מאמר שיטה

ניתוח In vivo נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

DOI:

10.3791/53792

⸱

29 באפריל 2016

 ,  , 
1CNRS UMR8197 – INSERM U1024, IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure, 2Department of Physiology Development and Neuroscience, University of Cambridge

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאים היא המפתח למצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כולל גרורות סרטניות. הבסיסים התאיים והמולקולריים של נדידת התאים נותחו ביסודיות במבחנה. עם זאת, נדידת תאים in vivo שונה איכשהו מנדידת מבחנה, והוכחה כקשה יותר לניתוח, בהיותה פחות נגישה לתצפית ישירה ומניפולציה. פרוטוקול זה משתמש בנדידת הצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית בעובר דג הזברה המוקדם כמערכת מודל לחקר תפקודם של גנים מועמדים בנדידת תאים. אבות הלוח הקדם-כורדלי יוצרים קבוצת תאים אשר, במהלך הקיבה עוברת הגירה מכוונת מהמארגן העוברי לקוטב החיה של העובר. הפרוטוקול המוצע משתמש בהשתלת תאים ליצירת עוברי פסיפס. זה מציע את היתרונות המשולבים של תיוג תאים מבודדים, שהוא המפתח להדמיה טובה, ושל הגבלת השפעות הרווח/אובדן התפקוד לתאים הנצפים, ובכך להבטיח השפעות אוטונומיות של התאים. אנו מתארים כאן כיצד הערכנו את תפקודו של רכיב TORC2 Sin1 בנדידת תאים, אך ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לנתח את תפקודו של כל גן מועמד בשליטה על נדידת תאים in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת יצורים רב-תאיים, נדידת תאים היא חיונית הן לפיתוח העובר שבו היא מבטיחה הארגון של תאים לתוך רקמות ואיברים, ובמשך חייו הבוגרים, בו היא לוקחת חלק הומאוסטזיס רקמות (ריפוי פצעים) וחסינות. בנוסף לפונקציות פיזיולוגיות אלה, נדידת תאים הוא מעורב גם במצבים פתולוגיים מגוונים, כולל, ובמיוחד, גרורות סרטניות.

נדידת תאים כבר נתחה במבחנה במשך עשרות שנים, מתן הבנה כוללת של המנגנונים המולקולריים הבטיחו תנועות תא על משטחים שטוחים. בשנת vivo עם זאת, תאים עומדים בפני סביבה מורכבת יותר. זה בבירור הופיע בשנים האחרונות כי הגירה בתוך אורגניזם עשויה להיות מושפעת רמזים חיצוניים כגון תאי מטריקס, תאי שכנים או כמוקינים מופרשים מנחת הגירה, וכי מנגנוני נהיגת נדידת תאים עשויים להשתנות ממה תוארה במבחנה 1,2. המנגנונים הבטיחו נדידת תאי vivo קבלו פחות תשומת לב עד כה, בעיקר בשל הקושי הטכני גדל, לעומת במבחנה. בשנת vivo ניתוח נדידת תאים בפרט דורש גישה אופטית ישירה תאים נודדים, טכניקות לתייג תאים ייחודיים כדי לראות דינמיקה המורפולוגיה שלהם, כמו גם רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב לבחון את התפקיד של גנים מועמדים. עד כה, רק כמה מערכות מודל מחסה מאפיינים אלה שימשו לנתח בתא vivo הגירה 3.

אנחנו לאחרונה השתמשנו ההגירה של צלחת prechordal הפוטנציאלית עוברות דג זברה מוקדם כמערכת מודל הנוח חדשה להעריך את הפונקציה של גני מועמדים בשליטת נדידת תאי vivo 4,5. צלחת prechordal פרוספקטיבי (הידוע גם בשם mesendoderm הקדמי) היא קבוצה של תאים ויוצרים בתחילת Gastrulation בצד הגבי של העובר. במהלך gastrulation בקבוצה זו נודד קולקטיבי כלפי קוטב החיה של העובר 6-8, כדי ליצור את צלחת prechordal, עיבוי mesendodermal, קדמית notochord: ומתחת הצלחת העצבית. החלק הקדמי של צלחת prechordal יהיה להצמיח בלוטת הבקיעה, בעוד החלק האחורי שלה תורם סביר לעמוד בראש mesoderm 9. הודות לפיתוח החיצוני בהירות אופטית של עובר הדג, נדידת תאים ניתן ישירות ובקלות שנצפתה המבנה הזה.

השתלת תאים היא טכניקה חזקה מאוד המאפשרת יצירה המהירה וקלה של עוברת פסיפס 10. הבעת סמני cytoskeletal פלורסנט בתוצאות תאים המושתלים בתוך התיוג של תאים בודדים, המורפולוגיה והדינמיקה של אשר ניתן להבחין בקלות. שילוב זה רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב היתרי ניתוח של פונקציות אוטונומיות התא של פחיתגן didate.

הפרוטוקול המובא מתאר כיצד אנו הערכנו את הפונקציה של Sin1 רכיב TORC2 בשליטת דינמיקת גירה תקטין תא in vivo 5. אבל, כאמור בתוצאות ודנו עוד יותר, זה יכול לשמש כדי לנתח את המשמעות הפוטנציאל של כל גן מועמד בשליטת נדידת תאי in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: איור 1 מציג את קווי המתאר של הפרוטוקול.

1. הכנה של מחטי הזרקה והשתלות

הערה: מחטים ניתן להכין בכל עת ומאוחסנים. שמור אותם בצלחת פטרי, על להקה של פלסטלינה. חותם את המנה עם parafilm כדי להגן מפני אבק.

  1. עבור מחטי הזרקה, משוך נימי זכוכית (מחוץ מ"מ קוטר 1.0, בתוך מ"מ קוטר 0.58, ללא נימה (ראה רשימת חומרים)) עם חולץ micropipette (ראה רשימת חומרים). העדף מחטים קצרות ודקות (חלק מחודד של כ -5 מ"מימ) כפי שהם יעילים יותר על מנת שתוכל לחדור סיסיים.
    הערה: מחטי ההזרקה הן לשימוש יחיד.
  2. מחטי השתלת תאים
    1. משוך נימי זכוכית (מחוץ מ"מ קוטר 1.0, בתוך מ"מ קוטר 0.78, ללא נימה (ראה רשימת חומרים)) עם חולץ micropipette.
    2. Uלשיר microforge (ראה רשימת חומרים), לחתוך את קצה המחט בנקודה שבה הקוטר הפנימי הוא 35 מיקרומטר (מעט יותר מאשר הקוטר של תאים להיות מושתל).
    3. שפוע גפי החתך של הנימים עם microgrinder (ראה רשימת חומרים) עם זווית של 45 מעלות.
    4. לחלופין, למשוך עקיצה על קצה המחט באמצעות microforge. לשם כך, גע הנימה החמה עם הקצה שפוע במהירות ולמשוך אותו משם, יצירת עקיצה שיכול לעזור חודר העובר.
    5. הר מחט על בעל מחט מצורף מזרק. באמצעות מזרק, לשטוף את החלק הפנימי של שלוש פעמים מחט עם 2% חומצה הידרופלואורית לחסל שאריות זכוכית, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם אצטון.
      זהירות: חומצה הידרופלואורית הוא רעיל, לתפעל מתחת למכסה המנוע, עם כפפות.
      הערה: מחטי ההשתלה ניתן להשתמש מספר פעמים.

2. הכנהכלים עבור הזרקת השתלת תאים

  1. מחממים 50 מ"ל של העובר בינוני 11 המכיל 0.5 גרם של agarose במיקרוגל דקות 1 במלוא העוצמה כדי לקבל agarose 1% בטווח הבינוני העובר. מצננים את הג'ל agarose לכ -60 מעלות צלזיוס ויוצקים את 50 מ"ל בצלחת 90 ​​מ"מ פטרי. מניח על פני השטח של הג'ל תבנית ומעוצבת (ראה רשימה של חומר), או עם קווים עבור מנת הזריקה או עם בארות עבור מנת השתלת תאים.
    1. שים מצוף העובש על agarose, אם agarose לא חם מדי. לאחר ג'ל agarose מוגדר, להסיר את התבנית עם מלקחיים (איור 2 א - ב).
      הערה: ניתן לאחסן מנות ב 4 ° C, עד כמה שבועות. שמור אותם בתוך קופסא סגורה רטובה, כדי למנוע התייבשות.
  2. מניח את הצלחת בתוך 30 דקות C חממת 28 מעלות לפני השימוש.

אוסף 3. עבר הזרקה

  1. הכנת פתרון הזרקה
    הערה: תחום מחייב תקטיןשל אקטין שמרים חלבון מחייב 140 (ABP-140) כגון Lifeact כבול mCherry (המכונה ABP140-mCherry) משמש לדמיין אקטין polymerized בתוך התא, על מנת לנתח את פעילות ובולטות. הוסף עוד מתחם לבחון את תפקידו של גן מסוים המועמד (למשל mRNA של מבנה שלילי דומיננטי או constitutively פעיל, או oligonucleotides Morpholino). כדי להעריך את תפקידי Sin1 כמתואר התוצאות (איור 3), השתמשנו oligonucleotides Morpholino. כביקורת, השתמשנו morpholino זהה morpholino sin1 אבל במשך 5 נוקלאוטידים מופצים לאורך הרצף כך morpholino שליטה זו אינה תואמת את היעד RNA.
    1. Sin1 ההפשרה morpholinos מלאה 5-התאמה (2 פתרונות מניות מ"מ), ו ABP140-mCherry mRNAs על הקרח. להוסיף 375 ננוגרם של mRNAs (75 ng / μl סופי) ו -0.75 μl של כל אחד sin1 או morpholino מלא 5-התאמה (0.3 מ"מ סופי) במאגר Danieau (58 mM NaCl, 0.7 מ"מKCl, 0.4 מ"מ MgSO 4, 0.6 מ"מ Ca (NO 3) 2, 5.0 מ"מ HEPES pH 7.6), כדי להגיע בנפח כולל של 5 μl.
  2. אוסף העובר
    הערה: עבור הניסוי הזה להגדיר שני עוברי תורם מארח הם מהונדסים, המבטא את ה- GFP תחת השליטה של goosecoid (GSC) האמרגן כדי להמחיש את הצלחת הפוטנציאלית prechordal 11.
    1. אסוף Tg (GSC: GFP) ביצים. מניח כ -80 ביצים בצלחת 90 ​​מ"מ פטרי מלא בינוני העובר לדגור על 28 מעלות צלזיוס.
  3. להזריק עוברי תורם
    1. תחת סטראו, לסחוט עוברים שנאספו בעדינות עם מלקחיים לתוך השורות של צלחת הזרקה מלאה בינוני עובר. בעזרת מלקחיים, כוון את העוברים עם התאים כלפי מעלה. מניחים את צלחת הזרקת בחממה על 28 מעלות צלזיוס עד העוברים הגיעו לשלב 4 תאים (שלאחר ההפריה 1 hr).
    2. טען מחט הזריקה עם 2 μl שלפתרון ההזרקה. הכנס את מחט בעל מחט (ראה רשימת חומרים) אשר ממוקם בשכונת א-מניפולטור מיקרו (ראה רשימת חומרים) ומחוברת עם polytetrafluoroethylene (PTFE) צינורות (ראה רשימת חומרים) אל transjector אוויר (ראה רשימת חומרים ).
    3. פתח את הנימים ידי נגיעת הקצה בעדינות עם מלקחיים בסדר. במידת צורך, לחתוך את הנימים פתוחות ידי צובט הגפיים שלה.
    4. זן אחד מארבעה התאים עם המחט ולהזריק הפתרון בתוך התא כדי למלא 70% מנפח התא (2 nl). להזריק 30 עובר.
      שים לב: המחט בתא עלול להיות קשה, כמו קרום התא הוא רך. מכוון בצומת בין התא ואת חלמון מקלת חדירת מחט.
    5. מניחים את העוברים בחממה C 28 ° עד שהם הגיעו לשלב כדור (לאחר ההפריה 4 שעות).

4. הכנת העוברים עבור Cell Transplantatיוֹן

  1. הכן 20 מ"ל של מדיום העובר עם 200 פניצילין / סטרפטומיצין μl (ראה רשימת חומרים) (פן / סטרפטוקוקוס EM).
  2. Dechorionation של העוברים בשלב כדור (4 שעות לאחר ההפריה)
    הערה: עוברים Dechorionated הם שבירים מאוד תתפוצץ במקרה של מגע עם אוויר או פלסטיק. הם ובכך צריכים להציב מנות מצופות agarose, והועברו עם טפטפות פסטר זכוכית אש מלוטשת.
    1. בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק, להעביר לארח עוברי שנאספו בשלב 3.2 ו עוברים התורם מוזרק בשלב 3.3 לשתי מנות פטרי 35 מ"מ מצופה agarose 1% בטווח הבינוני העובר ומלא פן / סטרפטוקוקוס EM. שמור עובר מארח עובר תורם בשתי מנות נפרדות.
    2. ידני לחלץ את העוברים מן chorions שלהם עם פינצטה בסדר (ראה רשימת חומרים).
    3. מניחים את העוברים בחממה C 28 ° עד שהם הגיעו לשלב מגן (שלאחר ההפריה 6 שעות).

5. השתלת תאים

  1. מסדרים את העוברים על השתלת תאים.
    1. תחת סטראו פלורסנט, עובר תורם בחר להביע ABP140-mCherry (אדום) בתוך המגן (הירוק).
    2. בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, להעביר את עוברי הבארות של מנת ההשתלה מלאה פן / סטרפטוקוקוס EM. מניח את עוברי המארח בשורה אחת ואת עוברי התורם בשורה השכנה.
    3. באמצעות עפעף, כוונו את העוברים בזהירות עם את המגן.
      הערה: המיקום של המגן ניתן להעריך על ידי ביטוי של GFP או אנטומית.
  2. קמת השתלת מערכת.
    הערה: מערכת השתלת מורכב בעל מחט (ראה רשימת חומרים) מחובר עם צינורות PTFE (ראה רשימת חומרים) וגם מחבר צינור (ראה רשימת חומרים) כדי מזרק המילטון מצויד בכונן מיקרו (ראה רשימה של חומרים). בעל המחטהוא רכוב על micromanipulator 3 כיוונים (ראה רשימת חומרים).
    1. באמצעות בעל מחט מצורף מזרק, יש לשטוף את המחט על השתלה תאית עם אתנול 70%. ניקוי על ידי מתחנף אוויר לתוך המחט. האם לא יבש על ידי נושבת, מכיוון שהדבר עלול לגרום אבק להיתקע בחלק החד של המחט.
    2. הכנס את מחט בעל מחט מחוברת המזרק המילטון, עם שיפוע כלפי מעלה.
  3. מגן-ל-מגן השתלת תאים
    1. הזן את המגן של עובר תורם עם מחט ההשתלה ותנסח על 10-20 תאים שכותרתו עם ABP140-mCherry. בזהירות להימנע מהדפסת חלמון.
    2. להשתיל את התאים לתוך המגן של העובר המארח. חזור על הפעולה עד כל העוברים המארח הושתלו.
    3. הסר את כל עוברים פגומים עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. מניחים את העוברים המושתלים בחממה ב 28 ° C ולתת להם להתאושש במשך כ -30 דקות.
    4. באמצעות מחטבעל מצורף מזרק, יש לשטוף את מחט השתלת תאים במים ומניח אותו בחזרה בצלחת פטרי על להקה של פלסטלינה. חותם את המנה עם parafilm.

6. (אופציונלית) השתלת תאים יחידה

הערה: העובר, תאים לדבוק זה בזה, כך שזה קשה לצייר רק תא אחד מחט ההשתלה. פתחנו פרוטוקול שונה להשתיל ובתאי צלחת prechordal יחידים בקלות. הרעיון הוא לנתק תאים לפני ההשתלה. בגלל ובתאי צלחת prechordal מבודדים נוטים לאבד את זהותם, אנו גנטיים להטיל להם זהות צלחת פוטנציאלית prechordal, על ידי הפעלת מסלול איתות הקטרים, בהעדרו של גורם שעתוק Sox32. אימתנו כי תאי המושרה האלה מתנהגים כמו ובתאי צלחת prechordal אנדוגני 8. להלן הצעדים הספציפיים לבצע השתלות תא בודדות. Cell dissociation מושגת על ידי הצבת עוברים רינגר סידן חופשי 11, לנתח explant מכנית לבחוש בו.

  1. בשלב 2.1, להכין את המנה השתיל עם agarose 1% ב רינגר סידן חופשי במקום עובר הבינוני.
  2. בשלב 3.1, בנוסף ABP140-mCherry רנ"א morpholino sin1, להוסיף 3 ng של RNAs המקודד את הצורה הפעילה של Taram-A רצפטור קטרי (0.6 ng / μl הסופי) ו -1.25 μl של morpholino נגד sox32 (פתרון המניה ב 2 מ"מ, ומכאן סופי 0.5 מ"מ).
  3. לאחר שלב 4, העביר שלושה עוברי תורם שנבחרו בצלחת עבור השתלת תאי מלאת הפן / סטרפטוקוקוס רינגר סידן החופשי בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת. עם פינצטה בסדר, לנתח explant המכיל את התאים המוזרקים (תאי שכותרתו ABP140-mCherry). במהירות וזורק את שאר העוברים.
  4. עם עפעף, בעדינות מערבבים את explant עד תאים לנתק.
  5. צייר את תא מבודד יחיד מחט ההשתלהו להשתיל אותו לתוך המגן של עובר מארח.
  6. בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטש, להעביר את העוברים בצלחת agarose מצופה מלא פן / סטרפטוקוקוס EM. מניחים את העוברים בחממה ב 28 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

7. עובר שמה

  1. לשכת הדמיה
    1. שיטה 1: השתמש תא הדמיה מורכב שקופית פלסטיק (75 * 25 * 0.5 מ"מ) מנוקבת 4 חורים (בקוטר 5.5 מ"מ), עם 3 מ"מ שוליים גבוהים בצד אחד (איור 2 ג - ד). מדביקים coverslip זכוכית על הצד האחורי, עם דבק cyanoacrylate (דבק סופר).
      הערה: בסוף הניסוי, מניח את החדר במים למשך לילה אחד כדי להסיר את coverslip להיפטר שאריות דבקות עם נייר חול.
    2. שיטה 2: השתמש 35 מ"מ מנות תחתית זכוכית MatTek (ראה רשימת חומרים) עם חור 10 מ"מ.
  2. שמה עובר
    1. מלאו את בקבוקון זכוכית עם 1 מ"ל של agarose 0.2% חם במדיום העובר.שמור את זה על 42 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום.
    2. תחת סטראו פלורסנט, בחר עובר שבה אדום תאים מושתלים הם חלק הצלחת prechordal הפוטנציאלי המסומנת בירוק (תאים מושתלים אדומים כלומר הם בתוך הצלחת prechordal הפוטנציאלית הירוקה, החלו נודד לעבר הקוטב בעלי החיים).
    3. העברת עובר שנבחר לתוך תמיסת agarose עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. מחק את העודף בינוני עובר מן פיפטה. צייר את העובר פיפטה עם agarose, ולהעביר את העובר בחדר הדמיה, הפקדת טיפת agarose. לפני agarose מוגדר, כוון את העובר עם עפעף. מניח את הצלחת הפוטנציאלית prechordal כלפי מעלה הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, או על תחתית זכוכית הדמיה עם מיקרוסקופ הפוכה. המתן עד agarose מוגדר (כ 1 דקות, תלוי בטמפרטורת החדר) לפני הרכבה העובר אחר בבאר הבא של החדר.
      הערה: צ'ה הדמיהmber המכיל 4 בארות מאפשר הרכבה עד 4 עוברים.
    4. כאשר agarose מוגדר, למלא את התא עם פן / סטרפטוקוקוס EM כדי למנוע התייבשות.

8. הדמיה חיה

  1. השתמש עדשת 40X מי טבילה ארוך טווח. השתמש בקבוצות מסנן מתאים לתדמית GFP ו mCherry (עבור GFP: עירור BP 470/40, קרן splitter FT 510, ופליטה BP 540/50; עבור mCherry: עירור BP 578/21, קרן splitter FT 596, ו LP פליטה 641 / 75). התאם משך חשיפה על מנת לייעל דינמיקת תמונה.
  2. חזרה לתמונה כל התאים בצלחת, לרכוש Z- ערימות, החל כמה מיקרומטר מעל צלחת prechordal הפוטנציאלית (ב האאקטודרם) וכלה כמה מיקרומטר מתחת צלחת prechordal הפוטנציאלית (בחלמון). השתמש z-צעד של 2 מיקרומטר. כדי לייעל את מהירות רכישה, להחליף צבעים בין Z- ערימות ולא בין מסגרות.
    הערה: זה עשוי להוביל הבדלים קלים בין התמונות הירוקות ואדום, אבל הוא לא בעיה מאז שום דו מדויק-localization בין האותות הירוקים ואדום נדרש. כדי לקצר את זמן הדמיה נוסף וחשיפה לאור, ירוק עשויים להירכש רק אחת ל -5 נקודות זמן, וזה מספיק כדי לזהות ובתאי צלחת prechordal.
  3. שימוש בהגדרות כאלה, תמונה עד 4 עובר בתוך פרק הזמן של שתי דקות שבו יש צורך לנתח תדירות וכיוון בליטה. באשר לניתוח חי בליטה, להפחית מרווח הזמן עד 30 שניות כדי לקבל החלטת זמן גבוהה. תמונה מתוך epiboly 60% עד 80% epiboly.

ניתוח 9. Dynamics הנייד

  1. טען תמונות 4D ב ImageJ
    הערה: בהתאם לתוכנה המשמש רכישה, תמונות מאוחסנות בפורמטים שונים (קובץ אחד לכל תמונה, קובץ אחד לכל Z- מחסנית, קובץ אחד עבור הניסוי כולו). תוספי ImageJ חלקם זמינים באינטרנט לפתוח ערימות 4D. הנתונים שלנו מאוחסנים כקובץ אחד לכל Z- מחסנית. מכיוון בסיס הנתונים יכול להיות גדול, זה עשוי להיות נוח לפתוח רק חלק ממנה (כמה timנקודות e, או subpart של Z- מחסנית, או 8 סיביות להמיר תמונות ...). אנו משתמשים תוסף מחוייט ImageJ לעשות זאת, אשר נשמח להפיץ על פי בקשה.
  2. ניתוח של כיווניות ותדירויות של בליטות ניידות
    1. השתמש בתמונות GFP כדי לקבוע את הכיוון העיקרי של הגירת צלחת prechordal הפוטנציאלית. קח את זה כנקודת התייחסות למדידות זווית בליטות תא. סובב את המחסנית, כך כיוון הפניה זו מקבילה צד אחד של התמונה.
    2. עקוב תא אחד. כלי זווית בחרו. עבור כל מסגרת וכל בליטה, השתמש בכלי הזווית כדי למדוד את הזווית בין הבליטה ואת כיוון ההפניה (איור 3 א). השתמש בפקודה לנתח / מדוד כדי לאחסן את הערך (או הקש M במקלדת). שמור את התוצאות כקובץ txt. חזור עם התא הבא.
    3. לייבא את הנתונים לתוך הפצת זווית R ו- עלילה כמו היסטוגרמות. השתמש בבדיקת קולמוגורוב-סמירנוב (ks.test ב R) כדי להשוות תנאים שונים.
      הערה: כלי הזווית מספק ערכים המורכבים בין 0 ° ו -180 °, המאפשר השימוש של מבחנים סטטיסטיים קלסיים ולא בדיקות מעגליות.
    4. עם מערך נתונים זה, לחשב תדירות פליטה כמספר בליטות לכל תא לדקה. השתמש סטודנטים T-test (t.test ב R) כדי להשוות תנאים שונים.
  3. ניתוח של Lifetime Cell בליטות
    1. עבור כל תא וכל בליטה, משך בליטת מדד (מספר המסגרות שבמהלכו הבליטה היא מרווח זמן x הנוכחי בין מסגרות).
    2. לייבא את הנתונים לתוך ר השתמש Student T-test (t.test ב R) כדי להשוות תנאים שונים.
      הערה: תכונות הגירה אחרות יכולות להיות מעניינות לנתח על מנת לאפיין את נדידת התאים. אלה כוללים מסלולי תא, עבור מהירות, כיוון ומדידות התמדה, או מורפולוגיה תא. יישומי תוכנה מסוימים מסחריים זמינים למדוד תכונות אלו, אך מספר רב של appli תוכנות קוד פתוחהקטיונים תוספים ImageJ זמינים אף הם, כמו למשל להסתגל לנתח morphodynamics 12, DiPer להסתכל מסלולי התא והתמדה כיוונית 13, CellTrack לעקוב אחר גבולות התא במהלך ההעברה 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה הציגה שמשה לנתח את התפקיד של Sin1, אחד מרכיבי הליבה של הטור 2 המורכב (TORC2), בשליטת נדידת תאי vivo. שימוש השתלת תאים מתיר תיוג של תאים מבודדים וניתוח של תופעות תאים אוטונומיים. סרט S1 מציג את ההגירה של ובתאים צלחת prechordal המושתלים. תיוג יקטין עם ABP140 מאפשר הדמיה הקלה של בליטות ציטופלסמית עשיר תקטנה. מדדנו תדירות והכיוון שלהם. Wild-type תאים לייצר בליטות ציטופלסמית גדולים תכופים אוריינטציה בכיוון של הקוטב בעלי חיים, <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג דרך קלה ללמוד את התפקיד של גן מועמד נדידת תאי in vivo, על ידי שילוב של היצירה עוברת chimeric באמצעות השתלה תאית עם הדמיה לחיות.

יצירה עוברת פסיפס

לימוד הדינמיקה של תא דורש הדמיה של קווי המתאר שלה לנתח סיומות cytoplasmic. זו יכולה להיות מושגת על ידי תיוג תאים מבודדים בתוך תווית אחרת - שכותרתו או אחר - סביבה, ובכך להציע ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-F. Bouallague ולמתקן בעלי החיים IBENS על הטיפול המעולה בדגי הזברה. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, מענקים N° SFI20111203770 ו-N° PJA 20131200143.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נימי זכוכית (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.58  מ"מ)מכשירי הרווארד300085נימי זכוכית בעובי סטנדרטי
(קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.78 מ"מ)מכשיר הרווארד300085
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'P433310  000  יחידות פניצילין ו-10  מ"ג סטרפטומיצין למ"ל
פינצטה עדינהDumont Fine Science Tools11254-20
5F כלי תחתית זכוכיתMatTekP35G-0-10-C
משדר אווירEppendorf5246
Micro-forgeNarishigeMF-900
MicrogrinderNarishigeEG-44
Micromanipulator (להזרקה)NarishigeMN-151
מיקרומניפולטור (להשתלת תאים)LeicaLeica מיקרומניפולטור
מזרק HammiltonNarishigeIM-9B
חולץ מיקרופיפטהדיוויד קופף מכשיריםדגם 720
תבנית השתלהAdapative Science ToolsPT-1
מחזיקמחטמחבר צינור NarishigeHI-7
NarishigeCI-1
PTFE צינורותNarishigeCT-1
דק דופן צינורות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
  2. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  4. Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
  5. Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474(2015).
  6. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
  7. Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
  8. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
  9. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  12. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  13. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
  14. Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
  15. Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
  16. Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
  17. Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  18. Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
  19. Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  20. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  21. Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
  22. Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Sin1TORC2

מאמרים קשורים