 0.5 מ"מ Na 2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7.4]) 7.
      הערה: כל עקבות של dithionite נתרן יש להסיר לחלוטין במהלך השלבים לשטוף לפני שתנסה למדודריכוזי חמצן במהלך ניסויי הנשימה.
  3. בעדינות homogenize ההמיספרות של המוח הקטן שקל 0.5 מ"ל של חיץ homogenate (0.25 M סוכרוז, 0.5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7.4]). העבר homogenate אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge נקי ולשמור מצונן עד תחילת assay.
  4. מוסיפים את homogenate לתא והגיע נפח סופי של 2 מ"ל. Permeabilize את homogenate המוח הקטן על ידי הוספת 40 μL של digitonin או saponin (5 מ"ג / מ"ל); לאפשר רקמת הומוגני כדי לדגור במשך 10 דקות.
    הערה: digitonin ו saponin רעילים, ופעמים הדגירה צריך להישמר עד למינימום.
  5. כדי להתחיל להקליט את צריכת חמצן, לקבוע פונקציה המיטוכונדריה באמצעות הפעלה ועיכוב של שרשרת זירחון חמצונים באמצעות מצעים ומעכבים, בהתאמה (3 הקלטות דקות לכל מצע).
    1. להוסיף מצעים באמצעות מזרקים נקיים כדלקמן: 10 μL 2 M גלוטמט [הריכוז הסופי (fc) 0.01 M],5 μL 0.8 M malate [fc 2 מ"מ], 20 μL 0.5 M diphosphate אדנוזין (ADP) [fc 5 מ"מ], 1 מ"מ μL 1 [fc 0.5 מיקרומטר] rotenone, 20 חומצה succinic μL 1M [10 מ"מ], 1 μL 5 מ"מ antimycin A [fc 2.5 מיקרומטר], 1 μL 0.8 M ascorbate [fc 0.4 מ"מ], ו -5 μL 0.2 M tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD). [Fc 0.5 מ"מ] בעת הוספת מצעים לתא להיזהר לא להכניס בועות אוויר לתוך המערכת.
      הערה: מידע מפורט על ההשפעה התפקודית הנגרמת על ידי כל מצע מעכב מתואר פרוטוקול שפורסם בעבר 7. עקומות מנה-תגובה הפרט ייתכן שיהיה צורך שנוצר כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים של מצעים ומעכבי בהכנות / רקמות / מינים לא למד בעבר. כמו כן, הפרוטוקול יכול להיות מותאם עבור נטיות מטבולית המולדות של הרקמות / מינים נלמדים, כגון העדפות מצע.
  6. לאחר איסוף נתונים הושלם, בעדינותspirate homogenates המוח הקטן ולנקות את החדר עם אתנול ומים deionized. לאחר נקיות, דגימות homogenate מוח קטנות נוספות ניתן להפעיל ללא כיול נוסף עבור כל עוד PTFE ממברנה נותרה בשלמותה. לאחר השלמה סופית, אלקטרודה נקי עם מים ללא יונים ואתנול וחנות עם ג'ל או יבוש סיליקה.
    הערה: בין באותו יום רץ, למלא את התא עם מים ללא יונים להבטיח כי הקרום לא להתייבש.
  7. באמצעות גיליון הנתונים שנוצר על ידי התוכנה המכשירה, דקות יצוא 40 של נתוני נשימה מתחילים שתי דקות לפרסם בנוסף מצע לתכנית גיליון אלקטרוני.
  8. חשבתי את קצב נשימה לכל מצע או מעכב. לנרמל את הנתונים על ידי חלוקת הנשימה המוחלטת של קצב הנשימה במהלך בנוסף המצע ascorbate-TMPD.
    הערה: קצב הנשימה יכול להיות מנורמל בהמשך תכולת החלבון של רקמות אשר עשוי להיות רצוי במיוחד בניסויים ניווניות של מערכת העצביםשבו תוכן הרקמה עשוי להשתנות. לשם כך, שומר 50 μL של homogenate המדגם (משלב 9.3) לשימוש assay חלבון סטנדרטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות מיקוד תרופתי של המיטוכונדריה במוח הקטן עם חומצה succinic אנו מסוגלים למנוע תפקוד המיטוכונדריה במודל של עכברים של SCA1 מחלות ניווניות של המוח הקטן. תורם האלקטרונים הקנונית של דהידרוגנז succinate, חומצת succinic, פורק ב מי שתייה בכלוב בבית של עכברי SCA1 במשך חודש, עם תחילת ערכה התנהגותית במהלך השבוע השני של טיפול וערכת נוירו לאחר הטיפול (איור 1 א). הטיפול בחומצה Succinic 22 משפר את הבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אם שיטות אלה משמשים כמתואר, הם מסוגל לאתר והקלה על תפקוד המיטוכונדריה בתיווך זרחון חמצוני במודלים עכברים מחלות ניווניות של המוח הקטן. מבחני ביוכימיים והתנהגותיים בשילוב שיטות רבות לקביעת מידת תרומת המיטוכונדריה לפתולוגיה מחלות ניווניות של המוח הקטנה. על ידי טיפול בעכברים עם חומצת succinic להגברת חילוף חומרים ואת להגביר את התפקוד המיטוכונדריה, אנו מסוגלים להציג הצלה של גירעונות התנהגותי מוח קטנים וניוון המוח קטן.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר הארי אור מאוניברסיטת מינסוטה על תרומתו הנדיבה של עכברים מהונדסים. ברצוננו להודות גם לבוגרי מכללת סקידמור הבאים על עבודתם בביצוע הניסויים הקודמים: מוניקה וילגאס, פורטר הול, מיטשל ספרינג, ניקולס טוקר, ג'ני ז'אנג, קלואי לארסון ושיאן סלוקום. יתר על כן, ברצוננו להודות למכללת סקידמור על מימון פיתוח השיטות הללו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדנוזין דיפוספטסיגמא אולדריץ'A2754ADP
אסקורבטסיגמא אולדריץ'A7631
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A2153BSA
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדולסיגמא אולדריץ'D9542DAPI
דיגיטוניןסיגמא אולדריץ'D141
דיתיותרייטולסיגמא אולדריץ'D0632
DTT סרום חמורסיגמא אולדריץ'D9663
גלוטמטסיגמא אולדריץ'1446600
מלאטסיגמא אולדריץ'6994
מניטולסיגמא אולדריץ'M4125
פרפורמלדהידסיגמא אולדריץ'P6148
אשלגן-לקטוביונאטביו-סוכרים69313-67-3
רוטנוןסיגמא אולדריץ'R8875
ספוניןסיגמא אולדריץ'47036
חומצה סוקסיניתסיגמא אולדריץ'S3674
N,N,N&פריים;,N&פריים; -Tetramethyl-p-phenylenediamineSigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
UreaSigma AldrichU0631
Vectashield הרכבה בינוניתVector LabsH-1000
<נוגדנים חזקים>
11NQ (אנטי אטקסין-1 )Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 נוגדן משני נגד עכברLife TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 נוגדן משני נגד ארנבLife TechnologiesA-11012
נוגדן קלבינדין (עז)Santa CruzC-20
<חזק>בעלי חיים
לשלוט בעכברים טרנסגנייםהארי אור, Ph.D.A02Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
עכברי SCA1הארי אור, Ph.D.B05Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
עכברים מסוג פראמעבדת ג'קסון001800
Equipment
ESM-100L מיקרוטוםERMASledge microtome
Fluoview FV1200 מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוס
גליצרול-ג'לטין שקופיותFD Neuro TechnologiesPO101
מזרק המילטוןסיגמא אולדריץ'VCAT 80465
OXYT1 יחידת בקרת אלקטרודות OxythermHansatech Instruments
P.T.F.E.Cole-ParmerUX-08277-15
Rotallion RotarodPPP& Gצור קשר עם המחבר המקביל לקבלת מידע
Ultimate 3000 HPLCDionex
Software
ImageJNational Institute of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
תוסף מונה תאים (עבור ImageJ)המכון הלאומי לבריאותhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P& G Rota-Rod v3.3.3 (תוכנת rotarod)PPP& Gצור קשר עם המחבר המתאים לקבלת מידע
Phidget21.dll (נדרש לתוכנת rotarod)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html
נייר

מקורות

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HPLC
טיפול בעכברי SCA1 עם תרכובות מסיסות במים ל- Non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.