טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במפות גורל ועוקבי שושלת כדי למקד זריקות לבלסטומרים בודדים המולידים כליה של עוברי Xenopus laevis.

תקציר

הכליה העוברית של Xenopus laevis (צפרדע), את כִּליַת רֵאשִׁית, מורכב נפרון יחיד, והוא יכול לשמש כמודל למחלת כליות. עוברי Xenopus הם גדולים, לפתח חיצונית, ניתן להשפיע בקלות על ידי microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, מפות גורל הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם. microinjection ממוקד לתוך blastomere הפרט כי בסופו של דבר יהיה להצמיח איבר או רקמה של עניין ניתן להשתמש כדי overexpress או להפיל ביטוי גנים באופן סלקטיבי בתוך האזור המוגבל הזאת, הפחתת השפעות משניות בשאר העובר המתפתח. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנצל מפות גורל Xenopus הוקמה כדי למקד את הכליה Xenopus פיתוח (להלן כִּליַת רֵאשִׁית), באמצעות microinjection לתוך blastomere ספציפיים של עוברים תאים 8 4 ו. הזרקה של קליעי נותבים שושלת מאפשרת אימות של המיקוד הספציפי של הזריקה.לאחר עוברים פתחו לשלב 38 - 40, כל הר immunostaining משמש כדי לחזות התפתחות pronephric, והתרומה ידי תאים ממוקדים אל כִּליַת רֵאשִׁית ניתן להעריך. באותה טכניקה ניתן להתאים למקד סוגי רקמות אחרות בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית.

מבוא

הכליה העוברית Xenopus, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל טוב ללימוד פיתוח כליות ומחלות. עובר לפתח חיצוני, הם גדולים, יכולים להיות מיוצרים בכמויות גדולות, והם מניפולציות בקלות באמצעות microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, הגנים לפיקוח על בניית כליות אצל יונקים ודו-חיים הם משומר. כליות יונקות להתקדם דרך שלושה שלבים: כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה, ו metanephros ^1, בעוד דו חיים עובריים כִּליַת רֵאשִׁית ודו-חי בוגרים יש metanephros. יחידת הסינון הבסיסית של צורות כליות אלה היא נפרון, ושניהם יונקים ודו-חיים דורשים את אותה מפלי איתות ואירועים אינדוקטיביים לעבור nephrogenesis ^{2, 3.} כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus<....

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא אושר על ידי האוניברסיטה למדעי בריאות מרכז טקסס המרכז של יוסטון ועדת צער בעלי חיים לרפואה בחיות מעבדה, אשר ממשמשת לטיפול המוסדי ועדת שימוש (# פרוטוקול: HSC-AWC-13-135).

זיהוי 1. בחירה של בלסטומרים עבור זריקות כליות במיקוד

1. לפני יצירה עוברת, השתמש הטבלה הרגילה של Xenopus פיתוח ²¹ כדי להבין את הכיוון של חלוקות התא מוקדם בעובר. לחלופין, דיאגרמות גישה של השלבים ההתפתחותיים המוקדמים של Xenopus על Xenbase ^11.

תוצאות

Microinjections של 4 ו-תאים 8 עוברי Xenopus עם mRNA MEM-RFP להראות רמות שונות של מיקוד אל כִּליַת רֵאשִׁית. איור 4 מראה הבמה 40 עוברים עם דפוסי ביטוי mRNA MEM-RFP הנכון. עובר הוזרקו ב blastomere הגחון השמאלי (איור 4 א), מיון עבור דפוס הביטוי ההולם של mRNA MEM-RFP. בנוסף להביע MEM-RFP ב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של הכליה, עוברים מוזרק כראוי צפויים להראות הקרינה באפידרמיס של הראש, חדק, והזנב........

דיון

מיקוד כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus מסתמכת על זיהוי הזרקת blastomere הנכון. הזרקה של blastomere V2 של עוברים 8 תאים מטרות כִּליַת רֵאשִׁית שמאל ^18. זה משאיר את כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית כמו שליטה פנימית. אם morpholino מציאה או ביטוי יתר RNA משמש המשנה את ההתפתחות בכליה, כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית יכולה לשמש כדי להשוות את ההשפעות של מציאת גן או ביטוי יתר על כִּליַת רֵאשִׁית השמאל. במקרה זה, בקרות נאותות כגון morpholino שליטה תואמת או מבנה RNA שליל.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי	פישר	S271-3
אשלגן כלורי	פישר	P217-500
מגנזיום גופרתי	פישר	M63-500
סידן כלורי	פישר	C79-500
HEPES	פישר	BP310-500
EDTA	פישר	S311-500
תמיסת גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"ל	אמרסקו	E737-20 מ"ל
L-ציסטאין, 99%+	אקרוס אורגניקס	52-90-4
	פיקול פישר	BP525-100
צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ	פישר	FB0875712
מיני מקרר II	Boekel	260009	אינקובטור ספסל לעוברים.
		Gap43-RFP	לייצור RNA מעקב. סימוכין: Davidson et al., 2006.
רודמין דקסטרן, 10,000 מ"ו.	Invitrogen	D1817	Tracer.
דרגת ביולוגיה מולקולרית, USP מים מטוהרים סטריליים	קורנינג	46-000-CI
7 אינץ' צינורות החלפת דראמונד	Drummond	3-000-203-G/XL	מחטי מיקרו-הזרקה.
מושך מחט	Sutter Instruments	P-30
מלקחיים עדינים	Dumont	11252-30	לשבירת קצה מחט מיקרו-הזרקה.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	מיקרו-מזרק.
שמן מינרלי, כבד	פישר	CAS 8042-47-5	שמן למחטים.
27 גרם מחט היפודרמית מונוגז'קט	Covidien	8881200508	להעמסת שמן מינרלי למחט מיקרו-הזרקה.
5 מ"ל מזרק Luer-Lok	BD	309646	להעמסת שמן מינרלי למחט מיקרו-הזרקה.
צלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ	פישר	FB0875713A
רשת פוליאסטר 800 מיקרון	חלקים קטנים	CMY-0800-C
צנרת העברה	פישר	13-711-7M	להעברת עוברים. חותכים את הקצה כך שהעוברים ייקלטו בקלות על ידי הפיפטה.
צלחת תרבית תאים 6 בארות	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
פורמלדהיד	פישר	BP531-500
15 מ"מ x 45 מ"מ בקבוקון הברגה	פישר	03-339-25B	לקיבוע, צביעה ואחסון עוברים.
צלחת תרבית תאים 24 בארות	קן ביוטכנולוגיה
ספקטרום	בנזוקאין	BE130
אתנול	פישר	BP2818-4
מתנול	פישר	A412-4
פוספט חוצץ מלח (PBS) 1x אבקה	פישר	BP661-50
אלבומין סרום בקר	פישר	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini Rocker, דגם 135	Denville Scientific	57281
סרום עיזים, ממוצא ניו זילנדי	Invitrogen	16210064
נתרן אזיד	Fisher	S227I-25
נוגדן מונוקלונלי 3G8	European Xenopus Resource Center		נוגדן ראשוני לתיוג פרוקסימלי צינורות.
נוגדן חד-שבטי 4A6	European Xenopus Resource Center		נוגדן ראשוני לסימון צינורות ביניים, דיסטליים וחיבור.
anti-RFP pAb, מטוהר IgG/rabbit	MBL	PM005	נוגדן ראשוני לסימון עוקב Gap43-RFP.
Alexa Fluor 488 עז נגד עכברים IgG	Life Technologies	A11001	נוגדן משני לתיוג צינורות כליה.
Alexa Fluor 555 עז נגד ארנב IgG	Life Technologies	A21428	נוגדן משני לסימון עוקב Gap43-RFP.
9 צלחת ספוט חלל	קורנינג	7220-85
בנזיל בנזואט	פישר	105862500	אופציונלי - לפינוי עוברים
בנזיל אלכוהול	פישר	A396-500	אופציונלי - לפינוי עוברים

פלסמיד