מאמר שיטה

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

DOI:

10.3791/53764

⸱

17 בפברואר 2016

 ,  ,  , 
1Neurology, Johns Hopkins University, School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוליגודנדרוציטים הם תאי המיאלין של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבית של קודמיהם, תאי אב אוליגודנדרוציטים, מקליפת חולדות, כמו גם שיטה כמותית מהירה ואמינה להערכת אוליגודנדרוגנזה במבחנה בתגובה לגורמים ניסיוניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוליגודנדרוגנזה יעילה היא המטרה הטיפולית של מספר תחומי מחקר כולל פגיעה בחוט השדרה, היפוקסיה בילודים ומחלות דמיאלינטיות כגון טרשת נפוצה ומיאליטיס רוחבית. מיאלינציה נדרשת לא רק כדי להקל על התפשטות דחפים מהירה בתוך מערכת העצבים המרכזית, אלא גם כדי לספק תמיכה טרופית לאקסונים הבסיסיים. ניתן לחקור תאי אב של אוליגודנדרוציטים (OPCs) במבחנה כדי לסייע בזיהוי גורמים שעשויים לקדם או לעכב התמיינות אוליגודנדרוציטים. עד כה, רבות מהשיטות הזמינות להערכת תהליך זה דרשו מספר גדול של תאים, ובכך הגבילו את מספר התנאים שניתן לחקור בכל זמן נתון, או שיטות כימות עתירות עבודה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד של מספר רב של OPCs טהורים ביותר יחד עם שיטה מהירה ואמינה לקביעת אוליגודנדרוגנזה ממספר מצבים בו זמנית. OPCs מבודדים מקליפת חולדה יילודים P5-P7 וגדלים במבחנה במשך שלושה ימים לפני ההתמיינות. ארבעה ימים לאחר ההתמיינות, אוליגודנדרוגנזה מוערכת באמצעות בדיקת סריקה פלואורסצנטית כפולה אינפרא אדום כדי לקבוע את ביטוי חלבון המיאלין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הולכה עצבית יעילה במערכת העצבים המרכזית היונקת (CNS) דורשת מעטפת המיאלין של אקסונים על ידי oligodendrocytes. במהלך פיתוח, oligodendrocytes להתעורר מתוך מאגר של ובתאים oligodendrocyte (OPCs) כי הם חשבו להגר מאזורי חדרית של המוח קדמי בפיתוח עצבי צינור 1. לאחר OPCs הגירה להתמיין oligodendrocytes בוגרת, myelinating כי לא רק להקל התפשטות הדחף יעיל, אלא גם לספק אקסונים עם תמיכה trophic 2. המבוגר CNS שומרת אוכלוסיה שופעת של OPCs כי הם מפוזרים בכל רחבי החומר האפור-לבן המהוות כ 5-8% מכלל התאים 3. בעקבות עלבון demyelinating, OPCs להגר באתר של פציעה, להתרבות, ולבדל להחליף נדני המיאלין אבודים או פגומים על אקסונים חשופים. עם זאת, בכמה הגדרות מחלה / פציעה, תהליך זה נמצא להיות יעיל או יכול להיכשל 4 לחלוטין. בשעה שdemyelination כרוני הוא חשב להוסיף את נטל המחלה, oligodendrogenesis ויצירת מיאלין יעיל עשוי להקל תסמינים 5. בהתאם לכך, כבר היה עניין ללמוד OPCs במבחנה כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים הניסיונות על oligodendrogenesis.

תובנה השלבים השונים של בידול oligodendrocyte כבר מתאפשר על ידי זיהוי של סמני תאים ספציפיים הבמה. עצמית חידוש ובתאים מוקדם מוגדרים על ידי הביטוי שלהם של אלפא הקולטן לגורם הצמיחה נגזר טסיות (PDGFRα), עצביים / גליה אנטיגן 2 (NG2) ו A2B5 6 - 8. כפי OPCs ליזום תכנית הבידול שלהם לסגת מחזור התא, הם downregulate ביטוי של סמנים אלה ולהתחיל לבטא חלבונים מעידים premyelinating oligodendrocytes כולל המחזורי-נוקלאוטיד 3'-phosphodiesterase (CNPase) ו O4. לבסוף, הבידול שלהם לתוך oligodendroc בוגרת יותרytes מתאפיין ביטוי של חלבונים הקשורים המיאלין, כולל גליקופרוטאין הקשורים המיאלין (הפצ"ר), חלבון proteolipid (PLP), ואת חלבון המיאלין הבסיסי (MBP). MBP הוא חלבון קרום היקפי תאיים מרכיב עיקרי של מעטפת המיאלין. עכברים שחסר MBP לפתח פנוטיפ חמור שבו myelination CNS הוא ירד מוביל משמעותי רעידות, עוויתות 9,10 מוות מוקדם. תפקיד חשוב זה של MBP ב myelination הוביל שימוש בו כסמן של בידול oligodendrocyte היא במבחנת in vivo 11.

כימות של MBP יכולה להיות מושגת באמצעות מתודולוגיות שונות. RT-PCR וניתוח כתם המערבי לאפשר כימות של רמות MBP תחת משטרי טיפול שונים. Immunocytochemistry היא שיטה איכותית נפוצה שיכולה גם להיות כמותית כאשר גישות מיקרוסקופיה מבוסס מצלמה משמשות. למרות שמערכות אלה מהימנות יסודיש המחקר של בידול oligodendrocyte, הם כל החסרונות שלהם כי להגביל את השימוש שלהם ב ההקרנה סמים. ראשית, כמות OPCs העיקרית הדרושים RT-PCR וניתוח כתם המערבי מפחית את מספר משתנים שיכולים להיבחן בו זמנית. בעוד דרישת תא immunocytochemistry היא הרבה יותר נמוכה, זמן ניכר חייב להיות מוקדש כל ניסוי אם כימות היא מטרה. תמונות רבות חייבות להיות בשבי ואז לכמת כדי להקל על הניתוח הניסיון. אזהרות אלה הופכים מכשולים חשובים לשקול ללימודים הדורשים הערכת קצב העברת נתונים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה אשר מנצל היבטים בסיסיים משני immunocytochemistry ומתודולוגיות כתם המערבי כימות המיאלין, תוך הפחתה משמעותית של שניהם את מספר התאים הדרושים זמן להשלמת ניתוח כמותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) ואוניברסיטת ג'ונס הופקינס הספר לרפואה.

1. הכנת צלחות assay, פתרונות המניות, ו OPC Media Base

הערה: בסיס העכברוש OPC (סאטו) תקשורת המתוארת כאן כבר נגזרה מחקרים שפורסם בעבר 12,13. ניסוחי מדיה אלטרנטיביים יכולים להיות גם תואמים עם הליך זה.

  1. Resuspend-פולי- L- ליזין (PLL) לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים סטריליים deionized. פיפטה 400 μl של PLL בדילול לבאר כל צלחת תרבות כיתה שחורה קירות, ברורה תחתונה 24 גם רקמות.
  2. תרבות מנות מעיל רקמה 2 שעות בתוך חממה תרבות 37 ° C רקמה או לילה במקרר 4 ° C..
  3. לשאוב PLL מן המנות צופה לפחות 20 דקות לפני ציפוי. אפשר הנותרים PLL להתייבש מהבאר ידי הצבת 24 צלחות גם עם מכסה פתוחה חלקית תרבית רקמהמכסה מנוע. ודאו הבארות יבשות לחלוטין לפני ציפוי OPCs המבודד. תאים לא לדבוק פלסטיק, שיש לו בהווה PLL נוזלי.
  4. הכן N -Acetyl-L-ציסטאין (NAC) פתרון המניות (1,000x): ממיסים 100 מ"ג N -Acetyl-L-ציסטאין (NAC) ב 20 מ"ל של מדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
  5. הכן פתרון המניות הידרוקורטיזון (1,000x): הוסף 1 מ"ל של אתנול ל 1 מ"ג הידרוקורטיזון מערבולת לפזר. להוסיף 19 מ"ל של DMEM, לערבב את הפתרון, aliquot ולאחסן ב -20 ° C. התוספת של הידרוקורטיזון לתקשורת הבסיס הוכחה כדי לשפר את ההישרדות של תאי גליה 14.
  6. הכן פתרון מניות ד-ביוטין (5,000x): ממיסים 2.5 מ"ג ביוטין ד ב 50 מ"ל של PBS. להוסיף 1-2 x 5 טיפות μl של 0.1 N NaOH כדי לסייע בפירוק. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
  7. כן פתרון מניות אינסולין (100x): ממסי 25 מ"ג אינסולין ב 50 מ"ל מי כיתה בתרבית רקמה. הוסף 250 μl of 1 N HCl ומערבבים עד פתרון ברור. לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שבועות.
  8. כן פתרון מניות סאטו (100x):
    1. כן פתרון מניות פרוגסטרון (25 מיקרוגרם / μl): ממסי פרוגסטרון 2.5 מ"ג ב 100 μl של אתנול.
    2. כן פתרון מניות סלניט נתרן (400 ng / μl): ממסי סלניט נתרן 4 מ"ג ב 100 μl של 0.1 N NaOH. הוסף 10 מ"ל של DMEM ומערבבים.
    3. ל -100 מ"ל של DMEM, להוסיף 1 גרם של האדם apo-transferrin, 1 גרם של אלבומין בסרום שור, ו -160 מ"ג של פוטרסין ומערבבים לפזר באופן מלא. הוסף 25 μl של פתרון המניות פרוגסטרון, 1,000 μl של פתרון המניות סלניט נתרן, ומערבבים. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
  9. הכן בסיס מדיה OPC: לכל 100 מ"ל של DMEM (עם 4.5 גר '/ ל D- גלוקוז, L- גלוטמין, ו -110 מ"ג / L פירובט נתרן), להוסיף 100 NAC μl, 100 הידרוקורטיזון μl, 20 μl ד-ביוטין, 1 מ"ל אינסולין, 1 מיליליטר מניות סאטו, 100 μl יסודות קורט B,2 מ"ל B-27 תוספת (50x), ו 1 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (100x). לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. הכן פתרון המניות PDGF-AA (1,000x): ממיסים 250 מיקרוגרם ב 12.5 מ"ל של PBS עם אלבומין 0.1% שור (BSA) לבצע פתרון 20 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot ולאחסן ב -80 ° C.
  11. כן תקשורת התפשטות OPC: בסיס מדיה OPC בתוספת 20 ng / ml PDGF-AA.
  12. כן תקשורת בידול OPC: בסיס מדיה OPC בתוספת 45 triiodothyronine ננומטר.
  13. הכן טור הצפת: 500 מ"ל של PBS, להוסיף 2.5 גרם של BSA ו -2 מ"ל של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולהתאים את ה- pH ל -7.2. לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.

2. מוח החולדה Dissection

הערה: גורי חולדה P5-P7 משמשים בפרוטוקול זה. כל קליפת גור עכברוש בתשואה של כ 1.5-2.0 x 10 6 תאים חיוביים A2B5.

  1. לעקר את כל הציוד לנתיחה באמצעות 2506; C מעקר חרוז מחומם.
  2. להוסיף 15-20 מ"ל של PBS (ללא Ca 2 + ו Mg 2+) 50 מ"ל צינורות חרוטי. שפופרת 50 מיליליטר חרוטים אחת מספיקה עבור הקורטקס עכברוש גור 3-4. מניח 50 מ"ל צינורות חרוטים על קרח. השתמש 50 מ"ל צינורות חרוטי להחזיק רקמות קליפה לקוביות במהלך לנתיחה.
  3. הוסף קר PBS על צלחת 10 ס"מ פטרי. המנה זו תשמש לנתיחה תחת מיקרוסקופ האור.
  4. להקריב גורי חולדה על ידי עריפת הראש עם מספרי כירורגיות גדולות. תרסיס ראש עם 70% אתנול.
  5. חלץ את המוח כולו
    1. מספריים קטנים באמצעות לחתוך את העור לאורך קו האמצע ומאחורי האוזניים ואת שולי העור לקלף בחזרה. חותכים את הגולגולת לאורך קו ההפרדה החל גזע המוח ומסתיים העיניים. היזהר שלא לחתוך עמוק מדי כדי לשמר את המבנה של קליפה הבסיסית.
    2. לעשות שני חתכים לרוחב נחים המוחון ידי החדרת מספרי כירורגיות קטנות לתוך מגנום foramen. תן קיצוץ נוסף בין העיניים, נמלהerior כדי נורה חוש הריח.
    3. בזהירות לקלף כל מחצית של גולגולת אחורית. הסר את המוח ואת המקום כולו ב -10 ס"מ צלחת פטרי מלא PBS קר.
  6. תחת מיקרוסקופ האור לנתיחה, להסיר את נורות המוח קטן חוש ריח עם מלקחי כירורגיות בסדר.
  7. תהפכו את המוח כך את פני השטח הגחון גלוי תחת מיקרוסקופ אור.
  8. בעזרת מלקחיים ישר בסדר לבצע דיסקציה קהה ידי הצבת טיפי מלקחיים סגורים שבין הקליפה וההיפותלמוס עד לעומק כ 2/3 של המוח. לאחר מלקחיים נמצאים במקום לאפשר את הקצוות כדי לפתוח. חזור על הפעולה עבור חצי הכדור השני.
  9. להקניט את קליפת מההיפותלמוס ואזורי מוח תיכונים.
  10. הסר את ההיפותלמוס, התלמוס, ו המוח התיכון ידי החזקת המוח התיכון על פני השטח האחורי שלה לקלף אותה לקראת סוף הקדמי של המוח. לנתק את הקשרים הקדמיים.
  11. הסר את ההיפוקמפוס ידי פילינג זה כלפי חוץ ולאחר מכן ניתוק הקשר בינו לביןקליפה באמצעות מלקחיים דיסקציה מכופף.
  12. סור בסטריאטום הנותרים ידי מבטל אותו מהקורטקס הבסיסי בתנועות אלכסוניות החוצה באמצעות מלקחיים דיסקציה מכופף.
  13. נקה כל כלי דם ואת קרומי המוח מפני שטח הגחון של הקורטקס.
  14. תהפוך את המוח כך את פני השטח הגבה גלוי. קרום המוח וכלי הדם צריך להיות ברור. קרומי המוח פיל מהקורטקס הבסיסית באמצעות מלקחיים דיסקציה בסדר. התחל קילוף מהמיקום מצורף פקעת ההרחה.
  15. להשלמת שלבים 2.4-2.14 עבור סכום כולל של 3-4 גורי חולדה.
  16. מניח 3-4 הקורטקס גור עכברוש גזור לתוך צלחת פטרי יבש וקוצץ עם סכין גילוח מעוקר עד 1 מ"מ x 1 מ"מ נתחי מושגות. אסוף רקמה על ידי שטיפת צלחת עם PBS מאחד 50 מיליליטר חרוטי צינור (שלב 2) ולאחר מכן למקם בחזרה על קרח.

3. אנזימתי ודיסוציאציה רקמות מכני

הערה: בשלב זה, ערכת דיסוציאציה עצבי מבוסס פפאין מומלצת. שימוש Neקיט דיסוציאציה אוראל (P), צעדים מיוחדים שהם אופטימליים בידוד OPC מתואר.

  1. מכינים את אנזים דיסוציאציה הראשון על ידי דילול אנזים P עם המאגר המתאים. התכנים של כל חרוטי 50 מ"ל (1 מדגם) יהיה resuspended עם סך של 1,950 μl של תמהיל האנזים. מקום בתמהיל האנזים באמבט 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    לדוגמא 1: 1,900 μl של הצפת + 50 μl של אנזים פפאין
  2. ספין כל 50 מ"ל צינורות חרוטים המכילים 3-4 הקורטקס גור עכברוש קצוץ ב XG 300 במשך 3 דקות.
  3. לשאוב supernatant ולהוסיף 1,950 μl של פתרון אנזים על צינור אחד מדגם להתפרק את הכדור על ידי צינור היפוך ורועד בעדינות.
  4. מדגירים את תרבות חממה 37 ° C רקמות במשך 15 דקות עם סיבוב צינור רציף.
  5. במהלך 5 הדקות האחרונות של הדגירה, להכין את א תמהיל האנזים השני לדלל את האנזים במאגר הראוי לו. סך של 30 μl יתווסףעל צינור אחד מדגם 50 מיליליטר חרוטים.
    לדוגמא 1: 20 μl של הצפת + 10 μl של אנזים
  6. לאחר הדגירה תושלם להוסיף 30 μl של תמהיל האנזים השני לצינור כל להפוך לערבב.
  7. בעזרת פיפטה זכוכית פסטר מחוברת בקר פיפטה, לנתק את הרקמה באופן מכני על ידי pipetting 10-15 פעמים או עד פיסות הרקמה הם בגודל מופחת והפתרון הפך מעונן. החזר את המדגם אל האינקובטור תרבות C רקמה 37 מעלות במשך 15 דקות עם סיבוב רציף.
  8. פיפטה מדגם homogenate רקמות 10-15 פעמים בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  9. פיפטה מדגם homogenate רקמות 15-20 פעמים בעזרת פיפטה μl 200
  10. להחזיר את כל דגימות אל האינקובטור תרבות 37 ° C רקמה למשך 10 דקות עם סיבוב רציף.
  11. הוסף 10 מ"ל של PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) מדגם ולסנן את homogenate דרך פילטר 40 מיקרומטר הנקבוביות ממוקם מעל 50 מ 'צינור l. יש לשטוף את המסנן עם 1-2 מ"ל נוספים של PBS.
  12. פינה כל דגימות homogenate לתוך צינור אחד 50 מיליליטר חרוטים לרכוש ספירה תאים הכוללת.
  13. לאחר ביצוע ספירת תאים, לפצל את homogenate שווה לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל (1 צינור לכל מנוע מדגם). צנטריפוגה במשך 10-12 דקות ב g 300 x.

4. בקשת חרוז אנטי A2B5, טיהור טור, ו ציפוי

  1. לבצע חישובים עבור חיץ העמודה microbeads אנטי A2B5. להוסיף 7 טור μl הצפת לכל 1 x 10 6 תאים. מוסיפים 2 microbeads μl אנטי A2B5 לכל 1 x 10 6 תאים.
  2. לשלב את כל דגימות ידי resuspending התאים בנפח כולל של 10 מ"ל של חיץ צנטריפוגות טור ב XG 300 במשך 10-12 דקות.
  3. Resuspend התא גלולה ב את הכמות המתאימה של חיץ טור כפי שחושב בשלב 4.1. אם הגלולה גדולה ומשוחררת, רק להוסיף כמחצית מהיקף חיץ טור לשמור על אנטיגוף בריכוז המתאים resuspension התא.
  4. לדגור על השעיית התא למשך 10 דקות ב 4 °.
  5. להוסיף microbeads אנטי A2B5 (המחושב בשלב 4.1), להפוך מספר פעמים לדגור על 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כל 10 דקות. פעמי דגירה כבר עשויות להגדיל את תשואות תא, אך עלולות להגביר את הלא ספציפי מחייב.
  6. הוסף 5 כרכים של חיץ טור. אם התאים הם resuspended בנפח של 1 מ"ל, להוסיף 5 מ"ל של חיץ טור, ואילו אם התאים resuspended ב 2 מ"ל, להוסיף 10 מ"ל של חיץ טור.
  7. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x.
  8. ברר כמה LS עמודות יהיה צורך לטיהור. טור אחד LS מספיק 15-20 x 10 6 תאים בסך הכל.
  9. Resuspend התא גלולה ב 1,000 μl של חיץ טור לכל עמודה LS בשימוש.
  10. ראש כל עמודה LS ידי הוספת 5 מ"ל של חיץ טור. אסוף את הזרימה דרך צינור חרוטי 50 מ"ל. לאחר bu העמודהffer עבר לחלוטין דרך החדר העליון, להחיל 1,000 μl של ההשעיה תא כל עמודה ולאפשר לתאים לרוץ דרך על ידי כוח הכבידה.
    הערה: אם צפיפות תא גבוה מדי, בעמודה יכולה לרוץ לאט.
  11. מיד לאחר ההשעיה תא עבר דרך העמודה, לאט להוסיף 3 מ"ל של חיץ טור כל עמודה כדי לשטוף את התאים מאוגד. אם לשטוף פועל בקלות דרך העמודה (1 טיפה לכל 30-45 שניות), לשטוף פעמיים נוספות עם 3 מ"ל של חיץ טור.
  12. הסר כל עמודה ומניחים אותו על צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של חיץ טור לצלול למאגר דרך העמודה בקצב מהיר באמצעות הבוכנה פלסטיק שארוז עם הטור. צולל יהיה לסלק את התאים כבול משחררים אותם מהעמודה.
  13. גדל טוהר על ידי הפעלת המדגם באמצעות סיבוב השני של עמודות LS. השתמש שליש את מספר עמודות השימוש במהלך המעבר הראשון. ראש העמודות עם 5 מ"ל של חיץ טור.אפשר למאגר העמודה לעבור דרך החדר העליון.
  14. מאז נפח תא השעיה יהיה גדול הרבה, חל באופן שווה 1,000 μl של השעית תא כל עמודה ולאפשר ההשעיה לעבור דרך החדר העליון של עמודה לפני החידוש עם תוספת 1,000 μl.
  15. לאחר ההשעיה תא יושם לחלוטין לסיבוב השני של עמודות, לשטוף 2-3 פעמים עם 3 מ"ל של חיץ טור.
  16. הסר כל עמודה ומניחים אותו על צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי. הוסף 5 מ"ל של חיץ טור לצלול למאגר באמצעות הבוכנה פלסטיק שארוז עם הטור. צולל יהיה לסלק את התאים כבול משחררים אותם מהעמודה.
  17. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 300 12-15 דקות. הגלולה צריך להופיע קומפקטית.
  18. Resuspend התא גלולה ב 5-10 מ"ל של התקשורת התפשטות OPC מחומם מראש (בסיס מדיה OPC בתוספת מ"ל / PDGF-AA 20 נ"ג).
  19. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
  20. פלייט תאים. לדלל את התאים ל -60,000 תאים / מ"ל ​​עם התקשורת התפשטות OPC. לתוך כל שחור, ברור התחתון 24 היטב, pipet 500 μl של תאים לאורך דופן הבאר להשיג 30,000 תאים לכל טוב. מערבבים את התאים על ידי רועדת את הצלחת אופקית באמצעות הספרה שמונה תנועה. אם ביצוע assay ב 48, 96, או 384 גם הצלחות, להוסיף 15,000, 7,500, או 1,500 תאים לכל טוב, בהתאמה. מספרים אלה עשויים להיות מותאמים בהתאם למפרטי צלחת פרט.
  21. הכן צלחת נפרדת עבור תרבויות שליטת בסיס יום 0. צלחת מלאה זה אמור להיות קבוע עם paraformaldehyde 4% כמפורט בסעיף 5.7, כאשר ההבחנה היא יזמה ביום 0.
  22. התרבות התאים מדיה התפשטות OPC על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים ללא שינוי התקשורת.

אינדוקציה 5. בידול OPC ו קיבוע עם 4% Paraformaldehyde

הערה: כאשר בודקים את ההשפעה של מולקולות קטנות על oligodendrogenesis, אנו שגרנו dissolvתרופות דואר ב sulfoxide דימתיל (DMSO) להכין 1,000x מניות שניתן לאחסן מכן ב -80 ° C ומדולל ישירות לתוך התקשורת SATO כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1% DMSO. ראינו שום שינוי או OPC התפשטות או בידול באמצעות ריכוז זה של DMSO (מידע לא מוצג).

  1. התקשורת טרום חמים OPC בסיס ל -37 מעלות צלזיוס, להפשיר מניות טיפול תרופתי לטמפרטורת החדר. בעת ביצוע טיפולים בשני עותקים, להכין כ 1.25 מ"ל של התקשורת לכל קבוצת טיפול צינור 1.5 מ"ל. לקבלת דוגמיות בשלושה עותקים, השתמש צינורות צנטריפוגה קיבולת 2 מ"ל לתת דין וחשבון על רפוי.
  2. הכן את תערובות מאסטר טיפול בארות לשכפל ידי דילול מניות טיפול ישירות לתוך בסיס מדיה OPC. מערבולת בקצרה או לערבב בעדינות כל mastermix כדי להבטיח חלוקה הומוגנית של הטיפול.
  3. כן 45 ננומטר triiodothyronine (T 3) כמו שליטה החיובית הרכב המתאים כמו שליטה השלילית. לדלל 10 מ"מ T 3 מניות1: 1,000 ב 1 מ"ל של בסיס מדיה OPC ולאחר מכן להמשיך לדלל בתמהיל מאסטר טיפול להפחתת הריכוז הסופי של DMSO במידת הצורך.
  4. לשאוב את התקשורת מן בקבוצת טיפול אחת בארות התרבות בכל פעם כדי למנוע התייבשות תאים. השתמש טיפ pipet 200 μl על סוף pipet פסטר זכוכית כדי למנוע גירוד חומר שחור מן הצדדים של הבאר לתוך התרבות.
  5. לאט לאט להוסיף 500 μl של mastermix טיפול לאורך דופן הבאר באמצעות pipet 1 מ"ל.
  6. דגירת התרבויות עבור מסגרת הזמן הרצויה, ביצוע חילוף תקשורת מלאה עם תקשורת טיפול טריה כל 2-3 ימים. אנו שגרתי להתבונן MBP + תרבות 30-40% לאחר 4 ימים בתקשורת בידול.
  7. בסוף תקופת הטיפול הרצוי, להכין paraformaldehyde 4% טרי (PFA) או להפשיר מלאי קפוא לטמפרטורת החדר. זהירות: PFA מאוד רעיל צריך להיות מוכן במנדף.
  8. לשאוב התקשורת ולאט לאט מוסיפים 4001; l של PFA לצד הבאר כדי לתקן את התאים. הדגירה הצליח במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
  9. לשאוב PFA ולאט לאט להוסיף 500 μl של D-PBS סטרילי (עם Ca 2 + ו Mg 2+) לצד הבאר כדי לשטוף את התאים. חזור על לשטוף סך של פי שניים יותר. אין לשאוב לשטוף סופי.
  10. לעטוף את הצלחת parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך עיבוד מאוחר יותר או להמשיך ישירות לשלב הבא. צלחות יכול להיות מאוחסן במשך מספר שבועות.

6. Immunocytochemistry וכימות של חלבון המיאלין הבסיסי

הערה: בעת ביצוע נהלי טיפול נוזל ב 24 הצלחות היטב, מומלץ לעבוד מהר כדי למנוע התייבשות התאים. כאן, שימוש aspirator ואקום רב ערוצית pipet רב ערוצית מומלץ.

  1. תביאו את הצלחת בטמפרטורת החדר, לשאוב את הבארות, ולהוסיף 250 μl של D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) המכיל 0.1% Triton X-100 ו -5%עז בסרום נורמלי (NGS). דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד מסלולית עדין.
  2. הכן את פתרון הדגירה העיקרית על ידי דילול חד שבטי עכבר אנטי MBP נוגדן 1: 1,000 ו הארנב polyclonal אנטי יקטין נוגדן 1: 200 ב D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) המכיל 5% NGS. לחלופין, הארנב polyclonal אנטי Olig2 ב 1: 1,000 ניתן להשתמש לנורמליזצית oligodendrocyte ספציפית בתרבויות גליה מעורבות. הכן מספיק פתרון עיקרי להכיל 250 μl לכל טוב.
  3. דגירת נוגדנים עיקריים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במשך 16-18 שעות עם רעד מסלולית עדין.
  4. לשאוב את הפתרון הדגירה העיקרי לשטוף את התאים 3 x 10 דקות עם 500 μl של D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) בטמפרטורת החדר עם רעד מסלולית עדין.
  5. בעוד שטיפת הצלחת, להכין את פתרון דגירה משני על ידי דילול אנטי עכבר 680 ו-ארנב נגד 800 נוגדנים 1: 500 ב D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) המכיל 5% NGS. מזעור החשיפה אור הסביבה בעת הכנת פתרון זה.
  6. לשאוב לשטוף סופי ולהוסיף 250 μl של פתרון דגירה משתיים. הגנו על צלחת מפני אור דגירה אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד מסלולית עדין.
  7. לשאוב את הפתרון הדגירה משני ולשטוף בארות 3 x 10 דקות עם 500 μl של D-PBS (עם Ca 2 + ו Mg 2+) בטמפרטורת החדר עם רעד מסלולית עדין.
  8. סרוק את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה מסוגלת לאתר 700 ננומטר ו 800 פליטת קרינת ננומטר. כנקודת מוצא, לקבוע את מוקדי לקזז 3 ורגישויות 1.5 עבור MBP, 5.0 עבור אקטין, ו -3.5 עבור Olig2. התאם את ערכי הרגישות לפי הצורך כדי להימנע מחשיפת יתר אות.
  9. לכמת את מידת oligodendrogenesis בשיטות אוטומטיות למחצה מבוססי תוכנה.
    1. השימוש בתוכנה, להגדיר את מצב ניתוח הצלחת "24 ובכן" וליישר במעגלים סביב tהוא ההיקף החיצוני של בארות סרק. הגדר את ערוץ נורמליזציה "800" ולייצא את עוצמות הקרינה מוחלטת ביחס עבור 700 ננומטר (MBP) ו -800 ננומטר (Olig2 / אקטין) ערוצים.
    2. מחלקים את עוצמת ב 700 ננומטר מעוצמת ב 800 ננומטר כדי לתת ביטוי MBP מנורמל ביחידות הקרינה היחסית. החישוב ממוצע של המדידות לשכפל ולהרחיב את הביטוי אל יום 0 + שולט PDGF לפי הצורך לניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPCs A2B5 החיובי מבודדים באמצעות בחירת תא חיובית באמצעות מערכת הפרדת עמודה מגנטית. לפני תחילת ההליך בבידוד, המוח כולו יוסר גורי חולדה כי הם בין P5 ו P7. ברגע שהמוח כולו מנותק בהצלחה מהגולגולת, נורות המוח קטנת ההרחה מוסרות באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס (איור 1 א). על מנת לבודד רקמת קליפת מוח מוחות ההיפותלמוס, התלמוס המוח התיכון הם נכרתו על ידי דיסקציה זהירה (האיור 1B). לאחר מכן, ההיפוקמפוס בסטריאטום מוסר באמצעות מלק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה מהירה ואמינה לבידוד OPCs עכברוש וכימות ב oligodendrogenesis במבחנה בתגובה לגורמים הניסיונות. באמצעות סלקציה חיובית, תשואות גבוהות של OPCs קיימא וטהור משמשים במישרין למטרות ניסויים. שיטה זו מייעלת את הבידוד, culturing, וצעדי הבידול לתוך מסגרת 1 בשבוע זמן, תאים קבועים ניתן לאחסן בנוחות על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות בלי לפגוע רגישות assay.

יתרון עיקרי עם מבחני קרינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרנט חסות: מכוני הבריאות הלאומיים; מספר גרנט: R37 NS041435.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חומרי חיתוך חזקים>
PBS ללא Ca2+ ו-Mg2+Mediatech21-040-CV1x
10 ס"מ פוליסטירן פטרי צלחותפישרברנד0857512
מיקרוסקופ דיסקציה קלהמוטיק SM2-168
<חזק>דיסוציאציה חומרים
Miltenyi Biotec130-090-753של צינור מסובב
רקמות עצביות (P)Miltenyi Biotec130-092-628ערכת דיסוציאציה אנזימטית
PBS עם Ca2+ ו-Mg2+corning20-030-CV1x
40 μ m מסננת תאיםקורנינג352340
<חזק>A2B5 טיהור עמודים 
אנטי-A2B5 מיקרו-חרוזיםMiltenyi Biotec130-097-864חרוזים כרוכים A2B5 נוגדן
LS עמודותMiltenyi Biotec130-042-401עמודות בחירה מגנטיות
EDTACorning46-034-Cl2 mM
PBS עם Ca2+ ו-Mg2+corning20-030-CV1x
סרום בקר אלבומין סיגמא-אולדריץ'A96470.50%
<חומרי תרבית חזקים>
PDGF-AAPeproTech Inc100-13A20 ננוגרם/מ"ל
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'D2650Hybri-Max 100 מ"ל
טריודותירונין סיגמא-אולדריץ'T639745 ננומטר
מלח קלמסטין פומראטסיגמא-אולדריץ'SML0445-100 מ"ג1 μ M
מלח Quetiapine hemifumarateSigma-AldrichQ3638-10MG1 μ M
N-אצטיל ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'A91655 μ גרם/מ"ל
פרוגסטרוןסיגמא-אולדריץ'P878360 ננוגרם/מ"ל
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P152410 μ גרם/מ"ל
PutrecineSigma-AldrichP750516 μ גרם/מ"ל
נתרן סלניטסיגמא-אולדריץ'S526140 ננוגרם/מ"ל
הידרוקורטיזוןסיגמא-אולדריץ'H013550 ננוגרם/מ"ל
d-ביוטיןסיגמא-אולדריץ'B463910 ננוגרם/מ"ל
אינסוליןסיגמא-אולדריץ'I66345 μ גרם/מ"ל
Apo-TransferrinSigma-AldrichT1147100 μ גרם/מ"ל
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A4161100 μ גרם/מ"ל
יסודות קורט Bקורנינג25-022-Cl1x 
תוסף B-27טכנולוגיות חיים175040441x 
פניצילין/סטרפטומיציןטכנולוגיות חיים151401221x 
DMEMLife Technologies11995-0651x 
24 בארות Visiplate שחור עם מכסהPerkin Elmer1450-605תרבית רקמה דרגה
<חזק>אימונוציטוכימיה וכימות
PFAסיגמא-אולדריץ'100-13A4%
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'787870.10%
סרום עיזים רגילג'קסון מחקר חיסוני005-000-1215%
עכבר חד שבטי אנטי-MBPBiolegendSMI-99P1:1,000 דילול
ארנב פוליקלונלי אנטי-אקטיןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-72101:200 דילול
ארנב פוליקלונלי אנטי-אוליגן 2MilliporeAB96101:1,000 דילול
עז אנטי-עכבר 680RDLicor926-680701:500 דילול
עז אנטי-ארנב 800CWLicor926-322111:500 דילול
Alexa Fluor 594 עיזים נגד עכברLife TechnologiesA110321:1,000 דילול
Alexa Fluor 488 עיזים נגד ארנבLife TechnologiesA110081:1,000 דילול
Prolong Gold antifade עם DAPILife TechnologiesP36931
DPBS עם Ca2+ ו-Mg2+Corning21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging SystemLicor
צינור חזק ערכת דיסוציאציה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
  2. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
  3. Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
  4. Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
  5. Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
  6. Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
  7. Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
  8. Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
  9. Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
  10. Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
  11. Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
  12. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  13. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  14. Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
  15. Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
  16. Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
  17. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
  18. Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
  19. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
  20. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  21. O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
  22. Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
  23. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Olig2

מאמרים קשורים