מאמר שיטה

הדמיה וידאו ומפות Spatiotemporal לנתח תנועתיות מערכת העיכול של עכברים

14.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53828

⸱

3 בפברואר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, The University of Melbourne, 2Melbourne School of Engineering, The University of Melbourne, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר טכניקת הדמיית וידאו ומיפוי מרחבי-זמני ברזולוציה גבוהה לזיהוי שינויים בוויסות העצבי של תנועתיות המעי הגס בעכברים בוגרים. ניתן לזהות השפעות עדינות על תפקוד מערכת העיכול באמצעות גישה זו בתכשירי רקמות מבודדים כדי לקדם את ההבנה שלנו לגבי מחלות מערכת העיכול.

תקציר

מערכת העצבים enteric (ENS) ממלא תפקיד חשוב בוויסות של מערכת העיכול (GI) תנועתיות יכול לתפקד באופן עצמאי של מערכת העצבים המרכזית. שינויים בתפקוד ENS הם הגורם העיקרי של תסמינים במערכת העיכול ומחלות ועשויים לתרום סימפטומים במערכת העיכול דיווחה בהפרעות נוירופסיכיאטריות כולל אוטיזם. היא מבוססת היטב כי חלקי מעי גס מבודד ליצור התכווצויות ספונטניות, קצבית המכונה גס נודד Motor מכלולים (CMMCs). הליך לנתח את התקנה העצבית המעיים של CMMCs ב לשעבר הכנות vivo של מעי גס עכבר מתוארות. המעי הגס הוא גזור מן החיה והדיח להסיר תוכן צואתי בטרם cannulated באמבט איברים. הנתונים נרכשו באמצעות מצלמת וידאו מוצבת מעל באמבטית האיברים ועל מרת מפות spatiotemporal ברזולוציה גבוהה באמצעות חבילת תוכנה ללא צורך במיקור חוץ. באמצעות טכניקה זו, דפוסי התכווצות בסיס ואפקטים תרופתיים על תפקוד ENS במעי גס שלegments ניתן להשוות מעל 3-4 שעות. בנוסף, אורך התפשטות ומהירות CMMCs ניתן להקליט כמו גם משינויים בשיעורי קוטר הבטן ותדירות התכווצות. טכניקה זו שימושית לאפיון דפוסי תנועתיות מערכת העיכול במודלים עכבר מהונדס (וגם מינים אחרים כולל חולדות שרקן). בדרך זו, הנגרמת פרמקולוגית שינויים CMMCs נרשמים בעכברי סוג ברים במודל עכבר R451C Neuroligin-3 של אוטיזם. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושם על אזורים אחרים של מערכת העיכול כולל התריסריון, מְעִי צָם ואת מעי ובגילאים התפתחותיים שונים בעכברים.

מבוא

מערכת העצבים enteric (ENS) היא הרשת העצבית הפנימי של מערכת העיכול ומווסת פונקציות שונות כגון עיכול של תוכן המעי, ספיגת המזון בגוף ואת הפרשת ספיגה חוזרת של נוזלים. נוירונים של ENS ממוקמים plexuses myenteric ו submucosal. מקלעת myenteric משחק תפקיד מרכזי בוויסות תנועתיות מערכת העיכול 1 ואילו מקלעת Submucosal מטפל בעיקר בבקרה של הפרשת 2,3. מקלעת myenteric ממוקמת בין שכבות שריר אורך וחוזר של קיר העיכול. הפעילות התכווצות של שכבות שריר חלק של לדופן המעי הופך לפשוט יותר את הפונקציות העיקריות של מערכת העיכול על ידי ערבוב הדוחף תוכן המעי לאורך המעי 3. למרות ההיצע העצב החיצוני אל מערכת העיכול מן CNS תורם לתפקוד עיכול in vivo, את ENS מסוגל ויסות תפקוד מערכת העיכול באופן עצמאי. מאפיין ייחודי זה מאפשר חקירה תפקודית של מעגלים עצביים מעיים ותרומתם תנועתיות מערכת העיכול vivo לשעבר.

גס נודדים מתחמי מנוע (CMMCs) הם ספונטניים, אירועים נוירוגנית כי הם דפוס מנוע השולט שנצפה מעי גס עכבר מבודד בהעדר כדורי הצואה 4-9. CMMCs מוגדרים התכווצויות קצובות כי להפיץ לאורך המרחק האופקי הוא לפחות מחצית האורך הכולל של המעי הגס (כלומר, מן cecum אל פי הטבעת) 10. הקשר בין CMMCs ואת דפוסי ההתכווצות שמניעי כדורי צואה הוא עדיין לא נקבע בבירור, עם זאת כמה הבדלים תרופתיים דווחו 11. עם זאת, היכולת של ENS לתפקד באופן עצמאי של מערכת עצבים מרכזיים ואת קיומם של דפוסי מנוע בתיווך עצבי כלומרהמעי הגס olated מספק מערכת assay אידיאלי לבחון הפרעות תנועתיות כתוצאה מחוסר תפקוד ENS הבסיסית. הספונטניות של דפוסי מנוע עיכול מאפשרת שינויים תפקודיים בתגובה לגירויים תרופתית להיבדק.

השימוש הדמיה וידאו ומיפוי spatiotemporal פותחה לראשונה לבחון הפריסטלטיקה של המעי הדק כמותית שרקנים 12. הנה, טכניקת vivo לשעבר מתוארת המאפשרת חקר דפוסי תנועתיות עכבר גסים באמצעות הדמיה וידאו וניתוח של הקלטות אלה לבנות ברזולוציה גבוהה (~ 100 מיקרומטר, 33 msec) מפות של בקוטר גס כפונקציה של מיקום לאורך המעי הגס ושל זמן (מפות spatiotemporal). שימוש ללא צורך במיקור חוץ בתוכנת איתור קצה (Analyse2; על פי דרישה), נתונים מתחומי הגס באורך מלא קבלנות בזמן אמת מעובדים ליצור מפות spatiotemporal עבור כל ניסוי. בשלב זה, וידאו (AVI) הקבצים הם ייתרוrized ועל המרה מפות spatiotemporal באמצעות Analyse2. מפות Spatiotemporal (איור 2) מתארים התכווצות לאורך זמן ולאפשר מדידת פרמטרים מרובים כולל מהירות התפשטות, גודל, אורך ומשך. קוטר גוט נרשם גם לאורך כל תקופת הניסוי כאמצעי של ההתכווצות הכוללת של מגזר הרקמות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לזהות הבדלי נקודת חניכה של מתחמי התכווצות מה שיכול להעיד קישוריות עצבית מעיים שונה.

פרוטוקול הדמיה וידאו דומה שנועד להעריך הנעה גלולה ב שרקנים דווחה 13 אולם כאן נתאר את יישום הגישה הדמיה וידאו כימות של תנועתיות המעי הגס ספונטנית (כלומר, בהעדר כדורי). כמו כן אנו מספקים מידע מפורט כדי לסייע לנתיחה והכנת רקמות gastrointestinal עבור הגישה הדמיה וידאו. זֶהפרוטוקול מספק לחוקרים עם כלי נגיש לשכפל בקלות לניתוח שליטה עצבית מעיים של פונקצית עיכול במודלים של בעלי חיים של מחלה כולל מודלי עכבר גנטי.

טכניקת דימות וידאו מאפשרת ניתוח של תנועתיות המעי הגס בתגובה סוכני תרופתי שונים. סמים יכולים להיות מנוהלים באמצעות לומן המעי או באמבטית האיברים החיצוני להכנה הגסה. באזורים שונים של מערכת העיכול העכבר מפגינים דפוסי תנועתיות ספציפיות כגון פילוח של המעי הדק CMMCs במעי הגס.

טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לזהות הבדלי זן בתפקוד המעי דק; רגישות ההפרש ל 5-HT 3 ו 5-HT 4 אנטגוניסטים נצפו מְעִי צָם של Balb / c ועכברים C57 / BL6 בשל אופי צורות של הגן tph2 מתבטא 6 שני זנים. השפעת עיכוב 5-HT על תנועתיות נשאר conשנוי במחלוקת, כפי דווחו נתונים סותרים על החשיבות של 5-HT אנדוגני על הפריסטלטיקה במעי גס, CMMCs 14,15. שינויים טרום תנועתיות לאחר הלידה במהלך הפיתוח 7, ואת ההשפעות של מוטציות גנטיות על תנועתיות הקיבה והמעיים במודלים של בעלי חיים של מחלת 10 יכול גם להיבדק על ידי ניצול הדמיה וידאו. כאן אנו מדגימים שימוש בשיטת לצורכי מחקר על תנועתיות המעי הגס במודל של אוטיזם העכבר R451C NL3, המבטאת מוטציה missense בגן Nlgn3 המקודד את החלבון הידבקות הסינפטי Neuroligin-3 16. המוטציה זו זוהתה לראשונה בחולים שאובחנו עם הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD) 17, אשר מזוהה מאוד עם תפקוד לקוי GI 18-22. חקרנו אם סינפטיים מוטצית R451C NL3 משפיעה פלט עצבי ENS באמצעות טכניקת דימות וידאו. אנו מציגים נתונים מאפיינים CMMCs בתחילת מחקר בתגובת 5H serotonergicT 3/4 קולטן אנטגוניסט tropisetron במודל של אוטיזם העכבר R451C NL3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

טיפול בבעלי חיים נקע בצוואר הרחם של חיות לפני כל הניסויים בוצעו אך ורק על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת מלבורן (אתיקה ID: 1,212,494.7)

רקמות 1. איסוף Dissection

  1. להרדים עכברים בוגרים על ידי נקע בצוואר הרחם. אם אפשר להימנע הרדמה כדי למנוע השפעות על תפקוד המעיים באמצעות קולטני ממוקם על אוכלוסיות נוירונים של עניין.
  2. רשום את משקל הגוף הכולל של בעלי חיים, להצמיד את הגוף (דרך ארבע רגליים, בצד הגחון חשוף הנסיין) בתוקף קרש החיתוך באמצעות מחטים תת עורי (גודל: 20 G).
  3. בעזרת מלקחיים ומספריים לנתח; עושים חתך דרך האפידרמיס שכיסה את שכבות שרירי הבטן התחתונה. המשך להשתמש במלקחיים ומספריים כדי לפתוח את חלל הבטן לאורך קו האמצע של הבטן אל החזה.
  4. כדי למנוע את Dehydrating רקמות, יוצקים physiתמיסת מלח ological (קרבס: 118 NaCl, 4.6 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.2 MgSO 4, 1 לאא 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D- גלוקוז מ"מ - מבעבע ב RT בגז carbogen; 95% O 2 ו -5 CO% 2 למשך תקופה מינימלית של 20 דקות) על תכולת הבטן במרווחי זמן קבועים (כלומר, כל 30-60 שניות) בתהליך לנתיחה.
  5. כדי לבודד את המעי הגס בעוד מחובר cecum והרקטום, החזק את cecum (הנמצא בצמוד לבית הקצה הפרוקסימלי של המעי הגס) באמצעות מלקחיים לנתח בעדינות כ 4-5 ס"מ מעל הגוף של החיה תוך זמירה לפדר באמצעות מספריים לנתיחה קנס.
  6. תשמרי על עצמך לא לטפל, למתוח או לחתוך את רקמת העיכול תוך הסרת לפדר הסמוך.
  7. סרה של רקמה עודפת (כלומר, שלפוחית ​​שתן ובאשכי שתן). בעזרת מספריים לנתח גס, לעשות שני חתכים אנכיים (כלומר, כ -0.5 ס"מ קו האמצע) לחתוך את עצם האגן על eaצד ch של מעי גס.
  8. השתמש במספריים בסדר להפריד את הטבעת מן סמוך רקמות אגן לקצץ סביב שריר מהמעי.
  9. מניחים את המעי הגס באורך מלא (מ cecum ועד פי הטבעת) לתוך מבחנה המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית (מחומצן בעבר עם carbogen) ולהמשיך חמצן ב RT. הסר את המעי האטום והרקטום באמצעות מספריים בסדר לנתח ולהחליף בכוס.
  10. כדורי צואת רוקן / תוכן מעי מפני הכנות גסות על ידי הפעלת לחץ חיובי עדין בסוף הפה באמצעות מזרק 5 מיליליטר מצורף קצה פיפטה 200 μl מלא תמיסת מלח פיזיולוגית. על מנת להתמצא הרקמה בעתיד, השתמש סיכת חרק לציון הקצה הפרוקסימלי ביותר של מעי גס, שם פסים ברירית גלויים.
    1. שנה את קצה פיפטה פלסטיק כדי להתאים את מזרק 5 מ"ל על ידי הסרת כ 1 ס"מ של סוף רחב / הפרוקסימלי באמצעות סכין גילוח. כדי להגביר את קצב הזרימה, להרחיב את הקצה הדיסטלי / קטן יותר על ידי חיתוך על אנגle (כ -45 ° C) באמצעות סכין גילוח.
  11. גריפ רקמת המעי הגס בעדינות בקצה הפרוקסימלי שלה עם מלקחיים לנתח, הכנס את קצה פיפטה לתוך לומן של המעי גס מלח הפיזיולוגי סומק דרך לומן.

2. הכנת רקמות גסות הניסויי Set Up הדמית וידאו

  1. תמיסת מלח פיזיולוגית Flush דרך כל צינורות המחוברים אמבטיה איבר שני תאיים להגדיר (איור 1 ואיור 3), באמצעות מזרק מצורף קצה פיפטה 200 μl. צעד זה מסיר את כל פסולת בתוך הצינורות שיכולים לחסום את זרימת הפתרון. עבור צינורות מפרטים עיינו בטבלת החומרים.
  2. ודא כי לשכות באמבטיה איברים superfused ברציפות עם תמיסת מלח פיזיולוגית מבעבע עם carbogen (95% O 2, 5% CO 2, קצב הזרימה של 5 מ"ל דקות -1). באמצעות בדיקת טמפרטורה במרווחי זמן קבוע, להבטיח כי לטמפרטורותיור של האמבטיה נשמר בין 33 ° C -37 ° C.
  3. מלאו את מיכל יבוא מחובר דרך שסתום 3-הדרך אל צינור היניקה עם כ 20-30 מ"ל תמיסת מלח פיזיולוגית באמצעות מזרק 50 מ"ל.
  4. במהלך הניסוי, לשמור על לחץ במאגר יבוא באמצעות arubber פקק עם צינורית זכוכית (5 מ"מ קוטר פנימי) מוכנס דרך שבמרכזה. ודא כי הפתח העליון של מאגר היבוא הוא אטום לחלוטין (עם שפופרת הזכוכית הפנימית נותרים חתומים).
  5. מניחים את המעי הגס (ס"מ אורך 5-7) לתוך תא אמבטיה איבר, כדי לוודא שהוא שקוע לחלוטין תמיסת מלח פיזיולוגית.
  6. Cannulate בכל קצה של מגזר הגס לשני צינורות הכניסה / יציאה השקועה (כניסה / צינורות יציאה של הקוטר שונה ניתן לשנות בהתאם לגודל של לומן הרקמה למשל. רקמות לאחר לידה, עכברים בוגרים שרקנו) בתקן האמבטיה באמצעות חוט תפירה מכותנה. חבר את הקצה הפרוקסימלי של המעי הגס אל צינור היניקה ואתהקצה הדיסטלי של המעי הגס אל הצינור לשקע (מחובר דרך שסתום 3-דרך צינור יצוא אנכי; 6 ס"מ גובה). ודא כי הרקמה אינה overstretched או רגוע מדי לאחר cannulation כדי למנוע הפרעה עם מדידות בעתיד וניתוח.
  7. רשום את אורך המעי הגס על ידי מדידת המרחק בין הפרוקסימלית ומ cannulations דיסטלי באמצעות סרגל 15 ס"מ. זה חשוב לפרש שינויים באורך התכווצות, מהירות התפשטות ונקודות ייזום התכווצות.
  8. ודא לחץ luminal בסיס יציב (סנטימטר H 2 O) היא הוקמה לפני תחילת הניסוי. חישוב לחץ luminal על ידי מדידת המרחק האנכית מהרקמה במניסקוס מלח פיזיולוגית בתוך השפופרת הזכוכית של מאגר יבוא (אוראלי) ואת צינור היצוא האנכי (האנאלי).
  9. לשמור על הכנות רקמות בלחץ intraluminal קבוע (למשל, 1-2 סנטימטר H 2 O) על ידי הבטחה כי pressu חותם פקק יבואמחדש נשמרת קבועה וכי אין חסימות נמצאות ההגדרה.
  10. השאר את המעי הגס לאזן מלח פיסיולוגי למשך 30 דקות לפני הקלטת תנועות מעיים. בדוק אם קיימות חסימות הנובעות ממהלך צינורות ב-או יצוא ולהסיר אותם על ידי הפעלת לחץ באמצעות המאגר לכניסה או על ידי מחדש cannulating הקצוות אוראלי אנאלי של המעי הגס.

3. לכידת תמונה פרוטוקול הניסוי

  1. תנועות מעי שיא כמו קבצי וידאו באמצעות מצלמת וידאו (30 מסגרות / שני, 640 x 840 פיקסלים) ממוקמים 10-15 סנטימטר מעל אמבט האיבר הפנימי על גבה מעבדה סטנדרטי לעמוד (איור 1).
  2. פתח דאב וירטואלי (תוכנה ללכידת וידאו) מהסמל בשולחן העבודה. בכרטיסייה 'קובץ', בחר 'לכידת AVI' כדי להציג את תמונת המצלמה. על בטל הכרטיסייה 'אודיו' 'לאפשר לכידת אודיו' להשבית קול.
    1. בלשונית וידאו ובחר 'דחיסה' ו 'DivX6.9.2. Codec & #39; לדחוס קבצי וידאו כדי לצמצם את השימוש של שטח אחסון. פונקציה זו תהפוך לזמינה על ההתקנה של תוכנת הדחיסה 'DivX'.
  3. באופן ידני את מיקום המצלמה כך במגזר המעי הגס cannulated כולו גלוי (עם אזורים cannulated הסמוך ביותר הקצוות האנכיים של המסגרת וידאו) דרך החלון לכידת וידאו תוכנה (ראה איור 1). על מנת לשפר את איכות התמונה ואת למזער השתקפויות, לצרף מגן נייר / קרטון אל ובמצלמות לחסום אור זרים על באמבטיה איברים. וידאו שפר את האיכות על ידי התאמת הבהירות, ניגודיות והגדרות חשיפה באמצעות ממשק תוכנת המצלמה.
    1. לפני ההקלטה, להגדיר שם קובץ ספציפי; בכרטיסייה 'קובץ', בחר 'קובץ ללכוד גדר' ולציין שם ייחודי עבור הווידאו.
    2. בגין לכידת וידאו על ידי לחיצה על 'קובץ לכיד' מסרגל כלי 'הלכיד'. כדי להפסיק recordinז בחר בלחצן 'עצור ללכוד' או על מקש Esc 'במקלדת.
  4. החזר את תמיסת מלח פיזיולוגית בתוך המאגר יבוא עם תמיסת מלח פיזיולוגית טריים מדי 30 דקות.
    1. לחץ luminal השיא (ראה 2.9) ושימוש בדיקת טמפרטורה, לרשום את הטמפרטורה באמבטית איברים. חזור על שלבים אלה לאורך הניסוי (כלומר, כל 30 דקות) על מנת להבטיח כי משתנים אלו הם קבועים.
  5. פעילות גסת שיא בסך הכל 3 שעות (כולל יישום תרופה בגוף וזמן שהות כשלון). לצורך אחסון נתונים, נתוני שיא קטעי וידאו 15 דקות. ניסוי מלא בדרך כלל יהיה מורכב 12 x קלטות 15 דקות וידאו.
    1. שיא הפעילות עבור שעה 1 בתנאים מבוקרים (תמיסת מלח פיזיולוגית).
    2. החלת את התרופה (או superfused לאמבטיה או מנוהל לתוך לומן באמצעות מאגר היבוא) למשך 30 דקות עד 1 שעה.
      הערה: מסלולים שונים של ממשל יכול yIELD אפקטים שונים 23.
    3. החל מלח פיזיולוגיים טריים לאמבטיה או לומן במהלך תקופת המתנה של שעה 1.

4. עיבוד נתונים הדור של מפות Spatiotemporal

  1. תהליך זה מחובר הקלטת וידאו באמצעות in-house תוכנה שנכתבה ב MATLAB (R2012a, גרסה 7.4; על פי דרישה) על מנת ליצור מפות spatiotemporal הממחישות תנועתיות המעי הגס.
    1. תוכנת ניתוח להרחיב מהסמל בשולחן העבודה.
    2. בחלון הפקוד, הזן "Analyse2" כדי לפתוח את לוח בקרת ניתוח.
  2. לנצל את פונקציית זיהוי קצה ליצור מפות spatiotemporal ידי לחיצה על "גילוי קצה עבור קבצי AVI" בחלון לוח הבקרה. פונקציה זו תאפשר תוכנת הניתוח לקרוא את קטעי וידאו recoded ב אודיו וידאו משולב (AVI) לפורמט.
  3. לבצע את הפעולות הבאות ברצף כדי ליצור מפות spatiotemporal באמצעות עדהאלגוריתם גילוי קצה ptive.
    1. קבצי וידאו להרחיב שרשמו בחירה "הוסף קבצים" כרטיסייה, בחר 'פתח את סרטון' ובחר את המיקום של קבצי וידאו.
    2. מתוך קבצי וידאו מופיע בתוך תוכנת ניתוח, בחר את הקובץ של עניין.
    3. בחר אזור מלבני של עניין בתוך מסגרת של וידאו, למשל, את כל אורכו של המעי הגס, מהנקודה שבה המעי cannulated דרך הפה אל cannulation אנאלי. ודא נקודות cannulation הפרוקסימלית ומ דיסטלי הסמוכות לגבולות האנכיים של האזור של העניין. קווי גילוי קצה (אדום וירוק) יופיעו באופן אוטומטי על גבי התמונה בזמן האמת.
    4. ודא כי קווי סף גילוי הקצה נושקים מייד אל המעי גס הוא על הגבולות העליונים והתחתונים של רקמת המעי הגס (זה יכול להיות מותאם עבור כל סרטון וידאו על ידי שינוי ערכי סף איתור בלוח בקרה). ודא l גילוי הקצהאינס הם רציפה לאורך התמונה המעי הגס על ידי התאמת הניגודיות והבהירות באמצעות לוח הבקרה.
    5. הזן את אורכו של המעי הגס (מ"מ) לתוך תיבת הדו-שיח רוחב (כפי שנרשם בשלב 2.7). לאחר מכן בחר "צור מפת חום".
    6. בחלון pop up, בחר מיקום עבור קובץ יישמר לציין שם קובץ עבור מפת spatiotemporal.
    7. בחר את תבנית ".su2 'ובחר' הוסף לתור '.
      הערה: תבנית .su2 דוחס נתונים על גודל קובץ קטן מספר קבצי וידאו ניתן להוסיף לתור.
    8. בחירה 'בגין גילוי' כדי ליצור מפות spatiotemporal.

5. ניתוח של מפות Spatiotemporal

  1. לנצל מפות spatiotemporal להעריך פרמטרים כגון תדירות, מהירות התפשטות, אורך ומשך CMMCs, קוטר הבטן ונקודת חניכה לכיוון הצירים.
    1. כדי להתחיל לנתח spatiotemporalמפות, סוג 'analyse2' בחלון הפקודה כמתואר בסעיף הקודם. במקום "Edge זיהוי", בחר את "ניתוח מפת חום" כפתור.
    2. קבצי המפה spatiotemporal פתוחים (קבצי .su2) על ידי בחירת הכרטיסייה 'הוסף קבצים' וציון המיקום של קבצים בעבר השיג .su2.
    3. לאחר מפת spatiotemporal גלויה על מסך, ציין טווח צבעים בלוח בקרה, כדי להבטיח את המינימום נקבע ל -1.
      ראוי לציין, כי לכל היותר יכולים לנוע בין 5-10 על פי ההתכווצות של רקמה.
    4. בחר 'צבע נעל טווח' כדי להבטיח את כל המפות מניסוי יחיד מנותחים באותם תנאים.
    5. ודא שהגדרות מסגרת זמן קבוע לכל מפות spatiotemporal מניסוי נתון.
  2. על מנת לקבוע תדירות CMMC, באופן ידני לספור התכווצויות חוצות יותר מ -50% מאורך של המעי גס. התכווצויות אלה יכולים להיות visualized כמו פסים אדומים / כתום (מדד הצבע HSV סטנדרטי) על המפה spatiotemporal (ראה איור 2 למשל). התכווצויות אחרות כי הם קצרים או לא להפיץ יכולות גם להיות מזוהות לכימות.
  3. אם תרצה, לבצע ניתוח נוסף ברזולוציה גבוהה יותר ממפות אלה. לדוגמא, תכונות מפורטות הכוללות את המהירות ואת משך הזמן של כל התכווצות יכולות להיבחן.
    1. על מנת למדוד את המהירות ואת משך הזמן, בחר בלחצן "סמן גלי התכווצות" בלוח הבקרה ניתוח מפת החום.
    2. לאחר מכן, להתקרב לכל CMMC ידי לחיצה על כפתור "זום" ובחירת שטח של עניין. לאחר מכן בחר בלחצן "ידני ויסמן" כדי להוסיף הערות לכל התכווצות באמצעות עכבר לצייר קו מהעמדה הראשונית ביותר עד הסוף של כל ציר. שיטה זו יכולה לשמש כדי למדוד את מהירות התפשטות לכאורה ומשך dilations שנראים להפיץ (עבור למשל, רואהסוף מפות אל באיור 2A, 2B).
      ההערה: נתונים עבור מהירות ומשך תופיע מתחת לחלון התוצאות. ערכים אלה ניתן להעביר גיליון אלקטרוני של הריבית על ידי בחירת הכרטיסייה "נתוני היצוא". הסברים לא רצויים ניתן להסיר על ידי הלחיצה על "ביאורים נבחרים סר" הכפתור.
  4. אם תרצה, לנצל את x ו- y של מפות spatiotemporal (שעה ומיקום לאורך המעי הגס, בהתאמה) כדי לקבוע את המיקום של חניכה של התכווצויות קטנות או CMMCs.
  5. באופן דומה, על מנת לקבוע את המרווחים בין הצירים, השתמש בפונקציה "ההערה" כדי למדוד את משך הזמן בין הצירים. כמו בעבר, ניתן לייצא את התוצאות הללו לגיליון אלקטרוני על ידי בחירה בכרטיסייה "נתוני היצוא".
  6. על מנת למדוד את רוחב הבטן נח, בחר את "חתך קח" כפתור בלוח ניתוח מפת חום.
    1. בחר 'הוסף9; בלוח חתכים הזמני. לחצו פעמים בכל מקום בתוך המפה כדי ליצור קו אופקי על גבי המפה החומה. נתונים בקוטר גוט יוצגו כעת בחלון חדש.
    2. כדי למדוד קוטר בטן, למקם את הסמן על שיא שוקת סמוך להשיג רוחב בטן ממוצע עבור תנאי ניסוי ספציפיים. שינויים בקוטר הבטן ניתן להשוות בין תנאי הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עד 90% מהחולים עם ASD לחוות מערך של הפרעות במערכת העיכול, כולל שלשול ועצירות 18,24,25. עם זאת, הגורמים הבסיסיים של בעיות במערכת עיכול אלה אינם ידועים. מוטציות רבות זיהו בחולים עם ASD משויכים תורמים חלבונים סינפטיים לשינויים והפרעות בשידור סינפטי או פונקציה. אחת מוטציה זו, של הגן המקודד את הידבקות התא neuroligin-3 המולקולה (R451C NL3), זוהתה שני אחים עם 17 ASD. תוצאות המוטציה זו ב שאריות ארגינין במיקום 451 של חלבון Neurol...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

באמצעות טכניקה הדמיה בסרטון הזה, תדירות CMMC נמדדה כאינדיקציה תנועתיות במעי הגס בקרב סוג בר עכברים R451C NL3, במודל של עכברים של הפרעת ספקטרום האוטיזם 17. התוצאות שלנו מצביעים על ירידה במספר CMMCs בעכברים מוטציה NL3 R451C בהשוואה לעכברים סוג בר בנוכחות של אנטגוניסט לרצפטור 5HT 3/4 Tropisetron טוען כי עכברים NL3 R451C להפגין רגישות מוגברת Tropisetron. בהתאם לכך, אנו מציעים כי המוטציה R451C neuroligin-3 משנה את מסלול הסרוטונין, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף

תודות

JCB ו ELH-Y נתמכו תוכנית משרד ההגנה האמריקאי CDMRP אוטיזם מחקר (AR11034). NHMRC (1047674) כדי ELH-Y.The במאי סטיוארט הגזברות-אוניברסיטת אמון מלבורן במימון מלגה MS. אנו מודים עלי טאהר, פטימה Ramalhosa ו גרציה סיגר לתרומות טכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
NaCl (MW: 58.44)Sigma-AldrichS7653-250G
KCl (MW: 74.55)Sigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01)Chem Supply471-500G
MgSO4 .7H20 (MW: 246.48)Chem SupplyMA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02)Chem SupplyCA033
D-Glucose נטול מים (MW: 180.16)Chem SupplyGA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01)Chem SupplyGA018-500G
Name<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>חומרים
אמבט איברים דו-תאיים
ממדים: 14 ס"מ x 8 ס"מ x 3 ס"מ		בהתאמה אישיתמעבדת קשר ישירות 
  732 איטום רב תכליתי שקוףDow Corning Australia Pty Ltd1890573
SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקון Dow Corning Australia Pty Ltd1064291
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK STerumo Medical Corporation0912-2006
מזרקים עם קצות Luer Lock 50 מ"ל, 20 מ"ל, 10 מ"לTerumo Medical CorporationN/A
1.57 מ"מ (ID) x 3.16 מ"מ (OD) - צינורות סילסטייםMasterflex508-008
1.02 מ"מ (ID) x 2.16 מ"מ (OD) - צינורות סילסטייםMasterflex508-005
1.50 מ"מ (ID) x 2.50 מ"מ (OD) - צינורות סילסטייםMasterflex508-007
1.60 מ"מ (ID) - צינורות סיליקון מרפאים פלטינה Masterflex96410 - 14
4.40 מ"מ (ID) - צינורות סיליקון מרפאים פלטינום מאסטרפלקס96410 - 15 
3.10 מ"מ (ID) - צינורות סיליקון מרפאים פלטינום Masterflex96410 -16
בקבוקי זכוכית מעבדה מדורגים - 500 מ"ל         תרמופישר סיינטיפיק כימי 100-400
57 X 65 מ"מ 
פקק גומי כימי 29 מ"מ X 32 מ"מ
מחמם מים  (ווסת תרמו) ראטק TH7000 
Logitech מצלמת רשת LogitechLogitech
NameCompanyCatalog NumberComments
strong>Software
Virtual Dub - 1.9 11virtualdub.org
MATLAB R2012a לוח
תוכנת מצלמת אינטרנט של LogitechLogitech
פקק גומי גרף

מקורות

  1. Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
  2. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
  3. Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
  4. Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
  5. Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
  6. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
  7. Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
  8. Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
  9. Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
  10. Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
  11. Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
  12. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  13. Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
  14. Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233(2015).
  15. Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
  16. Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
  17. Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
  18. Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
  19. Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
  20. Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224(2012).
  21. McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
  22. Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
  23. Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
  24. Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
  25. Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
  26. Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
  27. Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
  28. Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
  29. Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205(2013).
  30. Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
  31. Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
  32. Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
  33. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597(2011).
  34. Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
  35. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
  36. Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326(2014).
  37. Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ComplexeTropisetronNeuroligin 3 R451C

מאמרים קשורים