מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

סיכום

רוב הזיהומים החיידקיים מייצרים ביופילם. מתוקף הסביבה שלהם, חיידקים הקשורים לביופילם הם לעתים קרובות עמידים לתרופות פנוטיפיות. מולקולות אנטיבקטריאליות חדשות שהורגות חיידקים בביופילמים נמצאות אפוא בעדיפות גבוהה. אנו מקימים בדיקה לסינון מהיר של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות היעילות בהדברת ביופילמים.

תקציר

רוב החיידקים הפתוגניים מסוגלים ליצור ביופילמים במהלך זיהום, אך בשל הקושי לתפעל ולהעריך ביופילמים, הרוב המכריע של עבודת המעבדה מתבצעת עם תאים פלנקטוניים. כאן, אנו מתארים בדיקת ביופילם של לוחית יתד כפי שבוצעה עם Staphylococcus aureus. ביופילמים חיידקיים גדלים על יתדות המחוברות למכסה צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות, נשטפים דרך טבילה עדינה במאגר ומונחים בצלחת אתגר תרופות. לאחר הדגירה שלאחר מכן הם נשטפים שוב ומועברים לצלחת התאוששות סופית, בה הצבע הפלואורסצנטי רזזורין משמש כאינדיקטור כדאיות. בדיקה זו מציעה קלות שימוש, אמינות ושחזור מוגברות מאוד, כמו גם שפע של נתונים כאשר היא מתבצעת כקריאה קינטית. יתר על כן, ניתן להתאים בדיקה זו לגישת סינון תרופות בתפוקה בינונית שבאמצעותה נלקחת במקום זאת קריאה פלואורסצנטית של נקודת קצה, המציעה נתיב למאמצי גילוי תרופות.

מבוא

חיידקים פתוגניים יכולים ליצור biofilms in vivo מוביל לזיהומים כרוניים שאינם חריפים ^1. הזיהום הקשורים biofilm הוא גורם סיכון רציני של פרוצדורות רפואיות שכוללות השתלה של גופים זרים (למשל, מחליף עצם מלאכותי, שתלים בחזה) או באמצעות ההתקנה של צינורות לקנה נשימה או צנתרי שתן ^2. בהקשרים אלה, טיפול אנטי זיהומיות הוא כמעט תמיד הכרחי כמו זיהומים מבוססים ביופילם נמחקים לעתים רחוקות בכוחות עצמם, אפילו אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים. Staphylococcus aureus הוא אחד מגורמי המחלה העיר לעתים הקרוב ביותר המעורבים סיבוכים הקשורים biofilm המתרחשים במהלך השימוש ³ מכשירים רפואיים פולשניים.

למרבה הצער, טבעו של biofilms כמחסום מגן שהופך אותם עמיד יותר לטיפול מאשר תאי planktonic ^1,4, וההערכה של יעילות קלינית חזה היא חלק קריטי של השני ראשוניפיתוח תרופות כמו גם מעקב עמידות לתרופות. יש הכרה גוברת כי בתנאי מעבדה, מתמקדים תרבויות planktonic, לא יכולים לייצג נאמן בעולם האמיתי מחלה ^5. עוד הרכבה את הבעיה, השכפול של פנוטיפים biofilm קשה, ומודלים ביופילם קיימים הם מייגעים סובלים הבנת גבוה ולהבדלי תוך assay ^6. לכן, חוקרים רבים, דרך צורך, כברירת מחדל מבחני תא planktonic רגישות תרופה, ובכך באופן פוטנציאלי הזנחת היבט חשוב של ארסיויות חיידקים ומחלות.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לחיידקי assaying, במיוחד ס aureus, ב biofilms טרום גדל ניצול ^7,8 מערכת ביופילם מבוסס 96-היטב. בעוד הפרוטוקול להיווצרות ואתגר ביופילם כדלקמן בעצם המלצת היצרן, אנו מציגים מתודולוגיה מידע עשיר חלופית לכימות את הכדאיות של biofILM לאחר אתגר. בקצרה, חיידקים בתרבית צלחת היתד, שם biofilms להיוצר על היתדות הבולטות המצורפות את המכסה של הצלחת. לאחר ההיווצרות ביופילם, את היתדות הם טבלו בעדינות בבארות של צלחת טריה המלאה PBS להסיר תאי planktonic. PEG-מכסה, עם biofilms המצורפת, מועבר צלחת אתגר חדש, המכיל ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה להיות assayed. לאחר דגירה שנייה, מכסה שוב מוסרים, שטף, והועברתי צלחת התאוששות המכילה resazurin לצבוע, שם הם עוברים דגירה סופית. מרת Resazurin ניתן להקליט kinetically או נלקחת קריאת הסיום לאחר תקופת החלמה מוגדרת. שיטת צבע מבוסס זה לכימות הכדאי של biofilms שונה באופן משמעותי מן (יחידות המושבה להרכיב) CFU המייגעים מתודולוגיה לספור מבוססת כמתואר בפרוטוקול המקורי ^7. OD ₆₀₀ מדידות של צלחת תרופת אתגר resazurin קינטיקה המר לשמש לקריאה כדאיתקטן של תאי planktonic ו biofilm, בהתאמה, המציע assay מהיר, אמין ועשיר במידע ופשוט טכני להישרדות ביופילם.

פרוטוקול

1. Biofilm ייזום

1. לגדול תרבות של אורגניזם לייצר ביופילם בתווך עשיר מזין. לחסן זן aureus Staphylococcus ניומן ב 10 מ"ל של מדיום מולר-הינטון ממלאי גליצרול. לבצע את כל העבודות שיש בהן טיפול S. aureus עם כפפות בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
2. דגירה במשך 16 שעות ב 37 ° C על שייקר רוטרי (100-200 סל"ד).
3. לקבוע OD ₆₀₀ של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר ו קובט סטנדרטי (אורך מסלול: 1cm).
4. חשב את נפח (V) של תרבות צריכה להכין 20 מ"ל של הבידוד עם OD _{600 (הבידוד)} של 0.1 ב chelexed התקשורת מכון ממוריאל פארק Roswell (CRPMI) ⁹ באמצעות הנוסחה: [V = 20 מ"ל * 0.1 / OD _{600 (תרבות )]}
   הערה: Reference 9 מספק פרטים על הכנת CRPMI.
   1. מוסיפים את נפח תרבות מחושב (מלמעלה) לצינור צנטריפוגות ותאי גלולה על ידי ספינינג 1 דקות ב g 10,000 x. כדי prepaמחדש הבידוד ביופילם, לשאוב התא גלולה בינוני ו resuspend צמיחה בילה 20 מ"ל CRPMI.
5. יוצקים הבידוד למאגר 25 מ"ל.
6. מוציאים בזהירות את המכסה מעל צלחת יתד 96-גם סטרילי על ידי משיכתו כלפי מעלה.
   הערה: יש להקפיד לא לזהם את היתדות שמוט מהמכסה. המכסה ניתן להציב במהופך על משטח נקי בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
7. בעזרת פיפטה 200 רב ערוצית μl, להוסיף 125 בידוד μl היטב בכל שורות A עד G של הצלחת התחתונה.
8. מלאו 125 μl סטרילי בינוני CRPMI היטב בכל שורה H כביקורת על סטריליות.
9. קח את-מכסה היתד והחזק אותו מעל תחתית הצלחת עם היתדות הפונות כלפי מטה. בזהירות ליישר את יתדות פרט עם הבארות שלהם. יש להימנע ממגע פיזי בין צלחת את היתדות. לאחר מיושר, להוריד את המכסה בזהירות למטה. הימנע misalignments כמו readjustments שבוצע לאחר היתדות נגע הצלחת התחתונה עשויה המשךשולטת עקרות aminate בשורה H.
10. חותם את המכסה לצלחת עם הסרט פרפין כדי למנוע אידוי ומניחים בשקית ניילון סגר, איטום בחוזקה. שמור את נפח האוויר בשקית הנמוכה ככל האפשר על מנת למזער התאדות.
11. דגירה בלי ללחוץ על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ₂ באינקובטור 5% CO.
    הערה: 48 שעות של צמיחה היו אופטימליות עבור ס aureus, אך ישתנו בהתבסס על האורגניזם בשימוש.
    הערה: למרות דגירת סטטי היא נקודת התחלה טובה כדי לייעל את assay, רועד בעדינות 150 סל"ד על שייקר microplate היא וריאציה אפשרית כדי להביא להגברת היווצרות ביופילם של כמה ס aureus מבודד.

2. הכנת פלייט אתגר Biofilm

1. ביום האתגר ביופילם לקחת צלחת 96-היטב טרי ולהוסיף 100 μl של CRPMI, equilibrated כדי RT, היטב כל השורות ב 'ח כדי למנוע תוצאות לא עקביות, לנצל צלחת 96-היטב שיכול להכיל 200 μlשל תקשורת כאשר היתדות הן בפנים, כוללות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת הייזום ביופילם.
2. לדלל עד 4 תרכובות בדיקה בנפרד 1.0 מיליליטר של CRPMI ל 2x לריכוז הסופי הרצוי, כדי לתת דין וחשבון על דילול סופי בשלב 2.7.
   הערה: נקודת התחלה טובה היא 8 לקפל מעל ריכוז המעכבות של תאי planktonic.
3. הוסף 200 μl של המתחם 1 בבארות A1 ל- A3, מתחם 2 בבארות A4 עד A6, מתחם 3 בבארות A7 כדי A9 מתחם 4 בבארות A10 כדי A12.
4. סדרתי לדלל את תרכובות הבדיקה באמצעות פיפטה רבה ולהעביר 100 μl משורה א 'עד בטור ב ומערבבים.
5. באופן זה, להמשיך להעביר 100 μl לבאר. מערבב אחרי כל העברה ולהפסיק בשורת פ
6. לאחר ערבוב, לגרש 100 μl משורה F לתוך מיכל פסולת. אל תעבירו את כל נוזל אל שורות G ו- H.
7. הוספת 100 μl של CRPMI היטב כל הצלחת באמצעות פיפטה רבה כדילהביא את נפח 200 μl. ראה איור 1 עבור פריסת צלחת סופית.

3. אתגר Biofilm

1. הוסף 200 μl של בופר פוספט (PBS) בצלחת 96-גם סטרילי טרי כי תכונות בארות עם ממדים זהים לאלה של הצלחת ייזום ביופילם.
2. מוציא את שקית פלסטיק סרט פרפין מצלחת הייזום ביופילם מודגרות.
3. הרם את המכסה כלפי מעלה. יש להימנע ממגע בין יתדות והחלק התחתון צלחת כפי שהדבר עלול לגרום נזק ביופילם. שמור חלק תחתון לניתוח שלאחר מכן OD ₆₀₀ (ראה 3.8).
4. לשטוף תאי planktonic על ידי נחת-המכסה יתד לצלחת המכילה PBS (משלב 3.1). לצלול יתדות במשך 5 שניות, להרים מתוך PBS, לצלול שוב, נזהרים שלא לפגוע יתדות נגד הצדדים היטב.
5. מניח את יתד המכסה שטוף לתוך הצלחת האתגר. הימנעו ממגע בלתי נחוץ בין יתדות הצלחת התחתונה כמו זו תגרום נזק ביופילם המובילתוצאות לא עקביות.
6. צלחת חותם עם הסרט פרפין ומקום לתוך שקית ניילון סגר כמתואר בשלב 1.10.
7. דגירת הצלחת ללא רעד במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממת ₂ 5% CO.
8. קח בתחתית צלחת biofilm ייזום מ -3.3. Resuspend החיידקים בכל טוב בעזרת פיפטה רבה ערוצים ולמדוד את OD ₆₀₀ עם קורא microplate מתאים כדי לאשר צמיחה המתרחשת כל הבארות אבל שולט עקרות בשורה H.

4. קביעת Biofilm

1. שימוש בקורא צלחת מצויד בתא דגירה ומסוגלים לקחת קריאות הקרינה הקינטית לאיתור resazurin המרה. הגדרת מדידת קרינה הקינטית 24 שעות באמצעות עירור 530 ננומטר 590 פליטת ננומטר.
2. הגדר את הטמפרטורה בתא עד 37 ° C ויש להם את צלחת לקרוא כל 20 דק '. הגדר את קורא הצלחת למדוד מהחלק התחתון של הצלחת פי instruc של היצרןמשא.
3. כן צלחת לשטוף ידי הוספת 200 μl של PBS עם פיפטה רבה לצלחת גם 96 סטרילי.
4. הכן בינוני התאוששות ביופילם על ידי הוספת 400 μl של 0.8 מ"ג / מ"ל ​​resazurin הפתרון המניות 20 מ"ל של מדיום CRPMI לריכוז סופי של resazurin 16 מיקרוגרם / מ"ל.
   הערה: Resazurin הוא מגרה את העור ידוע. השתמש בחלוק מעבדה, משקפים להתיז, וכפפות בזמן הטיפול. CRPMI כמו תקשורת התאוששות ביופילם שמש משום שהוא מספק את אות הרקע הנמוכה ביותר, אבל זה יכול להיות מוחלף על ידי תקשורת מילר Hinton אם מתאים.
5. להוסיף 150 μl של מדיום התאוששות ביופילם עם טפטפת רב היטב בכל צלחת 96-היטב טריה.
6. העברת צלחת אתגר מן החממה לתוך ארון בטיחות ביולוגי ובזהירות להסיר שקית פלסטיק סרט איטום.
7. הסר את מכסת היתד מצלחת האתגר ולשטוף תאי planktonic ב PBS כמתואר 3.4. שמור את החלק התחתון של צלחת אתגר OD עוקבת ₆₀₀ anaתמוגה (ראה 4.10).
8. לאחר השטיפה, למקם את מכסת היתד לתוך התחתון הצלחת המכיל את מדיום ההתאוששות ביופילם.
9. עוטף את הצד של הצלחת עם סרט פרפין, נזהר שלא להכשיל את החלק התחתון של הבארות ההיקפיות. מייד לאחר לעטוף את הצלחת, ומניח אותו על קורא הצלחת ולהתחיל לקרוא הקינטית פני תקופה של 24 שעות על ידי ייזום עשה בעבר resazurin פרוטוקול הקינטית משלב 4.1.
10. כדי לכמת הצמיחה של תאים planktonic שעשוי או עלול לא להתרחש במהלך האתגר, לקרוא את OD ₆₀₀ של תחתית צלחת האתגר כולו באמצעות קורא צלחת מיקרו. פעל בהתאם להוראות שניתנו בשלב 3.8.
    הערה: בזהירות resuspend התוכן של כל אחד גם כתאים משילים את ביופילם נוטים לגדול במקבצים בתחתית הבאר. כל בועות בתוך הבאר תפרענה מאוד עם קריאות OD ₆₀₀ ו יש להימנע או להסיר לפני לקרוא.

תוצאות

את assay resazurin הוא רגיש מספיק כדי לזהות באופן אמין מאוד כמה תאי קיימא יכולת שכפול במדיום נקי מסמים לאחר אתגר. ב מתודולוגיה זו, נגדיר את הריכוז בביעור ביופילם המינימאלי כמו הריכוז הנמוך ביותר בה ללא מרת resazurin נתפסת בתוך 24 שעות. את assay resazurin מסתמך על מולקולות חמצונים נמצאות תאים פעילים מבחינה מטבולית אשר להמיר את הצבע לצבוע מכחול ורוד. המרה דאי הוא ובכך אינדיקטור של צמיחת תאים, וניתן לכמת באמצעות קורא צלחת מיקרו ניאון. במאמר זה, neocup...

דיון

הנה, יש לנו תארנו assay biofilm שונה לקביעת פעילות של מעכבים נבדקו על S. biofilms aureus התמקדות מצב מטבולי של תאים הקשורים ביופילם. בעוד נהלים אתגר וייזום ביופילם תיאר בעיקר המלצות היצרן חיקה, השימוש resazurin לצבוע לזהות ולכמת תאים הקשורים biofilm ששורדים אתגר 24 שעות מעכב באופן דרמטי מפשט את הנוהל המומלץ של התאוששות התא (דרך sonification באמבט מים) ו ספירה עוקבות תאי קיימא של דרך ספירת CFUs. הליך יצרן מומלץ זה כרוך לפחות 5 שלבי מניפולציה נוספים, כל אחד מהם לשג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	עקוב אחר המלצות היצרן
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 בינוני צ'לקס למשך שעה אחת עם שרף Chelex 100 ולאחר מכן הושלם עם 10% RPMI-1640 Chelex
100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin נתרן מלח	סיגמא	R7017	800 ומיקרו; גרם/מ"ל במי DI
פלטפורמת טלטול מיקרו צלחת	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 קורא צלחות	Biotek
Gen5 תוכנה	Biotek		הקלטה וניתוח של המרת רזזורין
Neocuproine	Sigma	N1501	להכין מלאי של 10 מ"מ באתנול 100%, לאחסן ב -80 º C
נחושת גופרתית	Acros Organics	7758-99-8	מכינים תמיסת מלאי של 100 מ"מ במים, מאחסנים ב -4 º C
Cu-neocuproine	תוצרת		עצמית נוצר על ידי ערבוב מולריות שוות של ניאוקופרואין ונחושת גופרתית. התערובת דוללה במדיום CRPMI לריכוז הרצוי.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G

סטרילית מסנן