קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתיאור לוקליזציה של קולטני אנגיוטנסין II מסוג 1 במוח החולדה על ידי אוטורדיוגרפיה כמותית, דנסיטומטרית, קולטן במבחנה באמצעות אנלוגי יוד-125 של אנגיוטנסין II.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר דפוסים מחייבים קולטן עבור אנגיוטנסין II (אנג II) במוח החולדה באמצעות radioligand ספציפי לקולטניים אנג השנייה לבצע מיפוי קולטן autoradiographic.

דגימות רקמות נקצרות ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. Cryostat משמש סעיף coronally הרקמה (המוח) הפשרת הר בסעיפים גבי שקופיות טעונות. סעיפי הרקמות רכובי השקופיות מודגרת ¹²⁵ I-SI-אנג שני radiolabel קולטנים אנג השני. שקופיות סמוכות מופרדים לשתי קבוצות: "הלא ספציפיות מחייבים" (NSP) בנוכחות ריכוז להרוות הקולטן של הלא רדיואקטיבי אנג השנייה, או AT ₁ תת סוג קולטן אנג השני (AT ₁ R) אנטגוניסט לרצפטור אנג שני סלקטיבית , ו 'סה"כ מחייב "ללא AT אנטגוניסט R _1. ריכוז להרוות של תת-סוג קולטן AT ₂ אנג השנייה (AT ₂ R) אנטגוניסט (PD123319, 10 מיקרומטר) קיים גם incubatiעל חיץ להגביל ¹²⁵ I-SI-אנג השנייה מחייב את תת סוג R AT _1. במהלך 30 דקות הדגירה טרום ב ~ 22 ° C, מגלשות NSP נחשפים 10 מיקרומטר PD123319 ו Losartan, כאשר בוחרים באפשרות 'סה"כ מחייב' שקופיות נחשפים 10 מיקרומטר PD123319. שקופיות מודגרת מכן עם ¹²⁵ I-SI-אנג השנייה בנוכחות PD123319 עבור 'להסתכם מחייב', ו PD123319 ו Losartan עבור NSP חיץ assay, ואחריו כמה 'שוטף' חיץ, ומים כדי להסיר מלח אי כבול radioligand במיוחד. השקופיות הן יבשות באמצעות מכת מייבשים, אז נחשפו סרט autoradiography באמצעות סרט קלטת מיוחד. הסרט הוא פיתח את התמונות נסרקים לתוך המחשב עבור צפיפות ויזואלית וכמותית באמצעות מערכת הדמיה קנייני גיליון אלקטרוני. סט נוסף של שקופיות thionin מוכתם להשוואות היסטולוגית.

היתרון של שימוש autoradiography קולטן הוא היכולת לדמייןאנג השנייה קולטנים באתרו, בתוך קטע של דגימת רקמות, אנטומית לזהות את האזור של הרקמה על ידי השוואתה קטע התייחסות היסטולוגית סמוך.

מבוא

מחלות לב וכלי דם ממשיכה להיות הגורם המוביל למוות ונכות בארצות הברית, גרימה יותר מ -30% ממקרי המוות בארצות הברית בשנת 2011 ^1. הנתונים הסטטיסטיים העדכניים ביותר של איגוד הלב האמריקאי עולה כי יותר מאדם אחד מכל שלוש יש אחד או יותר סוג של מחלות לב וכלי דם. מחקר לב וכלי דם ממשיך לעשות צעדים נגד להבנת המחלה הזאת, אבל כמו דורות להתחיל מזדקן זה הכרחי כדי להמשיך במאמצים אלה. מערכת רנין-אנגיוטנסין (RAS) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות של מערכת הלב וכלי הדם בעיקר על ידי קידום טרשת עורקים, דלקת, vasoconstriction מערכתית, והפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית (איור 1) ^2-8.

פרוטוקול

הנהלים כל חיה שהתקיימו לצורכי מחקר זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של נובה אוניברסיטת מזרח בהסכמה עם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, 8 מהדורה ^עשירית (סוכנות הידיעות האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 2011 ).

1. סעיפי רקמות הכנות לקראת קולטן autoradiography

1. עם הקרבה, רקמות המוח הקציר טרי, ועוטפים בנייר אלומיניום ומכניסים -20 ° C במקפיא בהקדם האפשרי. כדי לשמור על הצורה הנכונה, למקם את המוח בתוך תבנית המוח המדמה את החלק הפנימי של הגולגולת, לעטוף בנייר אלומיניום ומ....

תוצאות

בראייה כוללת של המסלול מהטבולים של מערכת רנין-אנגיוטנסין מוצגת באיור 1 והפוקוס הישיר על תת קולטן אנגיוטנסין II (AT ₁ R ו- AT ₂ R) מתואר באיור 2. איור 3 מציג את העברת מוח עטרה חלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ, אשר לאחר מכן מנוהלים באמצעות הליך autoradiography הקולטן באמצעות ריכוז קבוע מראש ¹²⁵ I-סיאנג השנייה כפי שניתן לראות באיור 4. איור 5

דיון

הפרוטוקול מתואר מזהה את להדמיה של 'הכולל' ו 'הלא ספציפי "מחייב של radioligand בסעיפים סמוכים סעיפי עטרה של מוח מכרסם שנקטף בעבר ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, והוא יכול להיות ישים בקלות כמעט בכל רקמה אנטומית פתר substructures אשר להציג כמויות הפרש של קולטנים או אתרי קישור radioligand. הנהלים התואר בתוך הפרוטוקול פשוטים הניתוח הוא קריטי עבור בפירוש תוצאות כראוי. 20 מיקרומטר העובי היה נחוש בדעתו להיות אופטימלי; אם הסעיף עבה מדי הלא ספציפי המחייב יגדל, ולכן קשה לפתור את.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
500 מ"ל כוסות פלסטיק	פישר	02-591-30
24 מ"מ x 60 מ"מ כיסויים	פישר	22-050-25
סרט הדמיה אוטורדיוגרפיה 24 מ"מ x 30 ס"מ	Carestream-Biomax MR Film	891-2560
Bacitracin (מ- Bacillus licheniformis)	Sigma	B-0125
גיליון קרטון 8 x 11	לוח איור סהר #201	201
צנצנות קופלין	פישר סיינטיפיק	E94
מייבשי שיער מסחריים	Conair	דגם SD6X
צינורות תרבית חד פעמיים	פישר	14-961-26
EDTA (מלח דיסודיום, דיהידרט)	תאגיד USB	15-699
אתנול	פישר	16-100-210
תחליף נוסחאות לצלמי מפתחי D-19	Formulary, Inc.	01-0036
חומצה אצטית קרחונית	פישר	A38 SI-212
Histoprep / OCT	פישר	SH75-125D
מתקן סרטים	קודאק	5160320
צילום פלו	קודאק	1464502
לוסרטן	פישר / טוקריס	37-985-0
MCID&סחר; Core 7.0	MCID	N/A
NaCl	Fisher	S271
אחיזת שקופיות Peel-A-Way	VWR	48440-003
Permount	Fisher	SP15-100
PD123319	Fisher	13-615-0
שקופיות טעונות פרימיום, שקופיות	מיקרוסקופ Premiere Edge Fine	9308W
125I ליגנדים	פרקין אלמר	NEX- 248
125SI-Ang II	אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון	רדיו-יוד על ידי ד"ר ספת'
שקופיות מיילרס	פישר סיינטיפיק	HS15986
נתרן דו-בסיסי פוספט נטול מים (Na2PO4)	פישר	RDCS0750500
נתרן אצטט (נטול מים)	פישר	BP333-500
תיונין	פישר	T409-25
קלטת רנטגן (10 x 12)	תאגיד ספקטרוניקס	ארבע מרובעות
קסילן	פישר	X3P-1GAL

Ground