שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Summary

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

Abstract

תאי דנדריטים (DCS) הם תאים מקצועיים מציגי אנטיגן אחראים בעיקר על רכישה, עיבוד והצגת אנטיגנים על אנטיגן הצגת מולקולות ליזום חסינות T-cell בתיווך. ניתן להפריד תאים דנדריטים לכמה תת phenotypically והטרוגנית מבחינה תפקודית. שלושה תת חשוב של תאים דנדריטים הטחול הם plasmacytoid, CD8α ^קופה CD8α ^נג תאים. הקל DCS plasmacytoid מפיק טבעי מסוג שאני אינטרפרון חשוב חסין תא T אנטי ויראלית. תת CD8α ^נג DC מתמחה בגין הצגת אנטיגן הכיתה MHC II ומעורב מרכזי תחול תאי CD4 T. קל DCS ^Pos CD8α אחראים בעיקר עבור צולבות הצגת אנטיגנים אקסוגניים תחול תא CD8 T. קל DCS ^Pos CD8α הוכח להיות יעיל ביותר על הצגת אנטיגנים glycolipid ידי מולקולות CD1d על cel T מיוחדהאוכלוסייה l המכונה T קטלניים טבעי משתנה (iNKT) תאים. מינהל של ליגנד FLT-3 מגביר את תדירות הגירה של אבות תאים דנדריטים ממח העצם, בסופו של דבר וכתוצאה מכך הרחבה של תאים דנדריטים באיברים הלימפה היקפי במודלים Murine. אנחנו צריכים להתאים את המודל הזה לטהר מספר גדול של תאים דנדריטיים פונקציונלי לשימוש בניסויים תא העברה להשוות in vivo מיומנות של תת DC שונים.

Introduction

תאי דנדריטים (DC) נתגלו לפני כמעט ארבעים שנה כמו "stellate הגדול (Dendron היוונית) התא" נמצא באיברי הלימפה ^1. מחקרים רבים הראו כי DCs הם אנטיגן רק תאי מציגים שיכולים לעורר נאיביים בתאי T ² ביעילות. תפקידה העיקרי של תאים אלה הוא ספיג והצגת אנטיגנים והעיבוד היעיל שלהם וטעינה של אלה על מולקולות מציגי אנטיגן. טחול עכבר, DCS ניתן לחלק plasmacytoid לבין תת-קונבנציונלי. הקל DCS plasmacytoid מאופיין ביטוי הנמוך של CD11c ורמות גבוהות של B220 ו Gr-1. הם גם חיוביים עבור mPDCA1 סמן משטח ומפרישים מסוג I אינטרפרון בתגובה האגרה כמו 9 קולטן (TLR9) הליגנדים. הקל DCS הקונבנציונלי גבוה עבור CD11c והביטוי השני בכיתת MHC. הם יכולים להיות מחולקים לשלוש קבוצות משנה נבדלים זה מזה המבוססים על ביטוי השטח של סמנים פנוטיפי כגון CD4, CD8α, DEC205, CD11b ו קולטן 2 מעכבות תאים דנדריטים (DCIR2, מוכר על ידי נוגדן 33D1) חלבונים ^3,4. קל DCS ^Pos CD8α ידועים גם בשם cDC1, הן חיוביות עבור DEC205, אבל שלילי עבור סמנים מיאלואידית כגון CD11b ו 33D1. CD8α ^נג DCS, המכונה גם cDC2, הן חיוביות עבור 33D1, CD11b ו CD4, אך עדיין חסר DEC205. תת שלילי כפול (כלומר, שלילי עבור שניהם CD4 ו CD8α) היא נדירה יחסית, והוא שלילי DEC205 ו 33D1. זהו משנה לפחות מאופיין ועלול להיות צורה פחות מובחנת של CD8α ^נג DC.

הבדלים פנוטיפי של תת DC השונה גם להאריך לפונקציות in vivo שלהם. קל DCS ^נג CD8α הם phagocytic מאוד נחשבים להציג אנטיגן אקסוגניים בעיקר דרך רמה MHC II לתאי CD4 T ^3. לעומת זאת, DCs ^Pos CD8α מתמחים בגין הצגת אנטיגן חלבון מסיס על דיוק I MHCבמנגנון הנקרא-מצגת צלב. התוצאה של הצגת צלב תלוי את מצב ההפעלה של DCs אלה ^5, והוא יכול גם להוביל להרחבת תאי T ציטוטוקסיים (תאי-ההרג) או התפתחותם של תאי רגולטוריים T ^{6 2,7.} מיקוד של אנטיגן כדי CD8α ^Pos DCs באמצעות תוצאות משלוח אנטי DEC205-נוגדן בתיווך בעיקר את המחיקה של תאי T ^8, ואילו הצגת אנטיגנים שמקורם בתאי אפופטוטיים נגועים גורמת לתגובת CTL חזקה ^9.

בנוסף להכרה אנטיגנים פפטיד, המערכת החיסונית היונקת התפתחה להכיר שומנים אנטיגנים glycolipid. אנטיגנים אלה מוצגים על ידי מולקולות CD1, אשר הם חלבונים פני התא אני- כמו בכיתה MHC הקיימים בצורות הקשורות מרובים אצל יונקים שונים. בעכברים, סוג אחד של המולקולה CD1 שמור ביותר בשם CD1d אחראי הצגת אנטיגנים glycolipid ^10. העיקרי אוכלוסיית תאי T שמזהים מתחמי CD1d / glycolipid נקראת תאי NKT משתנים (תאי iNKT). תאים אלה מבטאים קולטן תא T למחצה משתנה (TCR) מורכבת שרשרת TCRα משתנה כי היא זיווג עם שרשראות TCRβ שיש להם מוגבלות המגוון ^11. שלא כמו תאי T קונבנציונליים שצריכים להתרבות להבדיל להפוך לתאי T מפעיל מופעלים, תאי iNKT להתקיים בתור אוכלוסייה מפעיל ולהתחיל להגיב במהירות לאחר מתן glycolipid ^12. זיהוי של תאים מציגי אנטיגן השומנים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הוא אזור פעיל של מחקר, וכמה סוגי תאים ברורים, כגון תאי B, מקרופאגים DCs הוצעו כדי לבצע את התפקיד הזה. עם זאת, זה הודגם כי משנה ^Pos CD8α של DCs הוא התא הראשוני בתיווך ספיג והצגת אנטיגנים שומנים לתאי העכבר iNKT ¹³ ו בתיווך glycolipid-יחול צלב של תאי CD8 T ^14.

ove_content "> כדי להשוות את היעילות של מצגת אנטיגן על ידי הצגת תאי אנטיגן שונים, גישה פשוטה היא להעביר סוגים שונים של נגמ"שים מטוהרים פעמו עם כמויות מקבילות של אנטיגן לתוך מארחיהם תמימים. ניסויי תא העברה מסוג זה מבוצעים לעתים קרובות ללימודים אימונולוגית. עם זאת, ביצוע מחקרי העברה עם אנטיגן vivo לשעבר DCs מטופל הוא מאתגר, שכן התאים הללו קיימים אוכלוסיות נדירות כמו באיברים הלימפה, שם הם מהווים פחות מ -2% של תאים הכוללים ^15. לכן, יש לחזק את הפיתוח של תאים אלה בחי תורם כדי להגביר את היעילות של פרוטוקולי בידוד.

זה ידוע כי הלימפה המשותף ואת אבות מיאלואידית משותפים, אשר נדרשים עבור דור של PDC, CD8 ^קופת CD8 ^נג DC תת, המפורש FMS הקשורות טירוזין קינאז קולטן 3 (FLT-3). עם in vivo FLT-3 ליגנד (FLT-3L) הממשל, emigratיון של FLT-3 להביע ובתאים ממח עצם הוא גדל, וכתוצאה מכך הזריעה של איברי הלימפה פריפריה גדלה והרחבת צאצאי DC הבוגרת שלהם ^16. ביטוי של FLT-3 הוא אבד במהלך מחויבות B, T או NK מסלולי התמיינות תאים. לכן, שינויים מינימליים בלבד הם נצפו בתאים אלה על הממשל FLT-3L. התרחבות דומה באוכלוסיות DC הוא ציין בעכברי נושאי גידולים שנוצרו על ידי השתלת קו תא B16-מלנומה מפריש FLT-3L בעכברים, אשר מספקת שיטה פשוטה וחסכונית למתן רמות מערכתיות מתמשכות של המשפט פרם-3L ^17,18. בגישה זו, פתחנו פרוטוקול מבוסס על השתלת תאי B16-מלנומה מפריש FLT-3L כדי לעורר את הרחבת כל תת DC הנורמלי טחול עכבר, ולכן מאוד הגדלת התשואות של תאים אלה שיכולים להיות מבודדים לניסויים הבאים . אנחנו מוצאים בעקביות כי תוך 10 - 14 ימים לאחר im תת עוריתמטע של הגידול והסתרתו FLT-3, עכברים לפתח splenomegaly עם העשרה ניכר של DCs להוות 40 - 60% של תאי טחול הכולל. מ spleens אלה, תת DC שונה יכול להיות מבודד עם טוהר גבוה באמצעות תקן זמינה מסחרי ערכות טיהור תא המעסיקות סמנים פנוטיפי משנה ספציפי.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים נעשים בהתאם להנחיות שאושרו מועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC). כל הנהלים המחייבים עקר מבוצעים בתוך ארון בטיחות ביולוגי.

1. השרשה של מלנומה B16.Flt3L עכברים

1. התרבות FLT-3 להביע שורת תאים B16 מלנומה צלוחיות בתרבית רקמה T25 בצפיפות של 0.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום מלאה DMEM עם 10% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס. לגדול עד שהתאים להגיע ~ 90 מפגש% (~ 20 שעות).
2. קציר התאים על ידי טריפסין העיכול. תרבית תאי תקשורת לשאוב ולשטוף את התאים החסידים עם PBS. הוסף 5 מ"ל של טריפסין 0.05% ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף קר 20 מ"ל להשלים בינוני DMEM (4 ° C) המכילה סרום העובר עגל (FCS) כדי להרוות את העיכול פרוטאז. הרם את התאים את ידי קלות הקשה אחריו בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
3. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300XG במשך 10 דקות ב 4 °. ספירת התאים באמצעות hemocytometer או דלפק כדאי תא אוטומטי. Resuspend צפיפות של 10 מ"ל ⁸ תאים / PBS.
4. עכברים שתל (C57BL / 6 או אחר זן histocompatible) עם תאים סרטניים על ידי הזרקה תת עורית כפי שתואר על ידי Machholz et al. ¹⁹ בבסיס הצוואר עם 100 μl של השעיה תא (10 ⁷ תאים).
5. אפשר הגידול לגדול עד מוחשיים או גלויים (2 - 10 מ"מ קוטר, בדרך כלל 7 - 12 ימים) לפני להקריב חיות עבור קצירת איברים.

2. הכנת תרחיף תא בודד טחול מעכברי נושאות גידולים

1. להרדים עכברים עם ממנת יתר של isoflurane (להתאים את קצב זרימת isoflurane ל> 5% ולהמשיך לפחות 2 דקות חשיפה לאחר שנשמו עצירות). להקריב את עכבר נושאת גידול של מלנומה FLT-3 על ידי נקע בצוואר רחם בהתאם להנחיות מוסדיות להמתת חסד.
2. disinfect העור עם 70% אתנול ו טחול קציר באמצעות טכניקה מזוהמת בעזרת מספריים סטריליות ^20.
3. מניח את הטחול לתוך צלחת פטרי סטרילית לתחבורה לקבינט הבטיחות הביולוגי. ביצוע כל הצעדים מכאן ולהבא בתנאים סטריליים.
4. עבר טחול כדי בצלחת פטרי טריה ולשטוף עם מדיום RPMI. חותכים את הטחול לתוך קטן (~ 0.2 ס"מ ²⁾ חתיכות באמצעות אזמל. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 10 מ"ל של תמיסת collagenase / DNase.
5. יוצקים את ההשעיה מעוכל חלקית של רקמת הטחול על מסננת תא 70 מיקרומטר. לדחוס את שברי הרקמה הנותרת מבעד לרשת של מסננת באמצעות הבוכנה מזרק 5 מ"ל.
6. שטפו את המסנן רשת עם 10 מ"ל של מדיום חדש וזורקים את המסנן. צנטריפוגה ההשעיה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולת התאים.
7. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל של חיץ תמוגה RBC. לדגור על RT fאו 10 דקות. להרוות למאגר תמוגה RBC על ידי הוספת 10 מ"ל של מדיום RPMI מלאה.
8. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. Resuspend בנפח המתאימה להשגת צפיפות התאים של 10 מ"ל ⁸ תאים / חיץ מיון התא (לדוגמא, MACS) המכיל 20 מיקרוגרם / מ"ל של נוגדן Fc-בלוק (2.4G2).

טיהור 3. Plasmacytoid DCS, CD8α ^Pos DCS ו CD8α ^נג DCs מ תרחיף תא בודד הטחול

הערה: בידוד של תת DC טחול מן השעית תא בודדת הוא הליך רב שלבים כפי שמודגם באיור 1 בצע את כל השלבים באמצעות חיץ טרום מקוררת באמבט מי קרח כדי לשמור על טמפרטורת 4 - C ° 8.. כל הכרכים מגיב בסעיף הבא של פרוטוקול מחושבים עבור קלט ראשוני של 200 μl של השעיה תא הטחול ב 10 ⁸ תאים / מ"ל). זה יכול להיות scaled למעלה אולמטה בהתאם לצורך שלך על ידי שינוי עוצמת הקול של השעיה תא (תמיד בצפיפות של 1 X 10 ⁸ תאים / מ"ל) ריאגנטים אחרים יחסי בשלב הראשוני (3.1.1 ו 3.2.1). התאם כרכים מגיבים בכל השלבים מאוחר יותר בהתאם. לדוגמה, אם מתחילים עם 100 μl של ההשעיה תא הטחול ב 1 x 10 ⁸ / מ"ל, להשתמש במחצית כרכים מגיב כאמור בכל השלבים.

1. בידוד של Plasmacytoid DCS (PDC)
   1. הוספת 300 μl של קוקטייל של נוגדנים שכותרתו ביוטין המסופק בערכה בידוד DC plasmacytoid 200 μl של ההשעיה תא הטחול.
   2. מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות. קש הצינור כל 3 דקות כדי לשמור על התא המושעה, וכדי למקסם נוגדן מחייב.
   3. להוסיף 12 מ"ל מיון התא חיץ גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב g 300 x 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant להסיר נוגדני biotinylated מאוגדים.
   4. Resuspend התאגלולה ב 500 μl של חיץ מיון התא. הוספת 300 μl של חרוזים מצומדות נוגדן אנטי ביוטין. חזור על שלב 3.1.2 3.1.3.
   5. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל של חיץ מיון התא. ביצוע כל הצעדים מנקודה זו ואילך ב RT באמצעות מאגרים מראש מקורר.
   6. מניח תא מגנטי טרי מיון מופעל עמודת LS בדוכן המגנטי. לשטוף לאזן העמודה עם 5 מ"ל של חיץ מיון התא.
   7. פיפטה השעית התא על הטור, וליישם אותו בעדינות למרכז של פני השטח של מיטת העמודה. אסוף את הזרימה דרך.
   8. לשטוף את העמודה עם 10 מ"ל של חיץ מיון התא. אסוף זרימה זו דרך ולשלב עם זרם דרך משלב 3.1.7. PDCs מועשרים בתזרים הטור הזה דרך (FT1).
   9. גלולת התאים מן FT1 על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend ב 2 מיליליטר מיון תא חיץ ולהעביר את התאים דרך עמודת LS טריהעל ידי חזרה על שלבים 3.1.6 - 3.1.8. שימוש זה של שתי עמודות רציפי מניב טוהר משופרת של תאים מבודדים.
   10. תאים גלולה ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend עם 2 מ"ל RPMI להשלים. מניחים על קרח עד הצורך.
2. בידוד של ^Pos CD8α ו CD8α ^נג DCs
   הערה: השלב הראשון בהליך זה הוא דלדול של B, PDC, תאי T ו- NK.
   1. החל ההשעיה הטחול התא כולו (1 מ"ל של 10 מ"ל ⁸ תאים / שהושגו בשלב 2.8), להוסיף 100 μl של קוקטייל נוגדן ביוטין מצומדות המסופק בערכה בידוד CD8α ^Pos DC.
   2. מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות. הקש על הצינור בעדינות כל 3 דקות על מנת למקסם מחייב של נוגדנים שכותרתו ביוטין לתאי היעד שלהם.
   3. להוסיף 12 מ"ל מיון התא חיץ גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C. סופר לשאובשׂוֹחֶה להסיר נוגדני biotinylated מאוגדים.
   4. להוסיף 150 μl של מיון התא חיץ 100 μl של חרוזים אנטי ביוטין המסופק בערכה בידוד CD8α ^Pos DC. מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות.
   5. הוסף 10 מ"ל מיון התא חיץ גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   6. תאי Resuspend במאגר מיון 1 מיליליטר תא לעבור על עמודת LS טריה על פי נוהל בצעדים 3.1.6 דרך 3.1.8.
   7. אסוף את הזרימה ללא תווית באמצעות 2 (FT2) וזורק את retentate העמודה. חלק תווית זה מועשר עבור CD8α ^קופה CD8α ^נג DCs.
   8. גלולת התאים ב FT2 על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
   9. Resuspend התאים חיץ מיון תא 1 מ"ל ולהוסיף 200 μl של חרוזים מגנטיים מצומדות אנטי CD8α המסופק בערכה בידוד CD8α ^Pos DC.
   10. נציגלאכול צעדים 3.2.2 דרך 3.2.6. את הזרימה דרך של הטור הוא מועשר עבור CD8α ^נג DCS ו מדולדל עבור CD8α ^Pos DCs. זה מסומן זרימה דרך 3 (FT3).
   11. כדי elute קל DCS ^Pos CD8α שמר בעמודה, להסיר את העמודה מן מגנט, להוסיף 5 מ"ל של חיץ מיון התא ולטהר את מטריצת עמודה באמצעות הבוכנה מסופק עם טור LS.
   12. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant ו resuspend לשאוב ב 1 מ"ל תא חיץ מיון. כדי להגדיל את הטוהר, לתפעל את תאי eluted שוב דרך עמודת LS טריה ידי חזרה על שלבי 3.1.6 עד 3.1.8, למעט וזורק את הזרימה דרך ולאסוף תאי עודפים ב 3.2.11.
   13. כדי לטהר את DCs ^נג CD8α מן ההשעיה FT3, גלולה FT3 על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב 300 μl של חיץ מיון התא.
   14. הוספת 100 μl של mag אנטי CD11cחרוזים מגנטיים. מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות.
   15. הוסף 10 מיליליטר מיון תא תאי חיץ גלול ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   16. חזור על שלבים 3.1.5 דרך 3.1.8. הקל DCS ^נג CD8α נבחר באופן חיובי עם חרוזי CD11c וכפופים לעמודה. את זרימת דרך יכולה להיות מושלכת.
   17. Elute התאים העודפים בעמודה כמתוארת בשלב 3.2.11 לאסוף את DCs ^נג CD8α המטוהר.

4. פועם נגמ"שים עם אנטיגנים תא העברה

1. ספירת תאים חיים לאחר טיהור באמצעות הרחקה trypan כחול ²¹ להבחין בין תאים חיים ומתים.
2. דגירת התאים עם האנטיגן של בחירה. השתמש אנלוגים של ceramide שנקרא glycolipid אנטיגן אלפא-galactosyl (αGalCer) ב 100 ננומטר ריכוז ^13. בדרך כלל, צלחת 10 ⁶ תאים קיימא / היטב שלם בינוני RPMI באמצעות attac אולטרה-נמוכהhment U-bottom 96 צלחות גם למזער מצורף התא. דגירה התאים באווירה 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 - שעה 4.
3. קציר תאים על ידי pipetting מספר פעמים בעדינות. השתמש בעצות פיפטה נשא רחב כדי למזער נזק לתאים מפני כוחות גזירה. לשטוף את הבארות עם PBS וברכת שטיפות אלה על מנת למקסם את קציר תא.
4. גלולת תאי XG ב 300 דקות 5 ב 4 ° C ו resuspend לצפיפות רצויה PBS. בדרך כלל, להזריק 1 מיליון תאים ב 200 μl לכל חיה הנמען. שמור את התאים על קרח כדי למקסם כדאי לפני מתן לתוך חיים מארחים.
5. להזריק תאים לווריד לעכברים או דרך לשווא הזנב לרוחב או מקלעת ורידית רטרו מסלולית ^19. שימוש במחט 27 G על מזרק 1 מ"ל, להזריק נפח מרבי של 0.1 מ"ל לכל עכבר.

Results

התוצאה של הליך זה מסתמכת על ההרחבה תת DC ידי murine FLT-3L שהביעה תאים מלנומה מושתל. גידול B16.Flt3L נגזר עכבר C57BL / 6, וצריך להיות מושתל לתוך חיים עם שרקע הזן כדי למנוע כשל של הגידול להתבסס עקב דחייה. במקרים מסוימים, זה עשוי להיות רצוי להשתמש בעכברים מהונדסים גנטית לגזור DCs עם פגמים ידועים מסלולי איתות או קולטנים של עניין. חשוב לזכור כי הגידול עלול להתפתח עם קינטיקה שונה בחיות כאלה, ולכן חשוב לעקוב אחר גדילת גידול על בסיס המראה ומישוש באתר החיס...

Discussion

תאי דנדריטים מתקבלים להיות אנטיגן המקצועי הגדול הצגת תאי המעורבים יחולו התגובות של תאי T. הפונקציה העיקרית שלהם היא לסקור את microenvironment הרקמות על ידי תופס ועיבוד אנטיגנים להגשה תא T. על מנת ללמוד את הפונקציה של תת-מערכות ספציפיות DC, אלה צריכים להיות מבודדים בכמות מספקת באמצעות גישה מקיימת הפנוטיפ והתפקוד התקינים שלהם. רוב הפרוטוקולים להסתמך על הבידוד של תת DC ספציפי מעכברים נאיביים. מאז תאים אלה הם נדירים, נהלי הבידוד אינם יעילים להניב כמויות נמוכות של תאי. לדוגמא, טחול אחד...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% טריפסין-EDTA	לייף טכנולוג'יז, ג'יבקו	25300-054
איזופלורן	סיגמא-אולדריץ'	CDS019936-250MG
קולגנאז D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (אבקה יבשה)	QIAGEN	79254
200 הוכחה אתנול	תרמו פישר סיינטיפיק	9-6705-004-220	משמש להכנת 70% אתנול
RBC מאגר ליזה	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 בינוני עם L-גלוטמין	Life Technologies, Gibco	11875-119
מדיום DMEM עם L-גלוטמין	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 מ"מ L-גלוטמין	Life Technologies	25030081
חומצות אמינו לא חיוניות MEM	Life Technologies, גיבקו	11140-050
חומצות אמינו חיוניות MEM	לייף טכנולוגיות	11130-051
&בטא;-מרקפטואתנול	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
נתרן פירובט	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS Ca2+ ו-Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco' s PBS (DPBS עם Ca2+ ו-Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M תמיסת Ethylenediaminetetraacetate (EDTA)	Life Technologies	15575-020
אלבומין בסרום בקר (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
סרום עגל עוברי	Atlanta Biologicals	S11050
פניצילין/סטרפטומיצין	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
טריפן כחול (אבקה יבשה)	סיגמא-אולדריץ'	T6146-5G	הכן 0.08% עם PBS
ערכת בידוד תאים דנדריטיים של פלסמציטואיד II, עכבר	Miltenyi Biotech	130-092-786
חרוזים מגנטיים מצומדים עם אנטי עכבר CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8α Pos ערכת בידוד DC לעכבר	Miltenyi Biotech	130-091-169
נוגדן חוסם קולטן Fc-gamma (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-Mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
אנטי-עכבר CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
נגד עכברים B220-PE	BD Biosciences	553090
מזרקי 1 מ"ל	מחט BD	26048
23 G1	305145		BD
צלחות פטרי 100 מ"מ	Thermo Fisher Scientific	875712
מכשירים כירורגיים	של Kent Scientific	INSMOUSEKIT
(70 ומיקרו; m)	BD	352350
לוחות פטרי גדולים		ואקום Thermo Fisher Scientific
(500 מ"ל (0.22 ומיקרו; m))	קורנינג	431097
עמודות LS	Miltenyi	130-042-401
מעמד מגנטי מפריד MACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
קדח רחב 200 μ l קצות פיפטה	PerkinElmer	111623
קורנינג חיבור נמוך במיוחד 96 בארות	קורנינג	CLS3474-24EA
נקבה בת 6-8 שבועות C57BL/6 עכברים	מעבדות מחקר ג'קסון,
מורין B16.Flt3L	המתואר על ידי Mach et al., 2000
10  מ"מ) 5 מ"ל חוצץ HEPES (1 מ') 5 מ"ל L-גלוטמין (200  mM) 0.5 מ"ל 2-מרקפטואתנול (5.5 x 10-2 M)			מערבבים את כל המרכיבים בארון בטיחות ביולוגית עם מדיה DMEM או RPMI בהתאם לצורך שלך. מסנן לעקר את המדיה על ידי מעבר דרך 0.22 µ מערכת סינון ואקום M.
<חזק>מדיית RPMI ו-DMEM מלאה			הוסף 50 מ"ל של סרום עגל עוברי מומת בחום למדיית RPMI או DMEM ללא סרום כדי לקבל מדיה מלאה.
<חזק>מאגר MACS			הוסף 2 מ"ל של 0.5 M EDTA ו-10 מ"ל של סרום עגל עוברי מומת בחום ל-500 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS, Ca2+ ו-Mg2+ Free, pH 7.2) ו-2  ומיקרו; גרם/מ"ל 2.4G2 (נוגדן Fc-Block).
<חזק>מאגר צביעה FACS			ממיסים נתרן אזיד ל-0.05% (0.25 גרם ל-500 מ"ל) במאגר MACS כדי לקבל מאגר צביעה FACS
<חזק>10x תמיסת מלאי קולגנאז D ו-DNase 1 יש להמיס 1 גרם קולגנאז D ו-0.2 מ"ל ציר DNase 1 (1 מ"ג/מ"ל, 100x) ב-20 מ"ל PBS המכיל Ca2+ ו-Mg2+ לקבלת תמיסה של כ-1,000-2,000 יחידות של פעילות קולגנאז למ"ל.			ניתן להכין פתרון מלאי זה פי 10 מבעוד מועד ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C למשך מספר שבועות. יש לדלל 1 מ"ל עם 9 מ"ל RPMI ללא סרום מיד לפני השימוש.