שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

סיכום

מאמר זה מציג שיטה מהירה ופשוטה לניהול בליאומיצין ישירות לתוך קנה הנשימה העכבר באמצעות אינטובציה. יתרונות עיקריים של שיטה זו הם כי הוא מאוד לשחזור, קל לשלוט, ואינו דורשים ציוד מיוחד או פעמי החלמה ממושכות.

תקציר

למרות כמה הבדלים אנטומיים ופיזיולוגיים, מודלים של עכברים ממשיכים להיות כלי חיוני לחקר מחלות ריאה אנושיות. רעילות בלאומיצין היא מודל נפוץ לחקר פגיעה ריאתית חריפה ופיברוזיס, ופותחו שיטות רבות למתן בלאומיצין (וחומרים רעילים אחרים) לריאות. עם זאת, לרבות מהגישות הללו, כגון החדרה דרך קנה הנשימה, יש חסרונות מובנים, כולל הצורך בהרדמה חזקה וניתוחי הישרדות. מאמר זה מדווח על שיטה מהירה וניתנת לשחזור של אינטובציה תוך-קנה הכוללת הרדמה בשאיפה קלה, הדמיה של קנה הנשימה ושימוש בספירומטר חלופי כדי לאשר את החשיפה. כהוכחת רעיון, עכברי C57BL/6 בני 8-12 שבועות קיבלו 2.0 יחידות לק"ג של בלאומיצין או נפח שווה ערך של PBS, וגם נקודות הקצה הפיברוטיות נמדדו לאחר החשיפה. הליך זה מאפשר לחוקרים לטפל בקבוצה גדולה של עכברים בתקופה קצרה יחסית עם הוצאות מועטות וטיפול מינימלי לאחר ההליך.

מבוא

למרות כמה הבדלים אנטומיים ופיסיולוגיים, ¹ מודלים בעכברים להמשיך להיות יקר למידול ביולוגיה אנושית בהיווצרות מחלה. ² מבחינה בעלי, עכברים קלים לטפל, יש זמן רבייה נמוך, אורך חיים מואץ, והם זולים יחסית לבית. עם התפתחות זנים ואסטרטגיות גנטיים שונים (למשל., ביטולי דפיקה על תנאי, עכברי כתב, גישות התחקות שושלת, וכו '), כמו גם המגוון הרחב של חומרים כימיים זמין (למשל., נוגדנים, חלבונים רקומביננטיים, מעכבים, וכו '), עכברים הפכו אורגניזם חוליות מודל חיוני לחשוף תהליכים הומאוסטזיס ומחלות של בני אדם. ³

עכברים כבר בעל ערך במיוחד עבור לחקור את תנאי ריאתי, כולל פגיעה ריאות חריפה (ALI) ופיברוזיס ריאתי. ⁴ עלי בבני אדם יכול להיגרם על ידי טראומה, פציעה, או אלח דם ומאופיין אפיתלדליפת האנדותל (כלומר., בצקת), דלקת, סיסטיק המתהווה. בחולים רבים, עליי מתקדם הצורה החמורה שלה, תסמונת מצוקה נשימתית החריפה (ARDS), עלולה לגרום סיסטיק ותמותה עקב אי ספיקה נשימתית. ^5,6 פיברוזיס ריאתי הוא פתולוגיה פרוגרסיבי, קטלנית המאופיינת בתצהיר העודף של תאי מטריקס , בעיקר סוג I קולגן, שמוביל את תפקוד ריאות לקויות. ^7,8 מנהל בליאומיצין (BLM) הוא מודל הנפוץ ביותר והטוב ביותר מאופיין גרימת ALI סיסטיק בחיות מעבדה. ⁹ למרות פיברוזיס ריאתי נגרמת BLM במכרסמים עושה לא לשחזר באופן מלא פנוטיפים fibrotic האדם, ¹⁰ מחקרי עכבר עם המודל הזה הובילו לגילוי של גורמים רבים חשובים המשפיע על ההופעה וההתקדמות של המחלה. ¹¹

בעוד המנגנון המדויק (ים) מאחורי fibrogenesis הנגרמת BLM אינם ידועים, הפגיעה ייזוםהוא חשב לנבוע הפסקות גדיל DNA קשר תלויי לתאי האפיתל המצפים את דרכי הנשימה alveoli ניצוח, ובפרט, סוג 1 pneumocytes. ¹² הצורך במגע ישיר בין BLM ואת אפיתל ריאתי מדגיש את החשיבות של מסלול משלוח חזקים גם, וחששות אלה רלוונטיים למגוון רחב של טיפולים הממוקדים אל דרך נשימת דיסטלי, כולל חלבונים רקומביננטיים, נוגדנים, siRNA, וירוס, חיידקים, חלקיקים, ועוד. שאיפת לוע תחתונה (OPA) כבר בשימוש נרחב למטרה זו ^13, אבל רב סרן חסרון של OPA הוא אותו חלק חלק הסוכן נמסר עלול להיבלע לתוך מערכת העיכול, ולכן היא מובילה חוסר דיוק במינון המנוהל. גישה נוספת נפוצה היא החדרת transtracheal, שכרוכה הנשמה בהרדמה חזקה כדי לחשוף את הקנה הנשימה ההחדרה של סוכן ישירות לדרכי נשימה. ¹⁴ עם זאת, לא רק רשאית כזההליך להיות רצוי בשל invasivity שלה, אבל זה גם גוזל זמן דורש קצת הוגן של אימונים, וגורם לפגיעה חזקה אל דרך הנשימה. ^15,16 פרוטוקולים פותחו מספר שקשור לניהול הישיר של הסוכנים לתוך קנה נשימה ללא צורך בהתערבות כירורגית, ^{16,17,18,19,20} אך שיטות אלו כוללות זמני התאוששות מורחבות הנגרמת על ידי הרדמה חזקה, השימוש בציוד יקר (כלומר., otoscope / לרינגוסקופ, לוחות הליך זמינים מסחרי, סיבים אופטיים חוטים, וכו '), עודף של מניפולציה של חלל הפה, ואי ודאות לגבי המינון.

מאמר זה מתאר שיטה קלה יחסית של הממשל באמצעות אינטובציה המאפשר חוקר במהירות, ובזול, ולטעת מגיב באופן מהימן לתוך הריאות בעכברים עם סיכון מוגבל של נזק שיורי אל הרקמות הסובבות.

פרוטוקול

הטיפול בבעלי החיים המוסדי השתמש הוועדה (IACUC) באונ' וושינגטון Cedars-Sinai Medical Center אשרה את עבודת החיה הכרחית ללימודים אלה.

1. הכנה

1. לעקר הן מלקחי הסוף הבוטים החיטוי באמצעות depressor.
2. שימוש ארון בטיחות ביולוגית, להכין מלאי העבודה של BLM ב PBS מן אבקת lyophilized. Sonicate הפתרון במשך 10 דקות ב 35 Khz כדי להבטיח ערבוב אפילו.
   הערה: נפח כולל של בין 30 ל 45 μl מומלץ למנוע וריאצית pipetting בקצה נמוך, וחנק עם נפחים גדולים יותר.
3. הכינו סביבת עבודה נקייה הכוללת כ 1 מ ^'2 עבור ההליך עצמו, כמו גם במקומות המיועדים כלובים הן לפני ואחרי הניתוח.
4. תקן את הבסיס של לוח ההליך לספסל מייד מול החוקר על ידי נחת 2 או 3 רצועות של סרט מעבדה ברחבי הבסיס underlיינג הספסל. ראה איור 1 עבור מפרטים נוספים על יצירת לוח.
5. עניבת אורך יחיד של חוט תפירת גודל 4.0 בין שני ברגי המיצוב של לוח ההליך.
6. צור spirometer מאולתר על ידי הסרת ולהשאיר את הבוכנה משלושה 1 מ"ל מזרקים, והפקדת 60 μl של PBS לתוך החלק העליון של כל חבית כדי ליצור חותם אטום. אבטח את הרכזת של הקטטר רופף לאחד מזרקים ולמקם אותו לצד אחד של הלוח.
7. לשאוב 300 μl של אוויר לתוך מזרק 1 מ"ל ומניחים אותו בצד אחד של הלוח.
8. לחתוך חתיכה נוספת של סרט כ 6 ס"מ באורך ומקום לצד אחד. זה ישמש כדי לאבטח את החיה ללוח בשלב 2.4.
9. הגדרת תא isoflurane. צרף O _2, isoflurane, ואקום אל היציאות המתאימות משני תא החשיפה ואקום אישור. לחלופין, לנהל הרדמה בבית isoflurane תואם ביולוגיבארון בטיחות.

אינטובציה 2.

1. להרדים את העכבר עם isoflurane בתא עד שהוא מאבד את ההכרה והנשימה מאט לקצב המתאים. חשיפה טיפוסית כולל 4 isoflurane% ו -2% O ₂ במשך 3 עד 4 דקות, ואת התוצאה האידיאלית היא 2 עד 2.5 דקות של הרגעה. זה מתאים קצב נשימה של 1 נשימה כל 2 שניות.
2. בזמן ההמתנה הרגעה כדי להגדיר, לשאוב בין 30 ל -45 μl של BLM לתוך פיפטור ומקום לצד אחד.
3. כאשר מוכן, להשעות את העכבר מסומם על ידי החותכות העליונות שלה מן החוט מחובר ברגי המיצוב של פלטפורמת ההליך. ודא כי dorsum של חיה שוכב על משטח הפלטפורמה.
4. נזהר שלא להגביל אוורור, במקום חתיכת סרט רופף ברחבי הנמוך (הזנב) החלק של חלל בית החזה, ממש מעל הסרעפת. מיקום צריך להיות חזק מספיק כדי לשמור על יישור נכון במהלך procedure, אבל לא כל כך חזק, כי זה מגביל נשימה.
5. הפעל את הפנס כדי בין 80% ל- 100% עוצמת ו לכוון את מתכווננת כך שזה 1 עד 2 ס"מ מפני השטח של העור, ליד מקלעת השמש. לבדוק מדי פעם את הקצה מתכווננת עבור חום כדי לוודא שהוא אינו פוגע העכבר.
6. עומד מאחורי הפלטפורמה, השתמש מלקחי סוף סטרילי, קהים כדי לאתר את הלשון. להיות זהירים, כדי למנוע חותכות התחתונות, בעדינות האחיזה לצייר את הלשון מתוך חלל הפה.
7. שימוש ביד נותרת, הכנס במלחוץ ולהשתמש בו כדי לשטח את הלשון כנגד הרצפה של חלל הפה. שחרר את המלקחיים, אבל להשאיר את במלחוץ מקום על שני השלבים הבאים.
8. אוריינט האור, כך קנה הנשימה גלוי על ידי המנחה את מתכווננת proximally מרמת מקלעת השמש עד שהוא מגיע לרמה של הסמפונות mainstem.
   הערה: קנה הנשימה ניתן להבחין בקלות על ידי פעולה של הנשימה, WHIch גורם האור הנפלט להשתנות בעצמה. כאשר בצורה נכונה, מבנה זה יהיה להבחין במישור צירית כמו סיכה במיקום מרכזי של אור עם אור הסביבה מינימלי של חלל הפה עצמו.
9. זווית המזרק כך שהוא עוקב אחר נתיב טבעי של קנה הנשימה, ולהפחית את קצה הצנתר 22-G, עם המזרק המצורף המכיל את אגל, ישר לתוך לומן. בועת PBS תתחיל לעלות ולרדת עם כל נשימה על שמה מוצלחת.
   הערה: פעולה זו עשויה להתעכב על ידי כמה שניות כתוצאת סדציה עמוקה.
10. להאכיל את הקטטר בתוך מ"מ 5 נוסף. הסר את depressor לשון.
11. Shift את המזרק ביד השנייה, מרתק הרכזת, להסיר בעדינות את המזרק.
12. הפקדה בין 30 ל 45 μl של BLM למרכז הפנים של רכזת קטטר, לצרף את המזרק השני ולחלק 300 μl של אוויר לרכזת.
13. החזר את השנימזרק עם המכיל את הבועה הראשונה של PBS. הבועה תמשיך לעלות ולרדת אם ההליך בוצע בהצלחה.

טיפוח 3. פוסט-פרוצדורליים

1. הסר את הקטטר ואת הקלטת, והמקום חי במקום חמים ויבש עד להכרתו - בדרך כלל בתוך כמה דקות.

תוצאות

עכברים מחוברים לצינור נוטר יומיים לירידה במשקל ומצוקה, והקריבו 4, 10 או 17 ימים לאחר מכן באמצעות זריקת intraperitoneal של 2.5% 2,2,2- tribromoethanol. ברונכואלוואולרית שטיפה (BAL) נאספה שלוש שוטף של PBS כמתואר במקום אחר ²¹ , ואת הריאה הימנית נקבע בפורמלין 10%, פרפין מוטבע, מוכתם Trichrome של מייסון ידי אוניברסיטת היסטולוגיה וושינגטון והדמיה Core ^22.

דיון

במקרים שבהם aerosolization אינו מעשי בשל זמינות מגיב מוגבלת, בטיחות, או עלות, ממשל קנה נשימה ישירה הוא השיטה מעולה למסירה של סוכני אקסוגניים לריאות ¹⁶ החדרת Transtracheal כבר בשימוש נרחב כדי להשיג את זה.; עם זאת, כמו עם כל התערבות כירורגית, הוא גם נושא עמו פוטנציאל מסיבוכים שנגרמו בשל ההליך עצמו, ולאו דווקא הסוכן להיות החדירו. ¹³ מסיבות אלה, זה הפך להיות נפוץ יותר ויותר לניהול חומר ישירות לתוך קנה הנשימה באמצעות אינטובציה ^{16,17,18,19,2...}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בלאומיצין להזרקה, 30 יחידות/בקבוקון	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשהות את BLM ב-PBS, להצטט ולאחסן כ-aliquots לשימוש חד פעמי
מלקחיים
(כלומר אלקטרודת להב Valleylab כפופה, 2.4 אינץ')	Covidien	E1551G	לפני השימוש, צור כיפוף של 45 מעלות 1.5 ס"מ  מקצה הלהב. ניתן ליצור מדכא מתאים גם מכל כלי מתכת במידות דומות.
קטטר אקסל סופת 22 גרם X 1 אינץ'	Exel International	26746
1 מ"ל מזרק טוברקולין חד פעמי עם קצה החלקה (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 מ"ל פיפטור וקצות
Fiber-Lite Illuminator. דגם 181-1: דגם 180 משודך לתאורת צוואר אווז כפולה סטנדרטית	של דולן ג'נר תעשיות, בע"מ.	181-1	תאורת LED עם תפוקה נמוכה יותר אינה מומלצת מכיוון שהם לא מצליחים להאיר את קנה הנשימה בצורה מספקת.
		אינטובציה	ראה תרשים 1.
סרט תווית צבעוני: 0.5  ב.	פישרברנד	15-901-15A
חמצן
מלח עם חוצץ פוספט, 1X	Corning	21-040-CV	המוצר צריך להיות סטרילי
סליל תפר קלוע שחור משי לא סטרילי, 91.4 מ ', גודל 4-0	מכשיר הרווארד	517698
מכונת הרדמה שולחנית ציוד רפואי איזופלורן	היילנד http://www.highlandmedical.net/
שקופית עליונה אינדוקציה עכבר איזופלורן תא	איזופלורןMIP / טכנולוגיות הרדמה	AS-01-0530-SM
פוראן (איזופלורן, USP) נוזל לשאיפה 100 מ"ל	בקסטר	1001936040
מערכת פתולוגיה דיגיטלית של ננו-זומר	ערכת כימות Hamamatsu
IgM ELISA	מעבדות בתיל	E90-101

מדכא לשון בקצה קההמסנןלוח רחב מי