הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

15.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53846

⸱

25 במרץ 2016

 , 
1Immunity, Microenvironment, Virus, Cancer Research Center in Lyon

במאמר זה

סיכום

נויטרופילים הם הסוג הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים. בידוד הנויטרופילים מדם אנושי בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות והתמיינות של תאים פרומילוציטיים אנושיים (HL60) לאורך המסלול הגרנולוציטי מתוארים כאן; לבחון את תפקידם ברגישות של תאי לימפומה לחומרים אנטי-לימפומה.

תקציר

נויטרופילים הם הסוג הנפוץ ביותר (40% עד 75%) של תאי דם לבנים ובין התאים הדלקתיים הראשונים שנודדים לעבר אתר הדלקת. הם שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת וממלאים תפקידים מרכזיים בביולוגיה של הסרטן. נויטרופילים הוצעו כמתווכים מרכזיים של טרנספורמציה ממאירה, התקדמות הגידול, אנגיוגנזה ובאפנון החסינות האנטי-גידולית; באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים או האינטראקציה שלהם עם תאי הגידול. כדי לאפיין את הפונקציות הספציפיות של נויטרופילים, נחשקת שיטה מהירה ואמינה לבידוד חוץ גופי של נויטרופילים מדם אנושי. כאן, מודגמת שיטת הפרדת שיפוע צפיפות לבידוד נויטרופילים כמו גם תאים חד-גרעיניים מהדם. ההליך מורכב משכבות של תמיסת שיפוע הצפיפות כגון פיקול בזהירות מעל הדם המדולל המתקבל מחולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), ואחריו צנטריפוגה, בידוד שכבה חד-גרעינית, הפרדת נויטרופילים מ-RBCsby דקסטרן ואז ליזה של אריתרוציטים שיוריים. שיטה זו הוכחה כמבודדת נויטרופילים ≥-90% טהורים. כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול, בוצעו ניסויים תלת מימדיים (תלת מימדיים) באמצעות מטריצת ממברנת הבסיס כגון Matrigel. בהתחשב במחצית החיים הקצרה של נויטרופילים במבחנה, לא ניתן לבצע ניסויים תלת-ממדיים עם נויטרופילים אנושיים טריים. מסיבה זו תאי HL60 פרומילוציטיים מובחנים לאורך המסלול הגרנולוציטי באמצעות משפרי ההתמיינות דימתיל סולפוקסיד (DMSO) וחומצה רטינואית (RA). מטרת הניסויים שלנו היא לחקור את תפקידם של נויטרופילים על הרגישות של תאי לימפומה לחומרים אנטי-לימפומה. עם זאת, ניתן להכליל שיטות אלה כדי לחקור את האינטראקציות של נויטרופילים או תאים דמויי נויטרופילים עם מגוון גדול של סוגי תאים במצבים שונים.

מבוא

תאים חיסוניים מולדים מהווים שיעור מהותי של תאים במיקרו-סביבה של הגידול קושרו עם ממאירות הגידול בחולים ומודלים של בעלי חיים של סרטן 1. לאחרונה, זה הפך להיות יותר מוערך נרחב שתגובות חיסוניות כרוניות תפקיד קריטי בקידום התקדמות גידול, גרורות והתנגדות לכימותרפיה 2. המקרופאגים חשובים תאים חיסוניים מולדים אשר הוכחו להסדיר ישירות בתגובה תאים סרטניים לכימותרפיה 3,4. עם זאת, את התפקיד של נויטרופילים, שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת, בוויסות תגובת הגידול לטיפול נגד סרטן אינו ידוע. מטרות הפרוטוקולים הללו הן להשתמש בשיטה מהירה ואמינה להפריד נויטרופילים מדגימים הדם של מטופל CLL וכדי להבדיל תאי HL60 לאורך מסלול granulocytic כדי ללמוד את תפקידם בויסות הרגישות של תאי לימפומה לסוכנים נגד לימפומה.

= "jove_content"> נויטרופילים הם מרכיב הסלולר הנפוץ ביותר של מערכת החיסון המולדת בדם 5 ולפעול כקו ההגנה הראשון נגד פולשים מיקרואורגניזמים 6. יש נויטרופילים תפקיד חיוני עולה תגובות חיסון מולדות יעילות בנוסף לפונקציות מפעיל משתנות במצבים פתולוגיים מספר 7. לכן, שיטה מהירה ואמינה כדי לבודד נויטרופילים מתאי דם אחרים, כגון שיטת הפרדת שיפוע צפיפות, נדרשה לבדיקות במבחנה. באמצעות שיטה זו לבידוד נויטרופילים יקל על המשך מחקר פונקציות חיסוניות בתיווך נויטרופילים in vivo לשעבר vivo.

היכולת להשיג אוכלוסיות טהורות של נויטרופילים היא צעד ראשון חשוב לחקירת חולים עם מחלות אימונולוגיות 8. שיטת צפיפות הפרדת שיפוע היא טכניקה אידיאלית שבו תשואה גבוהה של תאים מתקבלת. methoד יהיה כרוך בתוספת פתרון שיפוע צפיפות בתחתית צינור המכיל דם אדם מדולל ואחריו צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 35 דקות ללא הפסקה. הטבעת של תאי mononuclear מופיעה על הממשק ואת נויטרופילים מתגוררים מתחת לשעבר. יש שיטה זו יתרונות משמעותיים ביחס משיטות אחרות כגון ערכות בידוד נויטרופילים שהן הרבה יותר 9 יקרים. בנוסף, בידוד נויטרופילים מדם אנושי על ידי ערכות מסחריות באמצעות נוגדנים המכוונים סמן משטח ספציפי עבור נויטרופילים אדם, להגביר את הסיכון של הפעלה או התמיינות תאים. שיטת ההפרדה צפיפות שיפוע מאפשר בידוד של נויטרופילים בתוך פרק זמן קצר. בתוך אותו שלב, תאים mononuclear גם מופרדים והחלים. זוהי טכניקה בסיסית שבה תשואה גבוהה של תאים טהורים מתקבלת על מנת להשיג שלמות תפקודית.

על מנת לחקות את הגידול microenvironment, ניסויי 3D בוצעו. בהינתן זמן מחצית החיים הקצר של נויטרופילים במבחנה, ניסויי 3D עם נויטרופילים אדם טריים אינם חד משמעיים. מסיבה זו, פרומיילוציטית (HL60) תאים מושרים להתמיין לתאי נויטרופילים דמוי באמצעות מעוררי הבידול sulfoxide דימתיל (DMSO) ו חומצה רטינואית (RA). שימוש בתאי HL60 בדיל (הבדל HL60) ימנע שיש תגובות שונות של נויטרופילים בשל בידוד מתורמים שונים.

ב 3D במבחנה מודלים תרבות מייצגים שלב ביניים בין מודלים 2D במבחנה במודלים vivo. בתרבות 2D, התאים להתפשט על פני פלסטיק ויוצרים מצורפים התא טבעי לחלבונים שהופקדו כי הם מפוגל על ​​משטח סינתטי זה. לעומת זאת, התאים מצורפים תאים תאים טבעי טופס תרבות 3D מאז התאים ואת תאי מטריקס הם לסנתז הם חומר טבעי אשר הם מחוברים.מסיבה זו, מודלי שיתוף תרבות 3D, במיוחד בין תאים סרטניים סוגי תאים אחרים, היו מאוד שימושיים המציין תרומתם צמיחת גידול, אנגיוגנזה, וגרורות. כתוצאה מכך, תרבויות 3D להפוך את תרבית תאים לחקות את התנאים הפיזיולוגיים הקיימים vivo 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בידוד נויטרופילים ושיתוף תרבות עם תאים leukemic ראשוניים

הערה: פרוצדורות נערכו בכפוף לאישור של ועדת האתיקה ליון החולים עם כל החולים חתימת הסכמה מדעת.

  1. בידוד של תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים
    1. אסוף צינורות דם היקפי על EDTA (1.8 מ"ג EDTA למיליליטר דם) מן החולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL).
    2. הוסף כל 15 מ"ל של דם אל צינור 50 מ"ל סטרילי לדלל עם 15 מ"ל RPMI (דילול 1: 1), אז בזהירות ולאט לאט להוסיף 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתחתית הצינור ללא ערבוב בשלבים. ודא כי פתרון שיפוע הצפיפות הוא ב RT לעריכה.
    3. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 35 דקות ב RT וללא בלמים. הדם צריך להפריד לארבעה שלבים ברורים כפי שמוצג באיור 1 א ', מלמעלה למטה: טסיות ופלסמה, תאים mononuclear (wהייט טבעת), פתרון שיפוע צפיפות, גרנולוציטים ו אריתרוציטים.
    4. אסוף את הטבעת לבן המייצג את התאים leukemic ראשוניים עם טפטפת פלסטיק פסטר והעברת צינור חדש 50 מ"ל.
      1. מלאו את הצינור עם PBS (מכיל סידן ומגנזיום) עד 50 מ"ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT.
      2. Resuspend גלולה עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להוסיף PBS עד 50 מ"ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT.
      3. Resuspend גלולה עם המדיום RPMI שלם (RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין) לספירת באמצעות הדלפק כדאיות התא.
    5. לשאוב את השלבים העליונים עוזב את השלב גרנולוציטים ו אריתרוציטים ולהוסיף PBS עד 25 מ"ל ולאחר מכן להוסיף dextran 3% ב 0.9% NaClup 50 מיליליטר בסך הכל. מערבבים את צינורות 10 פעמים ולשמור אותם במשך 30 דקות ב RT ללא ערבוב.
    6. אסוף את שכבת נויטרופילים RBC-עניים העליוןd ולהכניס אותם לתוך צינור נקי סטרילי 50 מ"ל ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. Resuspend כל גלולה עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להוסיף למאגר תמוגה התא אדום עד 50 מ"ל בסך הכל.
    7. שמור את הצינורות בחושך במשך 15 דקות ב RT אז צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS (להוסיף PBS עד 50 מיליליטר בסך הכל) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT.
    8. Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. שמור 3 x 10 5 של כל סוג תא ב 50 μl PBS-FBS (4%) צינורות פלסטיק 5 מ"ל כדי לקבוע את טוהר הבידוד שלהם באמצעות cytometry הזרימה.
  2. ניתוח ההופעות מורפולוגי של אוכלוסיות תאים המבודדות
    1. לשם כך, resuspend כל 3 x 10 4 נויטרופילים 3 x 10 4 תאים mononuclear ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי לאהוא צנטריפוגות מאוזן היטב.
    2. מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 750 XG במשך 10 דקות ב RT הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם.
    3. כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x.
  3. בדוק את הטוהר של תאים מבודדים על ידי FACS
    1. התווית תאי leukemic ראשוני המבודדים עם נוגדני CD19 אנטי אנושיים מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). לייבל נויטרופילים מטוהרים עם תערובת של נוגדנים אנטי אנושי המפורטים בטבלה 1 (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
    2. שוטפים את התאים עם 500 μl PBS-FBS (4%) בצנטריפוגה צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
    3. Resuspend כל גלולה ב 200 μl PBS-FBS (4%).
    4. לנתח על cytometer זרימה באמצעות התצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). ודא פיצוי הצבע.
  4. Coculture של תאים leukemic ראשוניים עם נויטרופילים עצמיים
    1. Seed 2 x 10 5 תאים / מ"ל של תאים leukemic ראשוניים לבד או עם נויטרופילים עצמיים בשעה 1:10 יחס במדיום RPMI להשלים. לשם כך, להתאים מספרים סלולריים על ידי המתלים תא דילול ולהוסיף 2 x 10 5 תאים / מ"ל של תאים leukemic ראשוניים עד 2 x 10 6 תאים / מ"ל נויטרופילים. מערבבים בזהירות.
    2. הוסף 25 מיקרומטר של טירוזין קינאז של ברוטון (BTK) מעכב (ibrutinib) אל התאים. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  5. קציר תא ניתוח FACS
    1. collect התאים צינורות פלסטיק 5 מ"ל לניתוח צנטריפוגות FACS צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשטוף את כדורי עם 1 מ"ל PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
    2. כדורי Resuspend ב Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית ו דגירת התאים בחושך במשך 10 דקות ב RT. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 2 א ו בתצורה האופטית הבאה: ליזר 488 ננומטר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). ודא פיצוי הצבע.

בידול 2. של תאים HL60 לאורך נתיב granulocytic ו Coculture שלהם עם תאים RL לימפומה B ב 3D דגם

  1. דיפרנציאציה של פרומיילוציטית האדם (HL60) תאים לתוך תאים נויטרופילים דמוי
    1. התאם מספר הסלולרי HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ"ל ולאחר מכן להוסיף 1 מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO להשרות התמיינות שלהם. כל זרע 3 x 10 5 תאי HL60 לכל היטב צלחת 48 היטב ואז דגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    2. מאוחר יותר, לאסוף את התאים צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא.
    3. ואז לדלל ההשעיה תא בינוני RPMI מלאה, ומשנה את מספר הנייד HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ"ל ולגרום שוב הבידול שלהם על ידי הוספת 1 ​​מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO. כל זרע 3 x 10 5 HL60 תאים לכל היטב צלחת 48-היטב דגירה במשך 48 אחר שעה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  2. ניתוח של בידול HL60 (הבדל HL60)
    1. אוספים את התאים צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלול עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא.
    2. כדי לנתח את השינויים בביטוי סמנים על פני קרום התא על ידי cytometry הזרימה. מניחים כל 3 x 10 5 תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 5 HL60 תאים diff צינורות פלסטיק 5 מ"ל לניתוח FACS ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
    3. Resuspend את הכדורים ב 50 μl PBS-FBS (4%). לייבל את התאים עם אנטי אנושי CD11b מצומדות כדי AF700 או CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
    4. לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend את הכדורים ב 200 μl PBS-FBS (4%).
    5. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגיה gating של איור 3A ואת התצורה האופטית הבאים: 488 ננומטר לייזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP); לייזר ננומטר 633: APC (660/20 BP), Alexa פלואוריד 700 (730/45 BP).
    6. כדי לבדוק את השינויים מורפולוגיים diff HL60, לשתק את התאים על גבי שקופיות זכוכית לבדיקה מיקרוסקופית.
      1. לשם כך, resuspend כל 3 x 10 4 תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 4 diff HL60 ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי צנטריפוגות מאוזן.
      2. מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 1500 סל"ד במשך 10 דקות ב RT. הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם.
      3. כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x.
  3. 3-ממדי (3D) תרבות
    הערה: ודא כי החומרים המשמשים בניסוי זה הם קרים הניסוי מתקיים על קרח.
    1. Resuspend כל 5 x 10 4 תאים RL, לבד או מעורבב עם הבדל HL60 ב יחס RL: diff HL60 1:10, עם 300 μl מטריצה ​​קרום המרתף באמצעות 1 מ"ל קצה פיפטה לחתוך עם מספריים סטרילי כדי להרחיב את הפתח לכ 2 עד 3 מ"מ. הימנע בועות במהלך שלב זה.
    2. כל זרע 300 μl של השעית תא / גם בצלחת 24 גם. הימנע בועות במהלך שלב זה. דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל להשלים בינוני RPMI לכל היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. שנה את בינונית כל יומיים. הוסף 10 ננומטר vincristine ביום 5.
  4. ניתוח FACS
    1. לאחר 7 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום ולשטוף היטב עם כל 1 מ"ל קר כקרח PBS פעמיים. הוסף 3 מ"ל / היטב קר כקרח PBS-EDTA (5 מ"מ). לנתק את ג'ל מתחתית הבאר על ידי גירוד באמצעות בתחתית 200 קצה פיפטה μl. לנער את הצלחת בעדינות על קרח למשך 30 דקות.
    2. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי ולנער את צינורות בעדינות על icדואר למשך 30 דקות אחרות. בדקו את המראה של השעית תא הומוגנית. (אם זה לא המקרה, אז לנער את התאים במשך זמן ארוך יותר או להוסיף עוד PBS-EDTA).
    3. בצנטריפוגה צינורות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS אז צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT.
    4. Resuspend עם PBS-FBS (4%) ו תווית עם נוגדנים CD19 אנטי אנושי מצומדות כדי PE-Cy7 ו נוגדן CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
    5. לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צינורות צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית.
    6. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 4 א ו בתצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP). ודא פיצוי הצבע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטת צפיפות ההפרדה שיפוע המתואר כאן מספק תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים unstimulated מבודדים מהדם של חולי CLL איור 1A מייצג את שכבות הדם השונות שהתקבלו לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות (מלמעלה למטה:. טסיות ופלסמה, טבעת לבן מייצג את התאים mononuclear, צפיפות שיפוע פתרון, גרנולוציטים ו אריתרוציטים). איור 1B ו 1C להראות את הבדלי ההופעות מורפולוגיים בין נויטרופילים (תאי גרעינים רבים-אונות) ותאי mononuclear בהתאמה.

<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המתוארת כאן, פרוטוקול יעיל, פשוט, מהיר וזול עבור הבידוד של נויטרופילים מדם אנושי עם טוהר גבוה שימוש בגישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות ובתוך אותם תאי mononuclear הצעד מופרדים גם וחלים. אוכלוסיות התאים הבודדות הן ≥90% טהורות.

שיטות קיימות מספר לבידוד נויטרופילים מדם אנושי. אלה כוללים שיטות דומות באמצעות 11,12 הדרגתיים רציף, או באמצעות ערכות מסחריות לבידוד נויטרופילים ידי בחירה חיסונית מגנטית חיובית במהלכו נוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן (INCa-DGOS-4664).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RPMI 1640 Gibco Invitrogen21875-034
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco Invitrogen10270-106
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS מכיל סידן ומגנזיום)Gibco Invitrogen14040-091
N-אצטיל-L-אלניל-L-גלוטמין (L-גלוטמין)טכנולוגיות חיים25030-024
פניצילין סטרפטומיצין (Pen Strep)טכנולוגיות חיים15140-122
מעכב טירוזין קינאז (Btk) של ברוטון (איברוטיניב) CliniSciencesA3001
Vincristine EG labo
BD מטריג'ל מטריצת ממברנת בסיס BD Biosciences354234לשים ב-4 oC למשך הלילה (O/N) לפני יום הניסוי
מאגר ליזה של תאים אדומים BD Biosciences555899
פיקול (פנקול)PAN ביוטקP04-60500
דקסטרן סיגמא-אולדריץ'D8906
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D8418
חומצה רטינואיתסיגמא-אולדריץ'R2625
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ'A7906
אתילנדיאמינטטראצטית חומצה (EDTA)סיגמא-אולדריץ'E5134
נתרן כלורי (NaCl)EuromedexS3014
סיפוח ערכת צביעה V-FLOUS רוש11  988  549  001
ערכת RAL 555 ערכת צביעה שונה GiemsaCosmos BiomedicalCB361550-0000
LSRII זרימה ציטומטריהBD Biosciences
ציטוצנטריפוגהתרמו סיינטיפיק
Leica DMR-XA מיקרוסקופLeica Microsystems
צלומטר אוטומטי T4 מונה כדאיות תאיםNexcelom  מדע ביולוגי

מקורות

  1. Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
  4. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
  6. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
  7. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
  8. Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
  9. Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
  10. Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
  11. Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
  12. Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
  13. Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606(2012).
  14. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
  15. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586(2013).
  16. Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
  17. Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
  18. Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
  19. Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
  20. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
  21. Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940(2014).
  22. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
  23. Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
  24. Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
  25. Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
  26. Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צנטריפוגציה במדרג צפיפותניתוח פלוו-ציטומטריהמודלים של שיתוף-תרבית בתלת-ממדדיפרנציאציה של HL60שקיעת דקסטראןליזיס של תאי דם אדומיםסממני CD15 CD16מטריצת Matrigel
בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.