Method Article

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתיאור לוקליזציה של קולטני אנגיוטנסין II מסוג 1 במוח החולדה על ידי אוטורדיוגרפיה כמותית, דנסיטומטרית, קולטן במבחנה באמצעות אנלוגי יוד-125 של אנגיוטנסין II.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר דפוסים מחייבים קולטן עבור אנגיוטנסין II (אנג II) במוח החולדה באמצעות radioligand ספציפי לקולטניים אנג השנייה לבצע מיפוי קולטן autoradiographic.

דגימות רקמות נקצרות ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. Cryostat משמש סעיף coronally הרקמה (המוח) הפשרת הר בסעיפים גבי שקופיות טעונות. סעיפי הרקמות רכובי השקופיות מודגרת 125 I-SI-אנג שני radiolabel קולטנים אנג השני. שקופיות סמוכות מופרדים לשתי קבוצות: "הלא ספציפיות מחייבים" (NSP) בנוכחות ריכוז להרוות הקולטן של הלא רדיואקטיבי אנג השנייה, או AT 1 תת סוג קולטן אנג השני (AT 1 R) אנטגוניסט לרצפטור אנג שני סלקטיבית , ו 'סה"כ מחייב "ללא AT אנטגוניסט R 1. ריכוז להרוות של תת-סוג קולטן AT 2 אנג השנייה (AT 2 R) אנטגוניסט (PD123319, 10 מיקרומטר) קיים גם incubatiעל חיץ להגביל 125 I-SI-אנג השנייה מחייב את תת סוג R AT 1. במהלך 30 דקות הדגירה טרום ב ~ 22 ° C, מגלשות NSP נחשפים 10 מיקרומטר PD123319 ו Losartan, כאשר בוחרים באפשרות 'סה"כ מחייב' שקופיות נחשפים 10 מיקרומטר PD123319. שקופיות מודגרת מכן עם 125 I-SI-אנג השנייה בנוכחות PD123319 עבור 'להסתכם מחייב', ו PD123319 ו Losartan עבור NSP חיץ assay, ואחריו כמה 'שוטף' חיץ, ומים כדי להסיר מלח אי כבול radioligand במיוחד. השקופיות הן יבשות באמצעות מכת מייבשים, אז נחשפו סרט autoradiography באמצעות סרט קלטת מיוחד. הסרט הוא פיתח את התמונות נסרקים לתוך המחשב עבור צפיפות ויזואלית וכמותית באמצעות מערכת הדמיה קנייני גיליון אלקטרוני. סט נוסף של שקופיות thionin מוכתם להשוואות היסטולוגית.

היתרון של שימוש autoradiography קולטן הוא היכולת לדמייןאנג השנייה קולטנים באתרו, בתוך קטע של דגימת רקמות, אנטומית לזהות את האזור של הרקמה על ידי השוואתה קטע התייחסות היסטולוגית סמוך.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות לב וכלי דם ממשיכה להיות הגורם המוביל למוות ונכות בארצות הברית, גרימה יותר מ -30% ממקרי המוות בארצות הברית בשנת 2011 1. הנתונים הסטטיסטיים העדכניים ביותר של איגוד הלב האמריקאי עולה כי יותר מאדם אחד מכל שלוש יש אחד או יותר סוג של מחלות לב וכלי דם. מחקר לב וכלי דם ממשיך לעשות צעדים נגד להבנת המחלה הזאת, אבל כמו דורות להתחיל מזדקן זה הכרחי כדי להמשיך במאמצים אלה. מערכת רנין-אנגיוטנסין (RAS) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות של מערכת הלב וכלי הדם בעיקר על ידי קידום טרשת עורקים, דלקת, vasoconstriction מערכתית, והפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית (איור 1) 2-8.

ראס הוא המערכת ההורמונלית, כי הוא מופעל כאשר תאים juxtaglomerular של הכליה להפריש רנין לתוך זרם הדם בתגובה וירידה בלחץ דם, גדל sympatגירוי hetic, או ירידה בזרימת נתרן ידי Densa המקולה. רנין חילוף החומרים angiotensinogen (מסונתז בכבד) כדי ליצור אנגיוטנסין I (אנג לי). אנג לי עובר מטבוליזם מכן על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין (ACE), גידול ectoenzyme בצד luminal של תאי האנדותל של כלי הדם, בעיקר הריאות והכליות, כדי ליצור אנגיוטנסין II (אנג II), הפפטיד מפעיל הראשי של RAS. אנג II הוא מסוגל הפעלת שתי תת קולטן; הקולטן מסוג 1 (AT 1 R) לבין הקולטן מסוג 2 (AT 2 R), הן המסדירות את מערכת הלב וכלי הדם, לשמור על הומאוסטזיס נוזלים ואלקטרוליטים ו נחשבים כיום להשפיע על התפקוד הקוגניטיבי ומחלות ניווניות מעבדת 8,9. RAS מקומי, מוח ספציפי מדווח באופן עצמאי לסנתז אנג שנייה. בשנת המוח, angiotensinogen חלבון מבשר הוא מסונתז astroglia 10 מומר אנג לי על ידי אנזים רנין דמוי 3, ואולי כבול prorenin לקולטן prorenin11, ולאחר מכן להמיר אנג השנייה על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין אשר מבוטא בשפע על פני השטח התאיים של נוירונים במוח 12. Intrabrain זה שנוצר אנג II הוא אגוניסט למוח AT 1 ו- AT 2 קולטנים מבודדים השנייה אנג שמקורן בדם.

בעוד AT 1 R ממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב, זה ידוע יותר עבור אפקטים pathophysiological שלה בכל הגוף, המשפיעים על מערכת הלב וכלי הדם בעיקר והכליות (איור 2). כאשר אנג II נקשר R 1 AT, שהיא גורמת vasoconstriction; הגדלת התנגדות לזרימת דם והעלאת לחץ דם. זה גם מקדם סינתזה הפרשת אלדוסטרון ווסופרסין, שמוביל נתרן מוגברת החזקת מים. תופעות אלה יכולים גם לגרום נזק מוחי איסכמי וליקויים קוגניטיביים והיא צמודה מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, ואת diabetes, כמו גם להיות זיהו באחרונה להשפיע למידה וזיכרון 13-15. יש לולאת משוב בשכונת ראס באותה AT 1 R על תאי juxtaglomerular בכליות מעכב הפרשת רנין. מעניין לציין, כי R AT 2 בדרך כלל נגד מווסת את הפעולה של AT 1 R, גרימת התרחבות, תולדה neurite, התחדשות axonal, אנטי התפשטות, cerebroprotection בקרב רבים אחרים 16-20. ה- R AT 2 גם זוהה כיעד אנטי יתר לחץ דם ולאחרונה, תרופות אנטי-סרטני 21. קביעת לוקליזציה הצפיפות של קולטנים אנג השניים בתוך רקמות שונות וכיצד הם מושפעים טיפולים שונים ומצבי המחלה באמצעות autoradiography קולטן densitometric כמותית יעזור לחשוף את התפקיד RAS משחק במחלות ספציפיות.

autoradiography קולטן שימש במשך למעלה מ -30 שנה כשיטה יעילה עבור המעידים על נוכחות של אנגיוטנסין Iאני קולטנים ורכיבים אחרים של RAS במוח וברקמות אחרות של חולדה, עכבר, שרקן, הכלב האנושי תחת מגוון רחב של תנאי הניסוי 22-34. החשיבות של איתור קולטנים השני אנג בתוך המוח היא שאפשר להחיל הנוירואנטומיה פונקציונלי לפעולות של אנג השנייה במוח, למשל, הנוכחות של R AT 1 בגרעין paraventricular של ההיפותלמוס (PVN) מציעה פונקציה של אנג שני במוח כדי לעורר וזופרסין, אוקסיטוצין או שחרור הורמון קורטיקוטרופין (CRH) שחרור, או הפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית. לכן, תרופות החוסמות את R AT 1 עשויות להקטין כמה תופעות PVN בתיווך אלה הקשורים על פעילות של RAS המוח. תוצרת בעיבוד מראה שהשימוש של AT 1 יריבי R יכול להקטין הפרעת דחק פוסט-טראומטי (PTSD) שחרור -induced של CRH ו לשפר את הסימפטומים של PTSD (Hurt et al., שהוגש לפרסום). PVN, subfornicalהאיבר (SFO), ו האמיגדלה ידוע להסדרת הומאוסטזיס, תיאבון / צמא, שינה, זיכרון, תגובות רגשיות, והם בתחומי היעד של מחקר הפגנה הזאת. אזורים אלה נבחנו על ידי איסוף חלקי עטרה של מוח על שקופיות מיקרוסקופ, וטיפול הקטעים עם מעכבים ספציפיים יחד עם radioligand ספציפי לקולטניים אנג השני. במחקר זה, כל החומרים ריאגנטים יחד עם ספקים הציעו מפורטים, יוד-125 שמשו radiolabel אנטגוניסט לקולטן אנג השנייה, sarcosine 1, isoleucine 8 אנג שני (SI אנג II), אשר היה מטוהר אז כמו שאני מוניתי 125 -SI אנג II באמצעות שיטות HPLC כפי שתואר לעיל 35. השימוש radioligand פעילות ספציפית גבוהה זה מאפשר הדמיה של תחומי צפיפות קולטני נמוך, בינוני וגבוה לאחר חשיפה של חלקים רדיואקטיבי כדי הסרט רנטגן. על ידי כיול הסרט לתקני רסק מוח המכילים לסכומים ידועים של יוד-125, הסכום המבוקששל קולטן אנג השני מחייב בשטח ניתן לכמת. במחקרים ניסיוניים, הקולטן אנג השנייה מחייב במוחם של הנבדקים הניסוי ניתן בהשוואה לזו במוחם של נבדקים בריאים. זה יכול לציין אם הפעולות של אנג שנייה הם שינו בתגובת מחלה גנטית, נורמליות פנוטיפי, מצב מחלה או טיפול תרופתי. ידע זה יכול להיות מיושם על הפיתוח של טיפולים לטיפול במחלות הקשורות חוסר ויסות של RAS. טכניקות חלופיות המזהות קולטן אתרי קישור, אבל עם רזולוציה אנטומיים מופחתת, מחייבות מבחנים המשתמשות הכנות קרום רקמות נגזרות homogenates רקמות, אשר מודגרת עם radioligand על פני טווח של ריכוזיים להעריך זיקה מחייבת radioligand כמו הקבוע דיסוציאציה (K D ) וקיבולת מחייב מקסימלי (מקסימום B) של הרקמה של עניין.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות שבור למטה לתוך 5 שיתוף גדולmponents: הכנת סעיפי רקמות עבור קולטן autoradiography; קולטן autoradiography; חשיפה לקולנוע פיתוח; היסטולוגיה; ניתוח תמונה densitometric.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים כל חיה שהתקיימו לצורכי מחקר זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של נובה אוניברסיטת מזרח בהסכמה עם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, 8 מהדורה עשירית (סוכנות הידיעות האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 2011 ).

1. סעיפי רקמות הכנות לקראת קולטן autoradiography

  1. עם הקרבה, רקמות המוח הקציר טרי, ועוטפים בנייר אלומיניום ומכניסים -20 ° C במקפיא בהקדם האפשרי. כדי לשמור על הצורה הנכונה, למקם את המוח בתוך תבנית המוח המדמה את החלק הפנימי של הגולגולת, לעטוף בנייר אלומיניום ומכניסים - 20 ° C במקפיא. לאחר 30 דקות, רקמות מקום בתוך שקית אחסון במקפיא סגר ולעבור במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך.
    1. השג את דגימת רקמות הקפואה של עניין מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס, ולהעביר cryostat להגדיר עד למינימום של 10 מעלות צלזיוס לכל היותר -18 ° C, כדי למנוע הפשרה.
    2. מניח את הדגימה על מרקמם הר עם גליקול ובינוני הטבעה מבוססת שרף, הטמעה רק חלק קטן של הדגימה לתוך המדיום. עבור מוח, המוח הוא רכוב אנכי כדי לאפשר חתך במישור העטרה.
  2. הנח את רקמת הר על microtome בתוך cryostat והדק במקומו. ודא צד שמאל וימין של המוח נמצאים באותו הקואורדינטות אנטרו-postero, וכי הציר dorso- הגחון הוא בניצב אטלסים המוח נפוץ.
  3. בגין חיתוך ב לעובי הרצוי (20 מיקרומטר מומלץ) ולהפשיר הר בסעיפים גבי שקופיות מיקרוסקופ בכיוון אנכי יש שטח פנים גדול יותר של שטח בשקופית. אסוף חלקים על גבי שקופיות בסטים רציפים של חמש, כלומר את הסט הראשון של שקופיות מסומנים 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, ו 1-5 (איור 3).
  4. לאחר מילוי קבוצה של שקופיות עם קטעים, לאפשר שקופיות לייבוש באוויר עד שעה 1, ולאחר מכן למקם את SLIdes בתיבת שקופיות פלסטיק בשקית אחסון במקפיא עצמית איטום, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

2. קולטן autoradiography

זהירות: רדיואקטיביות. השתמש לבוש מגן לטפל רדיואקטיביות. המיועדת לסילוק תלוי ממסד, והן חייב לציית להנחיות להירקב כמו שצריך (זמן מחצית חיים 60 ימים) או להיות נטל על ידי חברה מוסמכת.

  1. הסר את "-1" ו "-2" שקופיות של עניין מהמקפיא -20 ° C ו הר לתוך אוחז שקופיות (איור 5). הר השקופיות "-1" יחד לטיפול "הלא ספציפי", ואת השקופיות "-2" לטיפול "הכולל". 'שאינן ספציפיות "צנצנות תכלנה 10 מיקרומטר ריכוזיות סופי של PD123319 AT 2 אנטגוניסט R, ו Losartan AT 1 אנטגוניסט R, במאגר בינוני assay (AM5) (טבלה 1), את' הכוללים 'צנצנות מחייב תכלנה רק 10 מיקרומטר PD123319 ב AM5.
  2. הפוך את השקופיתאוחז למקם את השקופיות לתוך צנצנות Coplin מראש הדגירה מלאים 35-40 מ"ל של AM5, ומעכבי בהתאמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התחל סטים עוקבים באמבט טרום הדגירה שלהם ב 4 מרווחי דקות.
  3. מיד להעביר שקופיות מפתרון הדגירה מראש כדי הדיוורים שקופיות הדגירה, המכיל 10 מ"ל של AM5, בתוספת ריכוז קבוע מראש של 125 I-SI-אנג השנייה (מחושב באיור 4) עם מעכבי בהתאמה, עבור 60-90 דקות ב חדר טֶמפֶּרָטוּרָה. אם יש radioligand מספיק, 10 מגלשות ניתן למקם (BACK TO BACK) ב אוחז שקופיות שונה וטופחו עם 125 I-SI-אנג השנייה בצנצנות Coplin.
  4. מקום מחליק בחזרה לתוך אוחז שקופיות (במידת הצורך), כתם, ולשטוף ידי מתערבל בעדינות במשך 1-2 שניות ב -400 מ"ל מים מזוקקים בשני מיכלים נפרדים.
  5. העברת שקופיות ברצף לארבע צנצנות Coplin המכיל 35-40 מ"ל של AM5 בדיוק 1 דקות כל אחד (כפי שמודגם באיור 4 </ Strong>).
  6. לאחר שטיפה 1 דק 'האחרון, בעדינות מערבולת בסעיפים 1-2 שניות בארבעה שינויים של מים מזוקקים קרים כקרח.
  7. לייבש את השקופיות עם אוויר קריר (זהירות: אוויר חם volatizes במתחם רדיואקטיבי) באמצעות ארבעה מייבשי שיער להגדיר מזוויות שונות למשך 4 דקות (איור 5), עד שכל החלקים יבשים, ואז למקם על מגבת נייר.
  8. הר שקופיות עם רקמות פונות כלפי מעלה על גבי קרטון עבור פרד לסרטו רנטגן באמצעות סרט דו צדדי.
  9. הר אחד לפחות, כיול יוד 125 שקופית סטנדרטית על כל קרטון (איור 6).
    הערה: סטנדרטים כיול מורכב להדביק המוח מעורב באופן יסודי עם 125 יוד חייב תרכובת המכילה טבעת פנול, נדחס על ידי צנטריפוגה בתוך מזרק טוברקולין 1 מ"ל, כי הם cryostat מחולק באותו עובי כמו חלקים במוח להפשיר רכוב על גבי מיקרוסקופ שקופיות. לחלופין, 125 תקנים כיול לי בשרף פלסטיק מחולק על 20 עובי מיקרומטר ניתן להשיג באופן מסחרי. שרף הפלסטיק בתקנים אלו חלקית מגן הסרט מן הקרינה כזו כי שקילות רקמות של ~ 40% צריכות להיות בחשבון את הכיול.

חשיפת קולנוע 3. ופיתוח

  1. המשך חושך עם סרט קלטת autoradiography רצועת גב רנטגן. פתח את הקלטת ומקום הקרטון עם מגלשות בפנים (איור 6).
    1. לכבות את האור ולהדליק את safelight. בזהירות לפתוח את קופסא סרט X-Ray, להסיר סרט אחד, ומניח את צד מבריק סרט מעלה (עם הקצה המשונן על בפינה הימנית התחתונה) על גבי שקופיות הקלטת. בזהירות לסגור את הקלטת, ולסובב את סורגי הנעילה לאטום את האור (איור 6). לחשוף את השקופיות עבור מספר ימים עד מספר שבועות ב -20 ° C.
  2. בחדר החושך, לפתוח את הקלטת ולהמשיך עם proc מפתח הסרטESS.
    1. מניח את השקופיות במגשים ברציפות; יזם למשך 2 דקות, מים המכילים חומצה אצטית קרחונית 5% למשך 30 שניות, ו מסדר למשך 5 דקות. הסרטים הם מכניסים מגש עם מים זורמים במשך 20 דקות, ולאחר מכן להציב לתוך Photoflo לא יותר מ -10 שניות ותלה.
      הערה: זמן החשיפה נקבע באופן אמפירי יכול לערב סרטים מרובים עם זמני חשיפה שונים: מספיק זמן כדי לקבל אותות מדידים מאזורים עם נמוך מחייב, אבל לא כל עוד להרוות את הסרט לפי תחומים עם גבוה מחייב. לאחר מתקבלות חשיפות מקובלות, ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא.

4. היסטולוגיה

  1. מכינים את הכתם thionin ריאגנטים מכתים (טבלה 2, איור 7).
    1. מניחים את השקופיות "-3" במעמד שקופיות, והעברת בסדר רציף החל מים ללא יונים 1 דקות, ואז thionin פתרון כתם במשך 10 דקות ולאחריה שלושה מטבלים לתוך Deionמי ized, לשטוף אחד 30 שניות במי deionized.
    2. בעקבות המים, מניחים את מתלה להחליק לתוך שוטף אתנול כדלקמן; 50%, 70%, ו -90% למשך 30 שניות, ואחריו שני שוטף אתנול ב -100% עבור 1 דקות כל אחד. לבסוף, הניחו את מתלה להחליק לתוך קסילן במשך 3 דקות, ולאחר מכן להעביר לידי פתרון קסילן השני במשך 5 דקות.
  2. סר שקופית אחת בכל פעם מאמבטית קסילן האחרונה, ולכסות את הקצה העליון של השקופית עם בסיס שרף במדיום הרכבה ממס אורגני, ומקום coverslip 24 מ"מ x 60 מ"מ לשקופית. אפשר שקופיות יבשות מספיק עבור ~ 48 שעות ולאחר מכן סרוק למחשב ב- 2400 בגווני אפור dpi.

5. ניתוח תמונה densitometric

  1. מניח את צד מבריק סרט למטה, עם הקצה המשונן על הפינה השמאלית התחתונה ולסרוק באמצעות סורק קניינית מסוגל לשדר את מידע צפיפות סרט ללא כל עיוות במחשב מערכת הדמיה.
  2. פתח את sys הדמית הקנייניםTEM ולנצל הסורגים כיול לקבוע כללים כיול לניתוח densitometric העתיד של התמונות על הסרט (איורים 9 - 12).
  3. באזורי מידה של עניין או על ידי הקמת תבנית או אמפירי אשר מתווה את תחומי העניין. נתונים נאספו והפרידו מבוסס על סרט, או שליטה או סוג בר (פסק), ובאזור. הקפד לכלול צפיפות (fmol / g), אזור הסריקה, ואזור היעד הכולל במדידות (איור 9).
    1. התאם ברי אזור סריקה ידי והבטיח כי האזור של עניין נופל בין פרמטרים של הדגשה (איור 10).
    2. נתוני יצוא לתוך גיליון אלקטרוני (לוח 4). הכפל את פעמי הצפיפות באזור היעד הכולל, ולאחר מכן חלק את אזור הסריקה על מנת לקבל את הערך עבור המחייב כי אזור מסוים. ברגע שזה נעשה לכל הערכים שנמדדו, למצע לדגמים הקיימים שאינם ספציפיים ממניין להניב הספציפי מחייב pלְהִתְרַעֵם. ממוצעים עשויים גם להתבצע על ערכים אלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בראייה כוללת של המסלול מהטבולים של מערכת רנין-אנגיוטנסין מוצגת באיור 1 והפוקוס הישיר על תת קולטן אנגיוטנסין II (AT 1 R ו- AT 2 R) מתואר באיור 2. איור 3 מציג את העברת מוח עטרה חלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ, אשר לאחר מכן מנוהלים באמצעות הליך autoradiography הקולטן באמצעות ריכוז קבוע מראש 125 I-סיאנג השנייה כפי שניתן לראות באיור 4. איור 5

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתואר מזהה את להדמיה של 'הכולל' ו 'הלא ספציפי "מחייב של radioligand בסעיפים סמוכים סעיפי עטרה של מוח מכרסם שנקטף בעבר ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, והוא יכול להיות ישים בקלות כמעט בכל רקמה אנטומית פתר substructures אשר להציג כמויות הפרש של קולטנים או אתרי קישור radioligand. הנהלים התואר בתוך הפרוטוקול פשוטים הניתוח הוא קריטי עבור בפירוש תוצאות כראוי. 20 מיקרומטר העובי היה נחוש בדעתו להיות אופטימלי; אם הסעיף עבה מדי הלא ספציפי המחייב יגדל, ולכן קשה לפתור את...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוברט ספת' העניק רישיון לנוגדנים לקולטני אנגיוטנסין II לספק מסחרי ומקבל תמלוגים ממכירת הנוגדנים האמורים. לכותבים האחרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH Grant HL-113905

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 מ"ל כוסות פלסטיקפישר02-591-30
24 מ"מ x 60 מ"מ כיסוייםפישר22-050-25
סרט הדמיה אוטורדיוגרפיה 24 מ"מ x 30 ס"מCarestream-Biomax MR Film891-2560
Bacitracin (מ- Bacillus licheniformis)SigmaB-0125
גיליון קרטון 8 x 11לוח איור סהר #201201
צנצנות קופליןפישר סיינטיפיקE94
מייבשי שיער מסחרייםConairדגם SD6X
צינורות תרבית חד פעמייםפישר14-961-26
EDTA (מלח דיסודיום, דיהידרט)תאגיד USB15-699
אתנולפישר16-100-210 
תחליף נוסחאות לצלמי מפתחי D-19Formulary, Inc. 01-0036
חומצה אצטית קרחוניתפישרA38 SI-212
Histoprep / OCTפישרSH75-125D
מתקן סרטיםקודאק5160320
צילום פלוקודאק1464502
לוסרטןפישר / טוקריס37-985-0
MCID&סחר; Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
אחיזת שקופיות Peel-A-WayVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
שקופיות טעונות פרימיום, שקופיותמיקרוסקופ Premiere Edge Fine9308W
125I ליגנדיםפרקין אלמרNEX- 248
125SI-Ang II אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטוןרדיו-יוד על ידי ד"ר ספת'
שקופיות מיילרספישר סיינטיפיקHS15986
נתרן דו-בסיסי פוספט נטול מים (Na2PO4)פישרRDCS0750500
נתרן אצטט (נטול מים)פישרBP333-500
תיונין פישרT409-25
קלטת רנטגן (10 x 12)תאגיד ספקטרוניקסארבע מרובעות
קסילןפישר X3P-1GAL
Ground

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004(2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635(2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31(2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234(2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain Tissue SectioningRadioligand Binding AssayNon Specific BindingTotal BindingCryostat SectioningAutoradiography Film ExposureThionin Histological StainingDensitometry Analysis

Related Articles