מאמר שיטה

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח Xenopus כליה

DOI:

10.3791/53799

⸱

3 במאי 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במפות גורל ועוקבי שושלת כדי למקד זריקות לבלסטומרים בודדים המולידים כליה של עוברי Xenopus laevis.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכליה העוברית של Xenopus laevis (צפרדע), את כִּליַת רֵאשִׁית, מורכב נפרון יחיד, והוא יכול לשמש כמודל למחלת כליות. עוברי Xenopus הם גדולים, לפתח חיצונית, ניתן להשפיע בקלות על ידי microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, מפות גורל הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם. microinjection ממוקד לתוך blastomere הפרט כי בסופו של דבר יהיה להצמיח איבר או רקמה של עניין ניתן להשתמש כדי overexpress או להפיל ביטוי גנים באופן סלקטיבי בתוך האזור המוגבל הזאת, הפחתת השפעות משניות בשאר העובר המתפתח. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנצל מפות גורל Xenopus הוקמה כדי למקד את הכליה Xenopus פיתוח (להלן כִּליַת רֵאשִׁית), באמצעות microinjection לתוך blastomere ספציפיים של עוברים תאים 8 4 ו. הזרקה של קליעי נותבים שושלת מאפשרת אימות של המיקוד הספציפי של הזריקה.לאחר עוברים פתחו לשלב 38 - 40, כל הר immunostaining משמש כדי לחזות התפתחות pronephric, והתרומה ידי תאים ממוקדים אל כִּליַת רֵאשִׁית ניתן להעריך. באותה טכניקה ניתן להתאים למקד סוגי רקמות אחרות בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכליה העוברית Xenopus, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל טוב ללימוד פיתוח כליות ומחלות. עובר לפתח חיצוני, הם גדולים, יכולים להיות מיוצרים בכמויות גדולות, והם מניפולציות בקלות באמצעות microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, הגנים לפיקוח על בניית כליות אצל יונקים ודו-חיים הם משומר. כליות יונקות להתקדם דרך שלושה שלבים: כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה, ו metanephros 1, בעוד דו חיים עובריים כִּליַת רֵאשִׁית ודו-חי בוגרים יש metanephros. יחידת הסינון הבסיסית של צורות כליות אלה היא נפרון, ושניהם יונקים ודו-חיים דורשים את אותה מפלי איתות ואירועים אינדוקטיביים לעבור nephrogenesis 2, 3. כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus מכילה נפרון בודד מורכב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules, וכן glomus (מקביל ל glomerulus היונק) 1, 4-6 (איור 1 ). הווה נפרון הבודד, הגדול Xenopus כִּליַת רֵאשִׁית הופך אותו מתאים כמודל פשוט לחקר הגנים המעורבים בתהליכי פיתוח כליות ומחלות.

מפות גורל התא הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם, והם זמינים באופן חופשי באינטרנט ב Xenbase 7-11. כאן אנו מתארים טכניקה microinjection של קליעים נותבים השושלת למקד את כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus פיתוח, אם כי באותה טכניקה ניתן להתאים למקד ברקמות אחרות כגון הלב או העיניים. קליעים נותבים השושלת הם תוויות (כולל צבעים חיוניים, dextrans שכותרתו fluorescently, אנזימים לגילוי histochemically, ו mRNA קידוד חלבוני ניאון) כי ניתן להזריק לתוך blastomere מוקדם, המאפשר הדמיה של הצאצאים של התא במהלך ההתפתחות. פרוטוקול זה מנצל mRNA MEM-RFP, קרום קידוד ממוקד חלבון פלואורסצנטי אדום 12, כמו נותב השושלת. טק microinjection הממוקדniques עבור בלסטומרים בודדים עוברים 4 ו 8 תאים המתואר כאן יכול להיות מנוצל להזרקה עם morpholinos להפיל ביטוי גנים, או עם RNA אקסוגני overexpress הגן של עניין. באמצעות הזרקה לתוך blastomere הגחון, הצמחי, בעיקר כִּליַת רֵאשִׁית של העובר תהיה ממוקדת, עוזבת את כִּליַת רֵאשִׁית הנגדית כביקורת התפתחותית. שיתוף ההזרקה נותב מוודאת כי blastomere הנכון הוזרק, ומופעים אשר רקמות בעובר נבעו blastomere המוזרק, אימות מיקוד של כִּליַת רֵאשִׁית. Immunostaining של כִּליַת רֵאשִׁית מאפשר הדמיה של מידת הצלחה של tubules pronephric היה ממוקד. תופעות התבטאות יתר ו מציאה אז יכול להיות הבקיע נגד הצד הנגדי של העובר, אשר משמש כביקורת התפתחותי, והוא יכול לשמש כדי לחשב את מדד pronephric 13. הזמינות של מפות גורל התא מאפשרת טכניקת microinjection ממוקדת זה כדי לשמש יעד רקמות othאה מאשר כִּליַת רֵאשִׁית, ואת שיתוף ההזרקה נותב ניאון מאפשר microinjection המתמקדת בכל רקמות להיות מאומתת לפני הניתוח.

במהלך microinjection העובר, טמפרטורה התפתחותי צריכה להיות מוסדרת בחוזקה, בהתחשב בכך את קצב התפתחות Xenopus תלוי מאוד עליו 14. עובר צריך להיות מודגרות בטמפרטורות קרירות (14 - 16 מעלות צלזיוס) במשך 4 ו זריקות 8 תאים כי זמן הפיתוח הוא האטה. בגיל 22 ° C, זמן הפיתוח מ -1 הבמה (תא 1) לביים 3 (4 תאים) הוא כ 2 שעות, תוך 16 ° C זמן הפיתוח לשלב 3 הוא כ 4 שעות. זה לוקח בערך 15 דקות לסיום מעובר 4 תאים לעובר 8 תאים (שלב 4) על 22 מעלות צלזיוס, אבל לוקח בערך 30 דקות על 16 מעלות צלזיוס. באופן דומה, על 22 מעלות צלזיוס, זה לוקח רק 30 דקות עבור עובר 8 תאים כדי להתקדם עובר 16 תאים (שלב 5). הפעם הוא עלה ל 45 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. הrefore, כדאי להאט את קצב הפיתוח של עוברים כדי לאפשר מספיק זמן עבור זריקות בשלב 8 תאים לפני העוברים להתקדם לשלב 16 תאים. בנוסף, בטמפרטורות צמיחה יכולות להיות מווסתות כדי להאיץ או להאט התפתחות עוברית עד הכליות פתחו באופן מלא.

האפידרמיס של עובר ראשן שלבית Xenopus הוא יחסית שקוף, המאפשר הדמיה קלה של כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח בלי דיסקציה או סליקה של הרקמה 15. בשל השקיפות היחסית של עוברי Xenopus, הדמיה תא חי הוא גם אפשרי 16,17. כל הר immunostaining לדמיין את כִּליַת רֵאשִׁית אפשרי עם נוגדנים נקבע כי התווית הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי ו tubules חיבור של שלב 38 - 40 עוברים המאפשרים הערכת התפתחות pronephric ממוקד לאחר מניפולציה של ביטוי גנים העוברים Xenopus 18-20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הבא אושר על ידי האוניברסיטה למדעי בריאות מרכז טקסס המרכז של יוסטון ועדת צער בעלי חיים לרפואה בחיות מעבדה, אשר ממשמשת לטיפול המוסדי ועדת שימוש (# פרוטוקול: HSC-AWC-13-135).

זיהוי 1. בחירה של בלסטומרים עבור זריקות כליות במיקוד

  1. לפני יצירה עוברת, השתמש הטבלה הרגילה של Xenopus פיתוח 21 כדי להבין את הכיוון של חלוקות התא מוקדם בעובר. לחלופין, דיאגרמות גישה של השלבים ההתפתחותיים המוקדמים של Xenopus על Xenbase 11.
  2. גש מפות גורל תא Xenopus האינטראקטיביות על Xenbase 11 כדי לבחור את blastomere יהיה ממוקד עבור microinjection.
  3. שימו לב כי העובר תא בודד יש מוט החיה פיגמנט כהה וקוטב צמחי, שהוא לבן yolky. שימו לב קרום מגן, המכונה e vitellinenvelope, מכסה את העובר.
  4. שים לב כי המחשוף הראשון מתרחש בדרך כלל בין הצדדים על ימין ועל שמאל של העובר. תאים אלה לתרום באופן שווה שושלת pronephric.
  5. ראוי לציין, כי המחשוף השני מחלק את הגב ואת החצאים גחון של העובר, מה שמוביל העובר 4 תאים. התאים מגבים הם קטנים ויש להם פחות פיגמנט מאשר תאי הגחון (איור 2 א ו איור 3 א).
    1. זהה את בלסטומרים הגחון (V; התאים גדול, כהה) בצדדים שמאל וימין, אשר תורמים יותר לכליה פיתוח מאשר הגבי (D; קטן, תאים אור) בלסטומרים (איור 2 א).
    2. אם הזרקת לעובר 4 תאים, להזריק את blastomere הגחון השמאלי כדי למקד את הכליה שמאלה (איור 3 א וסעיף 3).
  6. המחשוף השלישי חוצה את הצדדים בעלי חיים צמחיים, וכתוצאה מכך עוברת שמונה תאים. בשלב זה, ישנם ארבעה בלסטומרים חיה [שמאלה וימינה גחון(V1) ו הגבי (D1)] וארבעה בלסטומרים צמחיים [שמאל וימין גחון (V2) ו הגבי (D2)] (האיור 2B ו איור 3B).
    1. אתר את בלסטומרים הגחון, צמחיים (V2). בלסטומרים אלה תורמים יותר לכליה לפתח כל תאים אחרים בשלב זה (התרשים 2B). כדי למקד את הכליה השמאלית של עובר 8 תאים, להזריק לתוך blastomere V2 שמאלה (איור 3 ב וסעיף 3).
  7. שים לב כי השסעים הרביעיים וחמישיים החוצים את בלסטומרים בעלי החיים צמחי. שני צאצאים נוצרים מכל blastomere, וכתוצאה מכך העובר 16 תאים. התאים קרויים קודם שלהם. לדוגמה, blastomere V2 משלב 8 תאים מוליד V2.1 והצאצאים V2.2 בשלב 16 תאים (איור 2 ג). תא V2.2 בשלב 16 התאים מספק את רוב תאי תורם הכליה המתפתחת.
  8. הערת הניגודים שישית ושביעיים לגרום אמברי 32 תאיםo. שוב, שני צאצאים נוצרים מכל blastomere, אשר נקראים הבאים קודם שלהם. לדוגמה, blastomere V2.2 משלב 16 תאים מוליד V2.2.1 ו V2.2.2 בשלב 32 תאים. קיימת מערכת שמות חלופית בשלב 32-התא שבו תאים מזוהים בארבע שורות A, B, C, ו- D (בבעלים צמחי), ואת בארבעה טורים כמו 1, 2, 3, ו -4 ( מן הגב אל גחון). לפיכך, blastomere V2.2.2, אשר תורמת את המירב על כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח, נקרא C3 תחת מערכת שמות חלופה זו (איור 2 ד).

2. הכנה עוברת

  1. הכן 50 מ"ל של תמיסת Dejelly (2% ציסטאין, NaOH ל- pH 8.0).
  2. לבודד שני האשכים של צפרדע זכר יחידה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 14. מניחים את האשכים בצלחת פטרי 60 מ"מ מלא 10 מ"ל פתרון האשכים אחסון (אצבעות שונה של 1x מארק [MMR; 0.1 M NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ2 CaCl, 5 מ"מ HEPES pH 8, 0.1 mM EDTA] 12, 1% אלבומין בסרום שור, 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin). אחסן את האשכים ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: אשכים יכולים להיות מאוחסנים במשך כ 7 - 10 ימים על 4 מעלות צלזיוס, אך יעילות הפריה תקטנה ככל האשכים שאוחסנו.
  3. סוחטים צפרדע נקבה להשיג ביצים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 14. אסוף את הביצים בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. יוצקים את המים העודפים.
  4. חותכים ¼ של אשך בזמן שהוא נמצא האשכים פתרון אחסון באמצעות מלקחיים סכין גילוח. מעביר את פיסת האשך בצלחת פטרי המכילה ביצים. התאם את הגודל של חלק testis בשימוש לחשבון בהתאם לגודל של האשכים, כמה זמן לאשכים אוחסנו, וכמה ביצים יש מופרה. באופן כללי להשתמש ¼ 1/3 של testis גזור טרי לדשן מצמד אחד ביצים.
  5. חותכים את החלק testis לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים סכין גילוח. להוסיף MMR 0.3x מספיק+ 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin כדי בצלחת פטרי כדי לכסות את הביצים. מערבולת MMR בצלחת לערבב.
  6. יש להמתין כ 30 דקות להפריה להתקיים בטמפרטורת החדר. ראוי לציין, כי בחצי הכדור החי (בצד פיגמנט של העובר) מיישבים על גבי העובר על הפריה יעילה. לאחר מכן, הוציאו את MMR מצלחת פטרי בעזרת פיפטה ההעברה. הוסף מספיק פתרון Dejelly כדי בצלחת כדי לכסות את העוברים.
  7. במהלך הדקות הקרובות, בעדינות מערבולת הצלחת לסירוגין. טלטול נמרץ של המנה בשלב זה עלול לגרום למומים ציר.   מעייל הג'לי על העוברי יתמוסס, ואת העוברי יהיה להתאסף במרכז הצלחת במהלך מתערבל. לאחר העוברים עוקבים בדאגה נוגעים זה בזה במרכז של המנה, להסיר את פתרון Dejelly עם טפטפת העברה. אל תשאירו עוברי פתרון Dejelly למשך זמן ארוך יותר מ -5 דקות, או העוברים עלולים להינזק.
  8. לשטוף את העוברים dejellied 3 - 5 פעמים ב 0.3xMMR + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin ידי שפיכת או pipetting בזהירות את MMR ומילוי את המנה עם חדש MMR. אל תסיר את כל MMR מצלחת, או עוברים עלולים להינזק.
  9. הסר את כל ביצים מופרות או פיסות אשך מצלחת פטרי בעזרת פיפטה העברה.
  10. דגירה עוברת בין C 14 ו -22 מעלות.
    הערה: עוברים גדל בטמפרטורות נמוכות לפתח לאט יותר עוברים גדל בטמפרטורות גבוהות. עיתוי שלבי ההתפתחות ניתן למצוא באתר Xenbase 22.
    1. לחלל את התפתחותם, חצי מקומה של העוברים מן הפריה אחת בצלחת פטרי שומרים על 14 מעלות צלזיוס, ואת החצי השני של העוברים בצלחת פטרי שומר על 18 מעלות צלזיוס. זה מאפשר לשני סטים של זריקות לתוך 4 תאים או 8 תאים העוברים מן הפריה אחת.

3. הכנת פתרונות הזרקת Microinjection של עוברים

  1. הכן את פתרון ההזרקה המכיל 0.01ng / NL קרום הנכנס חלבון פלואורסצנטי אדום (MEM-RFP) mRNA 9 בעוד העוברים מתפתחים לשלב 4 תאים או 8 תאים. אחסן את הפתרון הזרקת על הקרח עד מוכנים להזריק.
  2. טען "צינור נימי זכוכית החלפה לתוך חולץ מחט, כאשר החלק העליון של צינור ההחלפה מיושר עם החלק העליון של המקרה מחולץ מחט. הגדר את הערך # 2 חום ל -800, ואת תמורת המשיכה 650. לחץ על" 7 למשוך "על מנת למשוך את המחט. זו תיצור 2 מחטים מתוך 7 יחיד" שפופרת זכוכית נימים.
  3. לקטום את קצה מחט משך עם זוג מלקחיים דומון.
    הערה: לאחר משיכת המחט, קצה אטום עצומות וצריך לחתוך פתוח. קרוב יותר חוד המחט שזה הוא חתך, קטן יותר, בקוטר קצה המחט יהיה. למרות הקוטר של הקצה לא ישפיע על עוצמת הזריקה עם מערכת microinjection משמשת כאן, טיפ עם קוטר גדול יותר יש יותר סיכוי לפגוע בעובר.
  4. להחליק את מ 'קולט icropipette על חלקו האחורי של המחט. לאחר מכן, להחליק את O-Ring חור גדול על גבו של המחט מאחורי קולט.
  5. מלא את המחט עם שמן מינרלים באמצעות מחט מד 27 מזרק, נזהר שלא לקבל בועות אוויר בתוך המחט.
  6. להחליק את המחט על הבוכנה של microinjector, ישיבת המחט לתוך החור הגדול של spacer הפלסטיק הלבן מותקן על הבוכנה. הבוכנה צריכה להיות O-Ring קטן קרובה לגוף של microinjector, ואחריו spacer הלבן, O-Ring הבור הגדול, קולט. Secure את המחט על ידי הידוק הקולט. משוך בעדינות על המחט לוודא כי הוא מאובטח כראוי.
  7. לחץ לחיצה ממושכת על כפתור "ריק" על תיבת הבקרה microinjector עד ישנם שני צפצופים.
  8. פיפטה 3 μl של פתרון הזרקה גבי פיסת Parafilm. הכנס את קצה המחט לתוך החרוז של פתרון הזרקה על Parafilm. לחץ לחיצה ממושכת על "למלא" כפתור על microiתיבת בקרת njector לצייר פתרון הזריקה לתוך המחט.
  9. למלא צלחת פטרי 60 מ"מ מצופה 500 מיקרון פוליאסטר רשת עם 5% Ficoll ב MMR 0.3x + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. בזהירות פיפטה 20 - 30 4 תאים או 8 תאים העוברים לתוך הצלחת.
  10. באמצעות לולאת שיער 14, לתפעל את העוברים כך blastomere להיות מוזרק מתמודד עם המחט. כדי למקד את הכליה עזבה, בשורה עוברת כך בלסטומרים הגחון השמאליים של עובר 4 תאים או בלסטומרים V2 שנשארו עובר 8 תאים להתמודד עם המחט.
  11. להזריק 10 nl של פתרון הזרקה לתוך blastomere נבחרים כל העובר בצלחת.
    הערה: הרשת בתחתית צלחת פטרי מייצבת את העוברים ומונעת מהם מתגלגלים, ומאפשר להם להיות מוזרק ללא שימוש בלולאת שיער לייצוב.
  12. העברת מוזרק עוברים לתוך הבארות של צלחת תרבות מולאו עם 5% Ficoll ב MMR 0.3x + 30 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. דגירה העוברת המוזרקs ב 16 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר בלסטומרים מוזרקים לרפא.
  13. מעבירים את העוברים נרפא לתוך בארות צלחת תרבות חדשה מולאו עם gentamycin 0.3x MMR + 30 מ"ג / מ"ל ​​על ידי שלב 9 (לפני gastrulation).
  14. דגירה עוברת בגיל 14 - C ° 22 עד העוברים מגיעים לשלב 38 - 40 21.

קיבוע 4. Immunostaining של עוברים

  1. הכן 50 מ"ל של מגבים / EGTA / סולפט מגנזיום / מאגר פורמלדהיד [MEMFA: 100 מ"מ מגבים (pH 7.4), 2 מ"מ EGTA, 1 מ"מ MgSO 4, 3.7% (v / v) פורמלדהיד].
  2. בעזרת פיפטה העברה, לשים 10 - 20 בשלב 38 - 40 העוברים בתוך בקבוקון זכוכית. הוסף 10 μl 5% benzocaine באתנול 100% כדי בקבוקון הבקבוקון להפוך לערבב. חכה 10 דקות כדי להרדים את העוברים.
  3. הסר את MMR מבקבוקון באמצעות פיפטה מזכוכית. אם עיבוד בקבוקונים מרובות בעת ובעונה אחת, צלוחיות ניתן זקוף בצלחת תרבית תאים 24 גם.
  4. עם מקטרת זכוכיתטטי, למלא את הבקבוקון עם MEMFA. מניחים את הצנצנת על פלטפורמת נדנדה תלת ממדי עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את MEMFA מבקבוקון באמצעות פיפטה מזכוכית. מלאו את הבקבוקון עם 100% מתנול. מניחים את הצנצנת על פלטפורמת נדנדה תלת ממדי עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת, ולאחסן את העוברים לילה מתנול 100% ב -20 ° C.
  6. הכן 1x בופר פוספט-שור סרום אלבומין-טריטון (PBT): PBS 1x, 2 מ"ג / חלבון בסרום שור מ"ל, 0.1% Triton X-100.
  7. הכן את הפתרון נוגדן ראשוני: 1x PBT עם 10% נסיוב עז עם דילול 1: 5 של חד שבטיים העכבר 4A6 נוגדן (לתייג את הקרומים של tubules ביניים, דיסטלי וחיבור 20), 01:30 דילול של נוגדן חד שבטי העכבר 3G8 (כדי לומן תווית של tubules הפרוקסימלי 20), ו דילול 1: 250 של נוגדן RFP ארנב polyclonal (לתייג נותב MEM-RFP). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. הכן את secondaפתרון נוגדנים ר"י: 1x PBT עם 10% נסיוב עז, 1: 500 Alexa 488 עז אנטי עכבר IgG (ריכוז המניות 2 מ"ג / מ"ל; לתווית 4A6 ו 3G8), ו -1: 500 Alexa 555 עיזים IgG נגד ארנב (מלאי ריכוז 2 מ"ג / מ"ל; לתייג נותב MEM-RFP). חנות ב 4 ° C, כיסוי הצינור בנייר כדי להגן מפני אור.
  9. לחלופין, לאסוף את נוגדנים ראשוניים ומשניים לאחר צביעה, ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר בניסויים עתידיים. אם הנוגדן הוא להינצל לשימוש חוזר, להוסיף אזיד הנתרן 0.01%.
  10. Immunostain את העוברים באמצעות פרוטוקולים הוקמו 18.

ויזואליזציה 5. עוברים והניתוח של רקמות Pronephric ממוקדות

  1. מסך את העוברים immunostained לאמת כי blastomere הנכון הוזרק על ידי הצגת הקרינה של נותב תחת סטראו פלורסנט ב 1X (כדי להציג העובר כולו) 5X (כדי להציג כליות) הגדלה. עובר מקום בצלחת זכוכית רב גם עם אנחנוLLS מלא 1x PBT בעזרת פיפטה העברת עם קצה לחתוך. לתפעל את העוברים עם לולאת שיער. השתמש רק עוברים אשר יש בהווה נותב מוזרק שיתוף ב כִּליַת רֵאשִׁית בצד השמאלי של העובר (איור 3 ג, ו 'ו איור 4C, F) עבור ביטוי יתר גנים או ניתוח מציאה.
  2. לחלופין, לנקות את העוברים נקה של מאריי (2 חלקים בנזיל בנזואט: 1 חלק בנזיל אלכוהול) על ידי הצבת את העוברים בתוך צנצנת זכוכית וממלאים את הבקבוקון עם נקה של מאריי. דמיינו את העוברים באמצעות צלחת גם זכוכית.
    הערה: נקה של מאריי הוא ממיס אורגני, וצריך לטפל בהם בזהירות. יש להשתמש בכפפות, ורק להשתמש צלוחיות זכוכית ו טפטפות עם נקה של מאריי.
  3. עוברים חנות ב 4 מעלות צלזיוס 1x PBT במשך 2 - 3 שבועות. עבור אחסון לטווח ארוך של עוברים, ליבש את העוברים על ידי שטיפה פעמיים מתנול 100% בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אחסן את העוברים ב -20 ° C. מתנול 100%.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjections של 4 ו-תאים 8 עוברי Xenopus עם mRNA MEM-RFP להראות רמות שונות של מיקוד אל כִּליַת רֵאשִׁית. איור 4 מראה הבמה 40 עוברים עם דפוסי ביטוי mRNA MEM-RFP הנכון. עובר הוזרקו ב blastomere הגחון השמאלי (איור 4 א), מיון עבור דפוס הביטוי ההולם של mRNA MEM-RFP. בנוסף להביע MEM-RFP ב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של הכליה, עוברים מוזרק כראוי צפויים להראות הקרינה באפידרמיס של הראש, חדק, והזנב....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקוד כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus מסתמכת על זיהוי הזרקת blastomere הנכון. הזרקה של blastomere V2 של עוברים 8 תאים מטרות כִּליַת רֵאשִׁית שמאל 18. זה משאיר את כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית כמו שליטה פנימית. אם morpholino מציאה או ביטוי יתר RNA משמש המשנה את ההתפתחות בכליה, כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית יכולה לשמש כדי להשוות את ההשפעות של מציאת גן או ביטוי יתר על כִּליַת רֵאשִׁית השמאל. במקרה זה, בקרות נאותות כגון morpholino שליטה תואמת או מבנה RNA שליל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק NIDDK (K01DK092320) ומימון אתחול מתוך מחלקת ילדים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טקסס מקגוורן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן כלוריפישרS271-3
אשלגן כלוריפישרP217-500
מגנזיום גופרתי פישרM63-500
סידן כלוריפישרC79-500
HEPESפישרBP310-500
EDTAפישרS311-500
תמיסת גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"לאמרסקוE737-20 מ"ל
L-ציסטאין, 99%+אקרוס אורגניקס52-90-4
פיקול פישרBP525-100
צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מפישרFB0875712
מיני מקרר IIBoekel260009אינקובטור ספסל לעוברים.
Gap43-RFPלייצור RNA מעקב. סימוכין: Davidson et al., 2006.
רודמין דקסטרן, 10,000 מ"ו.InvitrogenD1817Tracer.
דרגת ביולוגיה מולקולרית, USP מים מטוהרים סטרילייםקורנינג46-000-CI
7 אינץ' צינורות החלפת דראמונדDrummond3-000-203-G/XLמחטי מיקרו-הזרקה.
מושך מחטSutter InstrumentsP-30
מלקחיים עדיניםDumont11252-30לשבירת קצה מחט מיקרו-הזרקה.
Nanoject IIDrummond3-000-204מיקרו-מזרק.
שמן מינרלי, כבדפישרCAS 8042-47-5שמן למחטים.
27 גרם מחט היפודרמית מונוגז'קטCovidien8881200508להעמסת שמן מינרלי למחט מיקרו-הזרקה.
5 מ"ל מזרק Luer-LokBD309646להעמסת שמן מינרלי למחט מיקרו-הזרקה.
צלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מפישרFB0875713A
רשת פוליאסטר 800 מיקרוןחלקים קטניםCMY-0800-C
צנרת העברהפישר13-711-7Mלהעברת עוברים. חותכים את הקצה כך שהעוברים ייקלטו בקלות על ידי הפיפטה.
צלחת תרבית תאים 6 בארותNest Biotechnology
MOPSFisherBP308-500
EGTAAcros Organics67-42-5
פורמלדהידפישרBP531-500
15 מ"מ x 45 מ"מ בקבוקון הברגהפישר03-339-25Bלקיבוע, צביעה ואחסון עוברים.
צלחת תרבית תאים 24 בארותקן ביוטכנולוגיה
ספקטרוםבנזוקאיןBE130
אתנולפישרBP2818-4
מתנולפישרA412-4
פוספט חוצץ מלח (PBS) 1x אבקהפישרBP661-50
אלבומין סרום בקרפישרBP1600-100
Triton X-100FisherBP151-500
3D Mini Rocker, דגם 135Denville Scientific57281
סרום עיזים, ממוצא ניו זילנדיInvitrogen16210064
נתרן אזידFisherS227I-25
נוגדן מונוקלונלי 3G8European Xenopus Resource Centerנוגדן ראשוני לתיוג פרוקסימלי צינורות.
נוגדן חד-שבטי 4A6European Xenopus Resource Centerנוגדן ראשוני לסימון צינורות ביניים, דיסטליים וחיבור.
anti-RFP pAb, מטוהר IgG/rabbitMBLPM005נוגדן ראשוני לסימון עוקב Gap43-RFP.
Alexa Fluor 488 עז נגד עכברים IgGLife TechnologiesA11001נוגדן משני לתיוג צינורות כליה.
Alexa Fluor 555 עז נגד ארנב IgGLife TechnologiesA21428נוגדן משני לסימון עוקב Gap43-RFP.
9 צלחת ספוט חללקורנינג7220-85
בנזיל בנזואטפישר105862500אופציונלי - לפינוי עוברים
בנזיל אלכוהולפישרA396-500אופציונלי - לפינוי עוברים
פלסמיד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
  3. Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
  4. Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  5. Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
  6. Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84(2008).
  7. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
  8. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  9. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  10. Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
  11. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
  12. Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
  13. Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  15. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
  16. Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
  17. Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
  18. Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
  19. Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
  20. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
  21. Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
  22. Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
  23. Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  24. Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
  25. Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
  26. Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
  27. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
  28. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
  29. Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
  30. Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Xenopusstaining

מאמרים קשורים