שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

גידול נוירונים בהיפוקמפוס בתנאים חוץ גופית מאפשר תצפית מניפולציה ניסויית של הנוירונים האלה כי הם אחרת לא ניתן in vivo. גישה ניסויית זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחשוף את המנגנונים עצביים של צמיחה, קוטביות, מפרט neurite, סחר ולוקליזציה subcellular של חלבונים, היווצרות הסינפסה והתבגרות פונקציונלית ^1. במבחנה אלו נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים, כאשר קוצרים בשלבים עובריים מאוחר, יחסית טהורים (> 90%) תאי glutamatergic של מורפולוגיה פירמידת ^2. בגלל נוירונים גדלו משטח 2-D בתנאים במבחנה, שיטה זו מאפשרת התבוננות קלה, כגון הדמיה לחיות או immunocytochemistry (ICC) מכתים באמצעות מטוס בודד מוקדי ^3; או מניפולציות, כגון טיפול תרופתי ו transfections ^3-6. כאשר גדל בצפיפות גבוהה, נוירונים נוטים להיות בעלי שיעור גבוה של הישרדות בגלל שיתוף גבוהncentrations של גורמי גדילה מופרשים בנוסף לתמיכת עיכול מתקשורת הצמיחה, וגם בגלל מנגנוני קשר תלוי neurite ^7. עם זאת, נוירונים בהיפוקמפוס נמוך צפיפות רצויים ללימודי מורפולוגיים, שבו נוירון יחיד ניתן הדמיה בשלמותו או מוכתם לניתוח ICC. נוירונים בצפיפות נמוכה קשה לשמור בתרבות בשל חוסר תמיכה paracrine וכך לעיתים קרובות דורשים תמיכה trophic מתוך גליה שכבת מזין (בדרך כלל קליפת המוח astrocyte), אשר צריך להיות מוכן לפני נוירון תרבות ^2. כאשר שיתוף תרבותי עם שכבת מזין תאים גליה, הנוירונים בצפיפות נמוכה גדלים על coverslips, ולאחר מכן התהפך על גבי שכבת גליה כך הנוירונים בצפיפות נמוכה גליה הם פונים זה לזה. מקום מוקף קטן בין גליה נוירונים נוצר על ידי הצבת נקודות פראפין על הפינות של coverslips, ולכן יצירת פריסה 'סנדוויץ' ^2,8,9. הנוירונים בצפיפות הנמוכים יגדלו within המוקף בין גליה ואת coverslip, אשר יוצר microenvironment מתירנית עם גורמים מרוכזים מופרשים על ידי תאי עצב גליה. גישה זו מניבה בצפיפות נמוכה, נוירונים מפותחים כי הם במרווחים סבירים, ולכן תיוג ICC להקל או בדיקות הדמיה לחיות.

חסרון לכאורה של תרבות שיתוף נוירון, גליה, מלבד היותם זמן רב ומייגע, הוא בכך שהיא מונעת מחקר של נוירון הספציפי, או תאים אוטונומיים, מנגנונים. למרות מערכת זו היא הרבה פחות מורכבת מאשר vivo רקמה עצבית, השפעה גליה על פיתוח נוירון דרך מופרש, גורמים לא-עדיין-מוגדר באופן מלא יכול לבלבל הניסויים ^10. לכן, בניסויים הדורשים חקירת מנגנוני נוירון ספציפיים, תנאי תרבות מוגדרות המסירים בסרום שכבת תמיכת גליה נחוצים. מחקר קודם הצליחה culturing ריכוזים נמוכים של נוירונים (~ 9,000 תאים / ² ס"מ) באמצעות המטריקס הידרוג'ל ממדי רי ^11. מאז אוכלוסייה עצבית יחסית טהורה יכולה להיות מתורבתת בצפיפות גבוהה בתנאים חופשיים בסרום ללא תמיכת גליה, אנו משערים כי צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס ניתן לגדל במדיום תרבות בסרום חינם שהוגדר על ידי שיתוף culturing אותם עם נוירונים בצפיפות גבוהים, ב באופן מקביל שיתוף תרבות נוירון, גליה אימצה כמקובל. אכן, תרבויות נוירון בהיפוקמפוס צפיפות גבוהה בתצורת 'סנדוויץ' שימשו לאחרונה לתמוך במספר קטן של נוירונים האנדוקרינית magnocellular מתמחה ^12.

לכן, שיתוף תרבות עם נוירונים צפיפות גבוהים עלולה לאפשר נוירונים בצפיפות נמוכים כדי לקבל תמיכת גורמי trophic כי די בכך כדי לאפשר הישרדות לטווח ארוכה. פרוטוקול זה של נוירונים צפיפות נמוכה במיוחד culturing ובכך גובש ומאומת. הפרוטוקול יכול להיות מיושם בתוך ניסוי בודד אחד, על ידי הכנת צפיפות גבוהה (~ 250,000 תאים / מ"ל) דיסנוירונים בהיפוקמפוס sociated הראשון, ולאחר מכן ביצוע דילול להניב צפיפות ~ 10,000 נוירונים / מ"ל (~ 3,000 נוירונים / coverslip, או ~ 2,000 נוירונים / ² ס"מ), שהוא הרבה יותר נמוך מאשר רוב דיווחו תרבויות בצפיפות נמוכה ^{2,3,9 , 11,13.} מצב תרבות זה נקרא רופף כתרבות "אולטרה-נמוך צפיפות 'ומשתמש עם' בצפיפות נמוכה 'בין-changeably. הנוירונים הצפיפות הגבוהים הם מצופים על 24 גם צלחות פולי- D- ליזין מצופות; בעוד נוירונים בצפיפות נמוכה הם זורעים על coverslips זכוכית פולי- D- ליזין מצופה 12 מ"מ אשר ממוקמות בתוך אחר צלחת 24 גם. Coverslips עם הדבקות נוירונים בצפיפות נמוכה הם התהפכו על גבי נוירונים צפיפות הגבוהים 2 hr מאוחר יותר לאחר נוירונים הם צאצאים ומצורפים coverslips. בנוסף, במקום להשתמש נקודות פראפין לרומם את coverslips מעל שכבת נוירון צפיפות הגבוהה, מחט מזרק 18 G שמשה לחרוט בתחתית 24 הצלחות גם עם שני פסים מקבילים. Displ וכתוצאה מכךaced, פלסטיק הסמוך לספק תמיכה גבוהה עבור coverslips הזכוכית. שטח זה נמדד באופן עקבי 150-200 מיקרומטר, המאפשר בינוני חמצן והתרבות מספיק חליפין תוך מתן microenvironment עם גורמי trophic מרוכזים. תחת תנאי זה, הנוירונים בצפיפות הנמוכים לגדול בהרחבה, והוא יכול לשרוד מעבר לשלושה חודשים בתרבות. כאשר נוירונים אלה הם transfected עם פלסמיד GFP לאחר שלושה שבועות בתרבות, הדנדריטים משובצים למכביר עם הקוצים הדנדריטים. כהוכחה עקרוני, הנתונים מוצגים להראות כי מערכת שיתוף תרבות זו תומכת תרבויות צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס זורעים על '-איים מיקרו' פולי- D- ליזין, שבו יוצרים נוירונים קשרים autaptic שעשויים להקל חקירת התא -autonomous, מנגנוני רשת עצמאית.

כל הפרוצדורות הכרוכות עכברים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת אריזונה, והותאמו להנחיות NIH.

רקמות 1. מקור עבור בהיפוקמפוס Neuron תרבות

1. כדי ליצור גורי עכבר טרום לידתי לתרבות נוירון בהיפוקמפוס, משתמש בעכברי זמן בהריון (C57BL6 / J) כי הם גדלו בבית ^17. היום עם זיהוי תוסף הנרתיק הוא יועד E0.5. שעת הקציר המתוכנן תרבות היא-E17.5 E16.5.
   הערה: פרוטוקול זה מתאר תרבויות של שני 24 גם צלחות של שני נוירונים בצפיפות גבוהה שיתוף culturing עם הנוירונים בצפיפות נמוכה (48 coverslips סך הכל). עבור צלחות יותר, חומרים ריאגנטים וניתן לשנותם בהתאם.

2. 24 גם צלחות הכנה תרבויות נוירון בצפיפות גבוהה

הערה: בצע את השלבים הבאים (2-3) היום לפני הקציר של עוברים המתוכננים.

1. תביא שני 24 היטבצלחות לתוך מכסה מנוע תרבית תאים, לפתוח את אריזת הפרט.
2. חבר מחט 18 G מזרק מזרק לשימוש חד-פעמי מפלסטיק 1 מ"ל.
3. החזק את המזרק, ולכוון את קצה המחט ב ~ 1 מ"מ משמאל למרכז לתחתית הבאר. להפעיל כוח מתון (~ 250 גרם) כדי לחרוט את תחתית הבאר (~ 1 מ"מ אורך). חריץ יוקם ואת והחומרים הפלסטיים שנעקרו יהוו תמיכה מוגבהת מעל פני השטח היטב התחתיים השטוחים. Etch אחר ~ 1 חריץ מקביל באורך מ"מ ב ~ 1 מ"מ מימין במרכז התחתון בצורה דומה.
4. חזור על שלב זה עבור כל הבארות של שני 24 גם צלחות. שני 24 גם הצלחות המשמשות תרבות צפיפות גבוהה מוכנות כעת לציפוי עם פולי- D- ליזין (ראה שלב 3.8 להלן).

3. הכנת Coverslips עבור תרבויות נוירון בצפיפות נמוכה

1. השתמש זכוכית עגולה בקוטר 12 מ"מ # 1.
2. מניחים 50 coverslips בתוך צלחת פטרי פלסטיק סטרילי בקוטר 100 מ"מ, לצלול coverslipsב 20 מ"ל פתרון אתנול 70%. מניחים צלחת פטרי זה על במה מסתובבת עם סיבוב במהירות בינונית (70 סל"ד) במשך שעה. הסר אתנול 70% ולאחר מכן להחליף עם קבוצה חדשה של אתנול 70%. סובב ולשטוף במשך שעה נוספת.
3. בטל פתרון ניקוי אתנול 70%. מוסיפים מים סטריליים (מסוננים דרך יחידת מסנן 0.2 מיקרומטר). שוטפים את coverslips בקפדנות על ידי החלפה של צלחת פטרי ביד. לשטוף שלוש פעמים, בכל פעם להחליף עם מים סטריליים טריים.
4. מניחים את צלחת פטרי עם coverslips בתוך ברדס תרבית תאים סטריליים עם זרימה למינרית. לשאוב את מי שטיפה דרך הקו הריק, ולהוסיף 10 מ"ל מים מסוננים סטרילית לטבול את coverslips. את coverslips צריך להיות סטרילי ועל פני השטח צריך להיות נקי מספיק לציפוי פולי- D- ליזין.
5. להרחיב שני 24 גם צלחות מ באריזות יחידות שלהם, ומניחים אותם בתוך הכובע.
6. הפעל את קו ואקום בשכונה. חבר קצה פיפטה 200 μl אל קו ואקום, ולהשתמש scisסור כדי לחתוך את הקצה כדי ליצור פתח גדול יותר.
7. השתמש פינצטה # 5 עדין טיפ להרים coverslips מצלחת פטרי, אחד בכל פעם, ולהשתמש בקו ואקום לייבש את coverslip לחלוטין. אז במקום coverslip אחד לתוך כל הבארות של צלחת 24 גם. 50 coverslips לנקות צריך להיות מספיק כדי למלא כל אחת הבארות של שני 24 גם צלחות.
8. לדלל את הפתרון המניות פולי- D- ליזין (1 מ"ג / מ"ל) לתוך הפתרון עובד (0.1 מ"ג / מ"ל) עם חיץ borate (pH 8.5). במשך ארבעת 24 גם צלחות (כולל שתי צלחות בצפיפות גבוהה עם תחתית חרוט), להכין 30 מ"ל של תמיסת העבודה הכולל.
9. הוספת 300 μl 0.1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון העבודה פולי- D- ליזין היטב כל עם coverslips זכוכית. ודא coverslips שקוע לחלוטין בתמיסה. אם לא, השתמש קצה פינצטה # 5 ללחוץ מטה coverslips נגד בתחתית הבאר, ולהשתמש קצה להנחות פתרון פולי- D- ליזין כדי לכסות את כל פני השטח של coverslips. ראייה לבדוק את כל coverslips לעשות suמחדש לא אוויר נלכד בין צלחת coverslips.
10. הוספת 300 μl 0.1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון העבודה פולי- D- ליזין היטב כל הצלחת תרבות צפיפות גבוהה עם תחתית חרוט. סבוב ביד כדי להפיץ את הפתרון כדי לכסות את כל תחתית הבאר.
11. להחזיר את כל ארבע צלחות עם D- ליזין פולי אל האינקובטור תרבות, דגירה O / N.

4. כביסה וצלחות אוויר קדם לתרבות

הערה: השלבים הבאים (4-9) מתבצעים ביום קציר רקמות.

1. לאחר דגירה / ציפוי של coverslips וצלחות 24 גם O / N, להביא את כל ארבע צלחות (שני עם coverslips התורם, שתי צלחות בצפיפות גבוהה acceptor עם תחתית פלסטיק חרוט) לתוך מכסה המנוע התרבות. שימוש בקו ואקום להסיר הפתרון פולי- D- ליזין.
2. מיד לאחר הסרת הפתרון פולי- D- ליזין, להוסיף ~ 1 מ"ל מים סטריליים היטב כל באמצעות פיפטה העברת פלסטיק. אחרי הכל הבארות מלאותעם מים, ולתת לעמוד במשך 10 דקות. סר מים על ידי ואקום, ואז להוסיף 300 μl לשטוף בינוני בכל טוב כדי לכסות את תחתית הבאר (עם או בלי זכוכית coverslips). אל תתנו פולי- D- ליזין ציפוי להתייבש.
3. להחזיר את כל ארבע הצלחות אל האינקובטור התא. הצלחות מוכנות לשימוש לאחר נוירונים בהיפוקמפוס התפזרו ערוכים.

5. הכנת בינוני תרבות שלמה, ואת טריפסין פתרון עבור עיכול אנזימטי

1. כן 60 מיליליטר בינוני תרבות שלמה על ידי ערבוב המרכיבים (ראה חומרים). השתמש מזרק 50 מ"ל מחובר עם מסנן מזרק גודל 0.2 מיקרומטר נקבוביות, לסנן המדיום תרבות שלמה לשתי צינורות חרוטי 50 מ"ל. כל שפופרת מכילה 30 מ"ל בינוני תרבות שלמה.
2. בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל נפרד, להוסיף ~ 30 מ"ל בינוני לשטוף (ראה חומרים) ולחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס. זה ישמש כדי לשטוף את הרקמה לאחר עיכול אנזימטי.
3. הכן את מדיום עיכול אנזים. ב -15 מ 'צינור חרוטי l, להוסיף 4.5 מ"ל בינוני לשטוף 0.5 מ"ל 2.5% פתרון טריפסין, ו -50 μl 100X DNase I.
4. מניח את מדיום תרבות השלם, בינוני Wash, אנזים בינוני עיכול באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.

6. הכנת כלי כירורגי

1. לעקר את כל הכלים כירורגית בתוך כיס עיקור: שני מספריים קטנים, זוג מלקחיים ושני פינצטה # 5.

הסרת 7. של מוח מן E16.5-E17.5 עכבר עוברים, ו Dissection של hippocampi

1. הכן שני 10 סנטימטרי פטרי מנות מלאות קר כקרח, תמיסת המלח המאוזנת של האנק סטרילית (HBSS).
2. להרדים את הסכר העכבר עם זריקה intraperitoneal של phenobarbital נתרן (100 מ"ג / ק"ג בנפח של ~ 0.5 מ"ל). לאחר ההזרקה, פעם הסכר מאבד בתגובה קמצוץ הבוהן, להקריב עם נקע בצוואר הרחם.
3. ריסוס באזור הבטן של הסכר עם אתנול 70%, ולעשות חתך ארוך 2 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן לחשוףהרחם.
4. הסר את העוברים ולמקם אותם בנפרד בצלחת פטרי בקוטר של 10 ס"מ עם חיץ HBSS לנתח קר.
5. החזק את העובר על ידי הצוואר באמצעות מלקחיים, ולהשתמש מספריים קטנים כדי להפוך את הזכות לחתוך הראשון קו האמצע מתחת לרמת המוח הקטנה וסעיף ברחבי רקמת המוח. אל לערוף את העובר.
   1. הכנס את הקצה בצד ימין של המספריים הקטנים מאזור הזנב כי הוא חתך פתוח, כל הדרך דרך החלק המקורי של המוח העוברי (לא קו אמצע צלב), ולעשות חתך בצד השמאל ברמה של בסיס גולגולת.
   2. הכנס את הקצה המספרי אגף השמאל שוב לעשות חתך בצד ימין. השאר פס צר של עצם גולגולת מלוטש רקמת עור בסוף המקורי, כך שהמוח כולו ניתן התהפך בצד חילוץ קל.
   3. השתמש בקצה מספרי כדי לגרוף את המוח העוברי לתוך תמיסת HBSS. בדוק את המוח תחת מיקרוסקופ לנתח. המוח צריך להיות שלם ללא חתך-o ברוטואזורי ff.
   4. חזור על שלבים אלה כדי לאסוף את כל המוחות העובר.
6. לאסוף את כל המוח שלם בצלחת פטרי חדשה המכילה 20 מ"ל חיץ HBSS קר. מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
7. הצג את המוח מצד הגחון. תוך כדי לחיצה על המוח עם מלקחיים בסוף הזנב, להכניס פינצטה # 5 חדה באלכסון לעשות חתך בין נקודת מקורי התיכון ובאזור הזנב-טמפורלית. חזור על פעולה זו עבור חצי הכדור השני. לאחר חיתוך, שתי ההמיספרות נפרדות עם ההיפוקמפוס שלם משאר רקמות גזע המוח.
   1. חזור על פעולה זו עבור כל אחד המוחות.
8. שחייה כולן ההמיספרות הגזורה, ולהסיר את קרומי המוח באמצעות שני זוגות של פינצטה 5 #.
9. זהה את ההיפוקמפוס בפיתוח כמבנה מעוקל כי הוא מקופל בתוך האונה הטמפורלית. החלף את שני זוגות פינצטה להפריד את ההיפוקמפוס מן הסמוך רקמות קליפת המוח. אסוף וברכה כל hippocamרקמת pi (ראה איור 1).

8. אנזימתי עיכול, פרד נוירונים בודדים

1. בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, להעביר את כל hippocampi גזור לתוך התמיסה עיכול אנזימטי המכיל בינוני 5 מ"ל לשטוף עם 0.25% טריפסין + 1X DNase אני צינור חרוטי 15 מ"ל.
2. מניחים את הצינור בתוך אמבט מים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות, עם היפוך עדין לסירוגין של הצינור פעם אחת בכל 5 דקות.
3. לאחר 25 דקות, להסיר בזהירות את פתרון האנזים בעזרת פיפטה פלסטיק כף יד על ידי שאיפה. הוסף בינוני לשטוף חם ל -10 מ"ל לשטוף בעדינות את הרקמה על ידי היפוך לאט הצינור 5 פעמים. הסר בינוני לשטוף, ולהוסיף 10 בינוני מ"ל לשטוף שוב לשטוף נוספים.
4. הסר בינוני לשטוף, ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום חם לשטוף טרי שוב. לנער את הצינור ביד בקפדנות במשך 15 פעמים כדי לסלק את הנוירונים מתעכל מן הרקמה. המדיום צריך להיות עכור כאשר התאיםמחדש מופרדים מן הרקמה לתוך המדיום לשטוף. אסוף את ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מ"ל חדש תוך השארת הרקמה הנותרת בצינור.
5. להוסיף עוד 2 בינוני מ"ל Wash לרקמה, בעדינות להפריד את הרקמה הנותרת ידי triturating באמצעות פיפטה פלסטיק עבור ~ 15 פעמים. בואו לשבת במשך 5 דקות. פינת ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש שמכיל שנאספו'לזעזע פעמי של התאים.
6. לספור את הצפיפות של נוירונים עם hemocytometer. בדרך כלל, 3,000-5,000 תאים לכל microliter ניתן להשיג תלוי את מספר העוברים הגזורים. מספר ממוצע של 2.5 x 10 ⁷ נוירונים נאמד אם בהנחת שש עוברים הם גזורים.
7. חשב את נפח הדרושים של ההשעיה תא זה להניב צפיפות מ"ל 250,000 נוירונים / כאשר מתווסף בינוני תרבות 30 מ"ל השלם. להוסיף נפח זה אחד משני צינורות חרוטי המכיל 30 מ"ל בינוני תרבות שלמה להניב המדיום ציפוי נוירון צפיפות גבוהה.
<li> העברת 1.2 מ"ל של תמיסת נוירון צפיפות גבוהה זה 30 מ"ל אחר בינוני תרבות שלמה להניב ריכוז של נוירונים ~ 10,000 / מ"ל. השתמש דילול זה לזרוע את coverslips בצפיפות נמוכה.

ציפוי 9. של נוירונים ארוך טווח משותף תרבות

1. תביא את שני 24 גם צלחות עם תחתית חרוטה עבור נוירונים בצפיפות גבוהים לתוך מכסה מנוע תרבית תאים. סור 300 מדיום תנאי μl ידי ואקום. פלייט השעיות תא צפיפות 0.6 מ"ל גבוה ב 250,000 נוירונים / מ"ל.
2. תביא את הצלחות שני 24 גם אחרות עם coverslips לתוך מכסה מנוע התרבות, ולהסיר 300 מדיום תנאי μl ידי ואקום. פלייט 0.6 מ"ל השעיות תא בצפיפות נמוכה ב 10,000 נוירונים / מ"ל ​​על coverslips בתוך שני 24 גם צלחות.
3. להחזיר את כל 24 גם ארבע הצלחות אל האינקובטור. בואו לשבת במשך שעה 2.
4. תהפוך את coverslips בצפיפות הנמוך עם הדבקות נוירונים לתרבות בצפיפות הגבוהה. ודא הנוירונים זה מול זה (כלומר, nOT מופרד coverslip הזכוכית). ואז להחזיר את שתי צלחות עם שיתוף התרבות אל האינקובטור.

עמית תרבות 10. Sustaining

1. Feed שיתוף תרבויות על ידי הוספת 300 μl בינוני Feed טרי (ראה חומרים) ביום במבחנה (DIV) 5. אין צורך להסיר 50% של מדיום תרבות שלם המקורי, כפי שדווח על ידי מחקרים רבים אחרים. מדיום ההאכלה גם מכיל 15 מיקרומטר arabinoside ציטוזין (Ara-C, להניב לריכוז סופי של 5 מיקרומטר) כדי לצמצם את הסיכוי של זיהום גליה ושגשוגם.
2. בעקבות האכלה ראשונית זו, להוסיף 300 μl בינוני Feed טרי ללא ערה-C לבאר כל שבוע. האם התרבות להישמר במשך יותר מחודשת, להחליף מחצית הבינונית עם מדיום Feed טרי מדי שבוע מעבר לנקודת פעם אחת בחודש (עם חצי החלפת הבינוני הראשונה DIV33). מורפולוגית, הוא צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה נראות בריאות עד שלושה חודשים (הזמן הארוך ביותר שנצפה על ידי experimenters).

איור 11. של Transfection Neuron צפיפות ניסיוני מניפולציה-נמוך

הערה: כאשר transfection בנוירונים בצפיפות הנמוכים הוא רצוי, פרוטוקול סידן פוספט פשוט יכול להיות מאומץ. מצאנו כי תרבויות בצפיפות נמוכה יש יעילות transfection טוב יותר עם פרוטוקול סידן פוספט לפני DIV12, אבל הם יכולים להיות transfected עם יעילות נמוכה בהרבה בבית DIV21 ומעלה, במהלכן הקוצים הדנדריטים הם בולטים. היתכנותו של transfection של הנוירון בצפיפות הנמוך התרבותי מודגמת על ידי transfecting נוירונים עם פלסמיד pEGFP-C3 (ראה להלן).

1. בשעת DIV21, להסיר 600 μl מותנה בינוני מכל טוב של שיתוף התרבות, ולהעביר אותו לצלחת 24 באר חדשה. לאחר מכן להוסיף 600 μl בינוני Feed הטרי אל התרבות המשותפת להביא אותו בחזרה לנפח המקורי.
   1. מעבירים את coverslips לתוך צלחת 24 באר חדשה עם 600 μl מותנה בינוני. ודאנוירונים בצפיפות נמוכה כלפי מעלה. מניח את צלחות צפיפות הגבוהות הצלחות החדשות עם coverslips בחזרה בחממה.
2. הכן שני צינורות 1.5 מ"ל סטרילי. בשנת צינור אחד, להוסיף 600 μl 2X HEPES שנאגרו מלוחים פתרון (HBS). חשב את נפח של 12 מיקרוגרם pEGFP-C3 DNA מבוסס על ריכוז פלסמיד. בצינור האחר, להוסיף 74 ₂ μl CaCl (2 מניות M) ואת נפח המים לאחר הוספת פלסמיד יגרום 600 μl. מערבבים היטב על ידי pipetting ולאחר מכן להוסיף פלסמיד דנ"א. לאט ומערבבים היטב. תן שני הצינורות לשבת במשך 5 דקות ב RT.
3. בעוד אחיזת ידיים הצינור 2X HBS ובמתינות להסעיר את פתרון מיקסר, להוסיף את כל 600 μl הירידה פתרון ה- DNA-CaCl ₂ אחר טיפה אל הצינור 600 μl 2X בהרוורד. זה קריטי, כי המשקע שנוצר הוא בצורת גרגירים 'חול דק'. ערבוב חזק מדי ומהר מדי אינה רצויה, שכן לא תהיה יותר סביר לייצר "משקעים flake' דמוי שלג גדול, whicיש h דראמטי יעיל transfection נמוך מבוסס על התצפיות שלנו.
4. בואו המשקע ממשיכים להיווצר בחושך ב RT במשך 30 דקות.
5. הוספת 100 μl המשקע היטב כל המכיל נוירון בצפיפות נמוכה על coverslips, טיפה אחר טיפה ובאופן שווה. מחזירים את הצלחת באינקובטור, דגירה במשך שעה 2. בהנחה שרוב CaCl ₂ הוא בצורה חופשית, זו התוצאה ריכוז של ~ 17.6 מ"מ Ca ^{2 +,} אשר עלולים להיות רעילים לנוירונים הבאים דגירה ממושכת.
6. להכין צינור חרוטי 50 מ"ל עם ~ 50 בינוני מ"ל Wash, לחמם אותו על 37 מעלות צלזיוס.
7. בסוף 2 שעות, להביא את נוירון בצפיפות נמוכה עם פוספט DNA סידן שוקע מכסה המנוע. תרימי כל coverslip הפרט עם פינצטה # 5 חד, ולטבול אותו שלוש פעמים המדיום 50 מ"ל לשטוף לשטוף אותו בקצרה. ואז להחזירו הנוירונים בצפיפות הגבוהים בצלחות שיתוף התרבות המקוריות, עם נוירונים בצפיפות נמוכים פונים כלפי מטה.
8. המשך התרבות עדהנוירונים התרבות בצפיפות הנמוכים על coverslips נקצרים ללימודים.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר צפיפות נמוכה במיוחד מוצלחת, לתרבות לטווח הארוכה של נוירונים glutamatergic הטהורים ללא הצורך של תאי גליה משמשים שכבת מזין. הפרוטוקול שרטט באיור 1, הכוללת הכנה של צפיפות גבוהה (על פולי- D- ליזין מצופה 24 בארות) ונוירונים בצפיפות נמוכה (על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין) בנפרד, ואת שיתוף התרבות שלאחר מכן שיכולה להישמר עד שלושה חודשים.

דמויות 2 א ו -2 הם איורים של צפיפות גבוהה נוירונים נמוך צפיפות בבית 5 ימים לאחר ציפוי. תרבות צפיפות נמוכה היא כ -30 לקפל פחות בצפיפות. נוירונים שניהם עוברים שלבי התפתחות טיפוסיים כפי שתואר על ידי Kaech ובנקאי (2006). באותו היום 14, הוא צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה להראות מבנים הדנדריטים משוכללים, כפי שעולים תמונות DIC (2C הדמוי,D, לב הוא הלוחות הם מאותו השדה עם מטוסי מוקד שונים, כפי שמוצגים על ידי המיקום של לחרוט). כאשר הנוירונים האלה מגואלות נוגדנים MAP2 לחשוף את דנדריטים, לא נמצא הבדל משמעותי במספר של דנדריטים (t 13 = 1.27, p> 0.05; נמדד לפי מספר טיפ הדנדריטים) ואורך הדנדריטים הכולל (t 16 = 1.41, p> 0.05 לכל נוירון) בין צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה נמצאים (איור 2E, F).

תיוג Immunocytochemistry משמש כדי לחשוף סינפסות glutamatergic פונקציונלית. אנו משתמשים צביעה כפולה לתייג למקטע הקולטן NMDA NR1 ואת למקטע קולטן AMPA GluR1 (איור 3 א), וסינפסות תפקודית (puncta-מקומי שיתוף בצהוב) ניתן לזהות בקלות לכמת באמצעות ImageJ. נוירונים בצפיפות נמוכה גם מסומנים עם נוגדנים נגד MAP2 סמן חלבון הדנדריטים,בשילוב עם p-טאו סמן חלבון אקסונלית. תיוג פעמים זה מאפשר הבחנה ברורה של דנדריטים אקסונים (איור 3 ב). תרבויות צפיפות נמוכה יכולה גם להיות transfected בהצלחה עם פלסמידים DNA בשיטות סידן פוספט, אם כי קצב transfection הוא בדרך כלל נמוך מאוד בשלבים מאוחרים יותר (<0.2 נוירונים% כאשר transfected ב DIV21). איור 3 ג ממחיש כי transfection EGFP יכול לחשוף מורפולוגיה העצבית, ו לדקלם מבני עמוד שדרה הדנדריטים בסדר גלויים. לבסוף, כמו הוכחה של קונספט, נוירונים צפיפות נמוכה במיוחד ניתן לגדל בתנאים המקדמים autapse היווצרות (איור 3D). נוירונים autaptic צפיפות נמוכה במיוחד אלה גדל על 'מיקרו-איי' מצופה פולי- D- ליזין יכול להיגרם נוירון מזין צפיפות גבוהה מעבר 2 חודשים עם פרוטוקול שיתוף תרבות זו.

<E16.5-E17.5 strong> באיור 1. איור סכמטי של צפיפות גבוהה פרוטוקול שיתוף התרבות בצפיפות נמוכה. (א) העכבר המוח העובריים נאספים, hippocampi הם גזור החוצה מתעכל עם טריפסין. (ב) מתעכל hippocampi נשטפים, מתחלק נוירונים בודדים, מצופה בצפיפות גבוהה (250,000 תאים / מ"ל) ב -24 צלחות היטב; בינתיים, בצפיפות נמוכה (10,000 תאים / מיליליטר) נוירונים הם מצופים על coverslips. הבארות לתרבות בצפיפות גבוהה חקוקות עם מחט מזרק 18 G לספק תמיכה גבוהה עבור coverslips. (ג) איור של שיתוף התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. שניהם צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה יש שיתוף פיתוח מורפולוגיים mparable ב שיתוף תרבות. (A, B) Photomicrographs מראה צפיפות ציפוי של שני צפיפות גבוהה שכבה בצפיפות נמוכה. (C, D) תמונות DIC מראה צמיחה neurite נרחב בשני גבוהה (C) בצפיפות נמוכה (D) נוירונים. הנוירונים בצפיפות נמוכה על coverslip נחים ממש מעל נוירונים בצפיפות גבוהה. שים לב למיקום של תמיכת פלסטיק הגבוהה. (E) תיוג Immunocytochemistry של MAP2 חלבון הדנדריטים. (F) כימות (ממוצע ± SEM) של אורך הדנדריטים הכולל ומספר קצה הדנדריטים לכל נוירון. לא נמצא הבדל משמעותי (NS) נתפס בין צפיפות גבוהות נוירונים בצפיפות נמוכה גדלו שיתוף תרבות. סרגל קנה מידה (ב ', ד'), 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

FO: keep-together.within-page = "1">
איור 3. מניפולציות ניסוייות של נוירונים בצפיפות נמוכים גדלו שיתוף תרבות. (א) תיוג Immunocytochemistry בתרבות בצפיפות נמוכה מאפשר זיהוי של סינפסה פונקציונלי מוגדר על ידי שיתוף תיוג של GluR1 (ירוק) NR1 (אדום). (ב) Co-תיוג של (מג'נטה) MAP2 חלבון הדנדריטים העצבי וחלבון אקסונלית p-טאו (ירוק). (C) תא עצב בהיפוקמפוס בצפיפות נמוכה טרנספקציה עם פלסמיד pEGFP-C3, מראה הקוצים הדנדריטים פזרני. (ד) תא עצב צפיפות נמוכה מוכן על פולי- D- ליזין '-האי מיקרו', גדל על גבי נוירונים בצפיפות גבוהה. אלקטרודה תיקון הקלטה ממלאת הנוירון עם hydrazide Alexa-555 כדי לחשוף את המורפולוגיה של הנוירון. סרגל קנה מידה של מחלת אלצהיימר, 20 מיקרומטר.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.