מאמר שיטה

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

DOI:

10.3791/53933

⸱

8 במאי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר את השיטות לאינדוקציה וניקוד של מודל דלקת המוח האוטואימונית הניסויי (EAE), יחד עם הערכת התפלגות תאי החיסון ורמות ציטוקינים mRNA בבלוטות הלימפה, הטחול, הדם וחוט השדרה באמצעות ציטומטריית זרימה ו-PCR כמותי, בהתאמה, בשלבי מחלה שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת נפוצה, חזקה כי מחלה אוטואימונית דלקתית, המאופיינת היווצרות הנגע במערכת העצבים המרכזית (CNS) וכתוצאה מכך פגיעה קוגניטיבית ומוטורית. encephalomyelitis אוטואימוניות ניסויית (EAE) הוא מודל יצור מועיל של MS, כי זה מאופיין אף הוא היווצרות הנגע של מערכת העצבים המרכזית, לקויות מוטוריות, והוא מונע גם על ידי תגובות אוטואימוניות ודלקתיות. אחד הדגמים EAE מושרה עם פפטיד נגזר חלבון oligodendrocyte המיאלין (ש"א) 35-55 בעכברים. עכברי EAE לפתח קורס מחלה מתקדם. קורס זה מחולק לשלושה שלבים: השלב הפרה-קליניים (יום 9 - 0), הופעת המחלה (יום 10 - 11) ואת השלב האקוטי (יום 12 - 14). טרשת נפוצה EAE הם המושרה על ידי תאי T אוטוריאקטיבים כי להסתנן CNS. תאי T אלה מפרישים כמוקינים וציטוקינים אשר להוביל גיוס של תאים חיסוניים נוספים. לכן, חלוקת התא החיסונית ד חוט השדרהuring נחקר בשלושה שלבי מחלה. כדי להדגיש את נקודת הזמן של המחלה שבה הפעלה / התפשטות / הצטברות של תאי T, B תאים מונוציטים מתחיל, חלוקת תא החיסון בבלוטות הלימפה, הטחול ודם הוערכה גם. יתר על כן, רמות ציטוקינים כמה (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFα, IFNγ) בשלושת שלבי המחלה נקבעו, כדי לקבל תובנות לגבי תהליכים דלקתיים של המחלה. לסיכום, הנתונים מספקים סקירה של הפרופיל התפקודי של תאים חיסוניים במהלך פתולוגיה EAE.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת נפוצה (MS) ו במודל החיה המתאים לו, encephalomyelitis אוטואימוניות ניסוי (EAE), להראות שינויי neuroinflammation אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). מוקדם פעיל נגעים MS ו EAE מאופיינים על ידי נוכחות של תאים חיסוניים הסתננו. האטיולוגיה של MS נותר עלום, אבל היא נחשבת לערב חורבן המיאלין בתיווך תאי T אוטוריאקטיבים. תאי T אוטוריאקטיבים אלה מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים וכמוקינים אשר מושכים תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי B, מונוציטים ו נויטרופילים מהמחזור. מונוציטים להתמיין מקרופאגים. גמא אינטרפרון (IFNγ) מופרש על ידי תאי T אוטוריאקטיבים מקטב את מקרופאגים לתוך מקרופאגים פרו-דלקתיים. הציטוקינים שחרור מקרופאגים פרו-דלקתי מיני חמצן תגובתי מקדמי אפופטוזיס oligodendrocytes. מותו של oligodendrocytes מוביל demyelination. יתר על כן, תאי B להתמיין pתאים lasma ונוגדנים עצמיים השחרור בפועל כנגד מעטפת המיאלין, בסופו של דבר וכתוצאה מכך השפלה של המיאלין. ההפסד של המיאלין מוביל לזילות של אקסונים נוירונים ובכך להיווצרות של אתרי הנגע של מערכת העצבים המרכזית אשר מייצגים את המאפיין העיקרי של MS 1. בפריפריה, תאי T ותאי B מופעלים בקשרי הלימפה, הם מתרבים הטחול ולהעביר דרך מערכת הדם למערכת העצבים המרכזית. מונוציטים ו נויטרופילים להתרבות במח העצם וגם להעביר דרך מערכת הדם למערכת העצבים המרכזית.

לויקוציטים extravasation ממח העצם, הטחול בלוטות לימפה לתוך הדם או ממחזור הדם אל מערכת העצבים המרכזית היא תהליך רב שלבי, כי תלוי במספר גורמים, כולל אינטראקציות מולקולריות בין לויקוציטים האנדותל בתיווך כמוקינים ואת קולטני chemokine. ההפקה של כמוקינים על ידי תאים מסוגים שונים יכול להיגרם במהלך reactio החיסוניתn על ידי ציטוקינים כמו-α tumor necrosis factor (TNFα), IFNγ ו- interleukin-6 (IL-6), אשר לאחר מכן מגייס תאי מערכת החיסון לאתר של דלקת 2,3. תאים חיסוניים להציג קבוצת משנה של קולטני chemokine על פני השטח שלהם, בהתאם לסוג תא מסלול הגירה לאתר הדלקתי. לפיכך, CXCR2, CCR1 ו CXCR1 באים לידי ביטוי על נויטרופילים בוגר במח עצם ודם 4, ומחייבת של הליגנדים שלה, CXCL2, CCL5 או CXCL6, בהתאמה, מפעיל נויטרופילים ומקדם ההידבקות שלהם כדי האנדותל ובהמשך, נדידת התאים לרקמות 5-9. CCL2 ו CCL20 למשוך מונוציטים ו Th1 / TH17 תאים 10, המבטאים CCR2 11 ו CCR6 12, בהתאמה. CCR1 ו CCR5, שהביעו תאים מסוגים שונים, כולל תאי T, מונוציטים ומקרופגים 13, לאגד CCL3, CCL5 ו CCL7 והם שהוגברו במהלך MS 14. CXCR3 מתבטא על תאי T ונקשר CCL9, CCL10 וCCL11 15.

אחת האסטרטגיה העיקרית בטיפול טרשת נפוצה היא דלדול של תאי מערכת החיסון או למניעת הסתננות תא החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית. לכן, המצור של קולטני chemokine ספציפית נחקר EAE. אנטגוניזם או מחיקה גנטית של CCR1 16, 17 CCR2, CCR7 18 או CXCR2 19 מפחית פתולוגיה EAE, ואילו אנטגוניזם או מחיקה גנטית של CCR1 20, CCR5 20 או CXCR3 21 לא הפחית את הפתולוגיה. לפיכך, הביטוי של קולטנים chemokine הספציפיים על לויקוציטים הוא חיוני עבור החדירה של האחרון לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת מכתיב את מהלך EAE.

הדלדול של תאי מערכת חיסון הוא אסטרטגית טיפול יעיל בחולי טרשת נפוצה, כי תאי חיסון הסתננו לשחרר ציטוקינים, כגון TNFα, IL-6 ו- IL-1β, אשר, בתורו, לקדם את התהליך הדלקתי או השפלה של נוירונים 22. יתר על כן, וקישוט רכבתאי Th1 תגובתי לשחרר IFNγ, שבתורן גורמות מקרופאגים לשחרר TNFα, IL-1β ו- IL-23.

כתב יד זה מתאר את האינדוקציה של EAE, קביעת חלוקת תא החיסון ואת רמות ציטוקינים (mRNA) ברקמות שונות בעכברים EAE. תאים בודדו בנקודות זמן שונות במהלך המחלה לספק סקירה תלוי זמן של תהליכים דלקתיים אשר בסופו של דבר להוביל להיווצרות הנגע של מערכת העצבים המרכזית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסר אתיקה: הפרוצדורות שלנו מאושרות על ידי ועדת האתיקה של Regierungspräsidium דרמשטט (גרמניה) ולאשר לאומי ותקנות אירופאיות. כל המאמצים נעשו כדי למזער סבלם של בעלי החיים ולהקטין את מספר בעלי החיים המשמשים.

1. דגם EAE

  1. אינדוקציה של המודל EAE
    1. השתמש נקבה בת 13 שבועות 10 עד 129S4 / SvJae × C57BL / 6 עכברים אינדוקציה של EAE.
    2. תן העכברים זריקה תת עורית, לתוך הגב התחתון והעליון, של encephalitogenic MOG 35 - פפטיד 55 (גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין) (200 מיקרוגרם), לתחליב ב 200 μl המלא אדג'ובנט Freund`s (CFA) המכיל שחפת 400 מיקרוגרם Mycobacterium.
      הערה: כביקורת דמה שלילית, שאינו וישכנע מחלה, המשלים של שלם פרוינד המכיל שחפת Mycobacterium, באותו נפח את אותו המסלול, ניתן להשתמש.
    3. Thereafter, ושוב 24 שעות מאוחר יותר, לתת העכברים זריקה intraperitoneal של הרעלן שעלת (ב -0.2 מיקרוגרם הכולל, מדולל μl 200 פוספט שנאגרו מלוחים, PBS). השתמש עכברים שלא טופלו בחומר כקבוצת הביקורת, כדי להיות מסוגל להשוות חולים עם בעלי חיים בריאים.
      הערה: אפשר גם להשרות EAE עם 200 - 300 מיקרוגרם MOG 35 - פפטיד 55, 300 - 500 מיקרוגרם של שחפת Mycobacterium ב CFA ו -0.2 - 0.3 מיקרוגרם הרעלן שעלת בנפח של 0.1 - 0.2 מ"ל לכל זריקה.
    4. החל שבוע לאחר ההזרקה, לבחון עכברים יומיים עבור תסמינים קליניים (ראה שלב 1.2.1)
      הערה: יום של תחילת המחלה משתנה בניסויים שונים, אבל בתנאים במעבדה שלנו, זה הוא סביב יום 11 וכך, כאן יום 14 מוגדר 3 ימים לאחר תחילת המחלה. כל העכברים במחקר הנוכחי פיתחו תסמינים קליניים.
  2. ניקוד של עכברים
    1. לסווג תסמינים קליניים מציונים קלינית כדלקמן:0) לא שלטים 0.5) שיתוק הדיסטלי של הזנב, 1) שיתוק מלא של הזנב, 1.5) זנב רפוי חולשה קלה של רגליים אחוריות, 2) זנב רפוי וחולשה חמורה של רגליים אחוריות, 2.5) זנב צליעה ושיתוק אחד רגל אחורית, 3) זנב ושיתוק רפה של שני רגליים האחוריות, 3.5) שיתוק של שני גפיים אחוריים וחולשה של גפיים קדמיים אחד (עכברים השיגו ציון זה היו מורדם, עולה בקנה אחד עם הנחיות אתיות מקומיות).

2. הכנת תאים בודדים עבור ניתוח cytometry זרימה

הערה: תערובת נוגדן מורכב 1 μl CD45-Vioblue, 2 μl CD8-eFluor650, 0.5 μl CD11b-eFluor605, 0.5 μl F4 / 80-PE-Cy7, 1 μl CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0.5 μl CD11c -AlexaFluor700, 1 μl CD19-APC-H7 ו 1 μl Ly6G-APC-Cy7.

הערה: אם אתה לוקח דם, קשרי לימפה, טחול וחוט השדרה ואז ההליך הוא כדלקמן: עכברים מורדמים עמוק עם שילוב של isoflurane (2% ב carbogen לדקה) ו קטמין (100 מ"ג / ק"ג משקל גוף). הבא לפתוח את בית החזה, להסיר את הדם עם מקל intracardial ו perfuse העכברים intracardially עם PBS קר. ואז להסיר את בלוטות הלימפה ואחריו טחול ולבסוף חוט השדרה. אם אתה לא צריך perfuse העכברים intracardially ואז להרדים את העכברים תחת הרדמה עמוקה ידי luxation של הצוואר.

  1. בידוד של splenocytes
    1. לטשטש עכברים עם שילוב של isoflurane (2% ב carbogen לדקה) ו קטמין (100 מ"ג / ק"ג משקל גוף).
    2. אזור החתך רטוב עם isopropanol 80% כדי למנוע זיהום עם שערות ולפתוח את בית החזה longitudinally, ללא ניקוב לרקמות עמוקות יותר, באמצעות מספריים.
    3. Perfuse עכברים intracardially עם pH קר PBS 7.0 23.
      הערה: הטחול ממוקם ברבע בטן מעולה שמאל מתחת לצלעות. אם רק הטחול להיחקר, האיבר הזה ניתן להסיר לפני זלוף על מנת Retain כל סוגי התאים של עניין.
    4. הסר את הטחול ומנותק כ 1/8 ולשקול אותו. חנות המדגם ב PBS על הקרח.
    5. סוחטים את רקמת הטחול דרך מסננת רשת 70 מיקרומטר (ממוקם מעל שפופרת 50 מ"ל), באמצעות הבוכנה של מזרק 2 מ"ל.
    6. שטוף את הרשת עם 5 מיליליטר PBS. צנטריפוגות ב 1,800 XG במשך 3 דקות. Resuspend גלולה ב 500 μl lysing פתרון.
      הערה: בשלב זה, זה עשוי להיות נחוץ כדי להפוך את תא ההפרש לספור אם, לאחר מכן, שיטה לניתוח FACS חלופי משמש כי אינה מעסיקה חרוזים (ראה סעיף 3).
    7. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהוסיף 500 μl PBS. צנטריפוגות במשך 6 דקות ב 650 XG בטמפרטורת החדר (RT).
    8. חזור על שלב הכביסה עם 500 μl PBS. בטל supernatant, resuspend התא גלולה ב 100 μl אלבומין 0.2% שור (BSA) / PBS, להוסיף 2 μl Fc קולטן 1 (FcRI) חיץ חסימת דגירה במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    9. להוסיף 13 μlתערובת tibody, דגירה 15 דקות ב RT בחושך, להוסיף 500 μl PBS ו צנטריפוגות במשך 6 דקות ב 650 XG ב RT. בטל supernatant.
      הערה: ההליך המכתים של היצרן ממליץ לשטוף יחיד, אבל ירידה נוספת של מכתים רקע עשוי להיות מושגת אופציונלית ידי חזרה על שלב כביסה אחת או פעמים נוספות.
    10. Resuspend התא גלולה ב 500 μl PBS (או אולי למאגר פועל להפרדת חלבון, כדי להקטין clumping התא) ולהעביר אותו אל cytometry הזרימה בצינור. שמור את התאים על הקרח.
  2. בידוד של תאי בלוטה לימפה
    1. לטשטש עכברים עם שילוב של isoflurane (2% ב carbogen לדקה) ו קטמין (100 מ"ג / ק"ג משקל גוף).
    2. חתך באזור רטוב עם 80% isopropanol ולפתוח את בית החזה longitudinally באמצעות מספריים. Perfuse עכברים intracardially עם pH קר PBS 7.0 23.
    3. כדי לבודד את הלימפה מפשעתי, להסיר את העור בזהירות באזור של הייp ולאסוף את הלימפה בקפידה מתוך רקמת שומן עם מלקחיים. לשקול את הלימפה מפשעתי ולאחסן את המדגם ב PBS על הקרח.
      הערה: השתמשנו בלוטות הלימפה מפשעתי במחקרים שלנו כי אל O`Connor et. נמצא כי מספרים גבוהים של מונוציטים מופעל, מקרופאגים, נויטרופילים ותאי T כל נכחו בלוטות הלימפה מפשעתי לאחר אינדוקציה EAE 24.
    4. סוחטים את הלימפה דרך מסננת רשת 70 מיקרומטר (ממוקם מעל שפופרת 50 מ"ל) באמצעות הבוכנה של מזרק 2 מ"ל.
    5. שטוף את הרשת עם 5 מיליליטר PBS. צנטריפוגה ב- 2400 XG במשך 8 דקות. Resuspend התא גלולה ב 100 μl 0.2% BSA / PBS, להוסיף 2 חיץ μl FcRI חסימת דגירה במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    6. להוסיף 13 μl תערובת נוגדנים, דגירה 15 דקות ב RT בחושך, להוסיף 500 μl PBS ו צנטריפוגות במשך 6 דקות ב 650 XG ב RT.
    7. בטל supernatant, resuspend התא גלולה ב 300 μl PBS (או חיץ ריצה מתאים) ולהעביר אותולצינור cytometry הזרימה.
  3. בידוד של תאי דם
    1. הוסף 50 μl 20 מ"מ HEPES 50 דם μl (התייצב עם EDTA) ולהוסיף 500 μl lysing פתרון. דגירה של 10 דקות ב RT ולהוסיף 500 μl PBS. צנטריפוגות במשך 6 דקות ב 650 XG ב RT. בטל supernatant וחזור על השלב לשטוף.
    2. Resuspend התא גלולה ב 100 μl 0.2% BSA / PBS, להוסיף 2 חיץ μl FcRI חסימת דגירה במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    3. להוסיף 13 μl תערובת נוגדנים, דגירה 15 דקות ב RT בחושך, להוסיף 500 μl PBS ו צנטריפוגות במשך 6 דקות ב 650 XG ב RT. בטל supernatant, resuspend התא גלולה ב 300 μl PBS ולהעביר אותו אל cytometry הזרימה בצינור.
  4. בידוד של תאים בחוט השדרה
    1. לטשטש עכברים עם שילוב של isoflurane (2% ב carbogen לדקה) ו קטמין (100 מ"ג / ק"ג משקל גוף).
    2. אזור החתך רטוב עם isopropanol 80% ולפתוח את בית החזה longitudinallyבאמצעות מספריים. Perfuse עכברים intracardially עם pH קר PBS 7.0 23.
    3. להרטיב את אזור החתך על הגב ולעשות שוב חתך אורכי עם אזמל ולהסיר את העור.
    4. חותך את מותני החלק של עמוד השדרה (אשר מעצבב את הגפיים האחוריים) ולשטוף אותו עם מזרק PBS מלא כדי לחלץ את חוט השדרה. לגזור כ 1/3 של חוט המותני, שוקל זה ולאחסן את המדגם ב PBS על הקרח.
    5. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 2 דקות ב 4 °. בטל supernatant, להוסיף 500 פתרון ניתוק התא μl ו HBSS (1: 1). הוסף 3 מ"ג / A collagenase מ"ל ו 1 יחידה / מ"ל ​​DNase אני, decollate את התאים על ידי pipetting חזר למעלה ולמטה ו דגירה במשך 30 דקות עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס ב 400 סל"ד.
      הערה: אם עדיף, השעית התא יכולה להיות מסומנת של זיהום המיאלין פסול הסלולר על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות אשר עשוי לשפר את הרגישות של זרימת cytometry מדידה, ובכך, להפחית autofluorescence רקעד במספר האירועים שצריכים נרכש (ראה סעיף 3.5).
    6. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 2 דקות ב RT. בטל supernatant, resuspend גלולה ב 1 מ"ל 10% עוברית עגל בסרום (FCS) / מדיום חיוני מינימום של Dulbecco (DMEM) ו decollate התאים שוב על ידי pipetting חזר למעלה ולמטה.
    7. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 2 דקות ב RT. חזור על שלב הכביסה.
    8. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל PBS וסוחטים את חוט השדרה דרך מסננת רשת 70 מיקרומטר (ממוקם מעל שפופרת 50 מ"ל) באמצעות הבוכנה של מזרק 2 מ"ל.
    9. שטפו את רשת עם 4 מ"ל PBS. צנטריפוגות ב 1,800 XG 3 דקות ב RT. בטל supernatant, resuspend התא גלולה ב 100 μl 0.2% BSA / PBS, להוסיף 2 מגיב חסימת μl FcRI דגירה במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    10. להוסיף 13 μl תערובת נוגדנים, דגירה 15 דקות ב RT בחושך, להוסיף 500 μl PBS ו צנטריפוגות במשך 6 דקות ב 650 XG ב RT.
    11. בטל supernatant, resuspend התא Pellet ב 500 μl PBS (או חיץ ריצה מתאים) ולהעביר אותו אל cytometry הזרימה בצינור.

.3 ניתוח תזרים Cytometric

  1. לכיל כל הנוגדנים מראש כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים כפי שתואר על ידי Olesch et al. 25.
  2. השתמש חרוזי פיצויים לכידים-נוגדן לפיצוי חד צבע ליצור מטריצות פיצוי מרובים צבעים בהתאם להוראות manufacturer`s.
  3. לשלוט כיול המכשיר יומי באמצעות חרוזים ספציפיים בהתאם להוראות manufacturer`s.
  4. ישירות לפני cytometry זרימת המדידה, להוסיף תקן ספירה מוחלטת תזרים cytometric 30 μl על התאים (לבידוד ראה סעיף 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) כדי לקבוע ספירת תאים מוחלטת. במקום להשתמש חרוזי ספירת התאים ניתן לספור.
  5. קח את דגימות (תאים מן הטחול, בלוטת לימפה ודם: 100,000 אירועים, חוט השדרה: 500,000 אירועים) לתוך cytometer זרימהnd לנתח באמצעות תוכנת התזרים cytometry ספציפית.
    1. פתח את תוכנת תזרים cytometry ולהוסיף FCS 3.0 קבצים על ידי לחיצה על כפתור "הוסף דגימות".
    2. פתח את הקובץ שהתווסף על ידי לחיצה כפולה. התאם את ערוצי ה- X ו- ציר y. לבחירת אוכלוסיות התאים של עניין ליצור שער (ראה איור 4).

4. ניתוח כמותי PCR

  1. בידוד של mRNA ותעתיק לתוך cDNA
    1. חלץ את ה- mRNA מ חוט השדרה המותני (1/3), הטחול (1/8) ובלוטות לימפה מפשעתי ידי כלורופורם-פנול המשקע עם אתנול 26.
      1. לשם כך, homogenize רקמות 1 מ"ל guanidinium תערובת thiocyanate-פנול, דגירה של 10 דקות. הוספת 200 כלורופורם μl דגירה שוב למשך 10 דקות.
      2. אחרי צעד צנטריפוגה (18,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C), לשטוף את השלב מימית העליון הוא עם 500 μl isopropanol צנטריפוגות (18,000 XG במשך 8 דקות ב 4מעלות צלזיוס).
      3. שטוף את הכדור עם 500 אתנול μl ואחרי צעד צנטריפוגה (18,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.), לייבש את גלולת concentrator הוואקום (5 דקות ב 30 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, resuspend גלולה ב 30 מי μl.
    2. כדי לחלץ את ה- mRNA מהדם, צנטריפוגה 500 μl מיוצב EDTA דם (300 XG 10 דקות 4 ° C).
      1. קח את המעיל באפי, המכיל תאי דם לבנים, וכן לדלל ב 1 מ"ל lysing פתרון (150 מ"מ NH 4 Cl, 100 מ"מ NaHCO 3, 0.1 מ"מ Na-EDTA pH 7.4).
      2. לאחר 10 דגירת דקות ב RT, צנטריפוגות התאים ב 650 XG במשך 6 דקות ולאחר מכן לשטוף פעמים עם PBS.
      3. חלץ את ה- mRNA מתאי דם לבן (WBCs) באמצעות ערכה להפקת RNA על פי הוראות היצרן.
    3. בצע סינתזה cDNA באמצעות ערכת לסינתזה cDNA כולל hexamers אקראי על פי הוראות היצרן. השתמש 200 ng mRNA עבור CDNסינתזה.
  2. PCR כמותי
    1. כדי לכמת את כמות של mRNA ספציפי, השתמש 1 cDNA μl, 1 מיקרומטר קדימה / פריימר הפוכה ו DNA פלורסנט מחייב לצבוע פי הוראות היצרן 27. ראה טבלה מס '1 עבור רצפים עבור קבוצות פריימר. מדדו את ערכי ה- CT של-1β IL, IL-6, IL-23, IFNγ, TNFα ו PPIA (איזומראז prolyl peptidyl) באמצעות מערכת PCR כמותי.
    2. כדי לקבוע את ביטוי mRNA ביחס להשתמש בשיטת CT ההשוואתית (מחזור סף) 27.
      1. לשם כך, לנרמל CT-ערכי של גני מטרה לרמות ביטוי PPIA על ידי הפחתת הממוצע CT-ערך של PPIA מן הגן היעד, כפי שתואר במחקרים קודמים (Barthelmes et al. 28, שיפמן ואח '. 29, שיפמן et al. 30). בהמשך לכך, לחשב את מה שנקרא ΔΔCT-ערכים, באמצעות שבו, לנרמל את ערכי ΔCTשל גני המטרה מעכברי EAE לרמת הביטוי של גני המטרה של עכברים שלא טופלו, שוב על ידי הפחתת ΔCT-הערך הממוצע של עכברים שלא טופלו בחומר מן-ערך ΔCT בעכברי EAE.
      2. כדי לקבל את ביטוי mRNA היחסי של גן המטרה, לחשב את היחס לפי הנוסחה הבאה: 2 - ΔΔct.
  3. בחן את הספציפיות של כל צבע יסוד. לקבוע את גודל שבר מוגבר באמצעות ג'ל 2% agarose 31. הגודל שבר מוצג בטבלה 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 נותן סקירה סכמטי של השיטות השונות המתוארות במאמר זה. 1) עכברים לקבל זריקה של MOG 35-55 אנטיגן ולפתח תסמינים קליניים ראשוניים לאחר 10.7 ± 0.3 ימים 28. קורס מחל נציג של עכברי EAE מוצג באיור 1. 2) ברקמות שונות (טחול, בלוטות הלימפה, חוט שדרה המותני) ודם המחולצים עכברים מלאי EAE בנקודות זמן שונות במהלך השלב פרה-הקליני (היום 2, יום 4 , יום 6), במהלך ההתפרצות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המודל EAE המתואר כאן קיבל את עיקר תשומת הלב כמודל של MS והוא משמש באופן שגרתי בבדיקת אסטרטגיות טיפוליות עבור MS 32. מחל העכבר מפגינה הרבה מאפיינים קליניים היסטולוגית של טרשת נפוצה נגרמת על ידי אינדוקצית אוטואימיוניות לאנטיגנים עצבי. סנסיטיזציה לאנטיגנים המיאלין הקשורות בתפקוד מחסום דם מוח ובכך, חדירת תא החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית. ממצאים אלו מראים כי תאי חיסון להגדיל זמני בקשרי הלימפה בשלב החריף. הטחול בתאי T ותאי B להקטין בשלב פרה-הקליני של המחלה. במחזור הדם, תאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MJP היא יועצת ל-Xellia ול-Leo Pharmaceuticals.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קבוצת ההכשרה למחקר של קרן אלזה קרנר-פרזניוס (EKFS) Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) ועל ידי "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" של מדינת הסן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ABI Prism 7500 מערכת זיהוי רצפים Applied Biosystems, אוסטין, ארה"במערכת PCR כמותית
AccutaseSigma Aldrich מינכן, גרמניהA6964פתרון ניתוק תאים
CD3-PE-CF594BD, היידלברג, גרמניה562286
CD4-V500BD, היידלברג, גרמניה560782
CD8-eFluor650eBioscience, פרנקפורט, גרמניה95-0081-42
CD11b-eFluor605eBioscience, פרנקפורט, גרמניה93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700BD, היידלברג, גרמניה560583
CD19-APC-H7 BD , היידלברג, גרמניה560143
CD45-Vioblue Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה130-092-910
CompBeadsBD, היידלברג, גרמניה552843חרוזי פיצוי
קולגנאז Aסיגמא אולדריץ' מינכן, גרמניהC0130
תקן ספירה מוחלטת ציטומטרית Polyscience, Eppelheim, גרמניהBLI-580-10
הגדרת ציטומטר וחרוזי מעקב BD, היידלברג, גרמניה642412
DNase ISigma Aldrich מינכן, גרמניהD5025
EAE KitHooke Laboratories, לורנס, ארה"בEK2110
F4/80-PE-Cy7 BioLegend, Fell, גרמניה123114
ערכת סינתזת cDNA של First Strand Thermo Scientific, שוורטה, גרמניהK1612
Fc קולטן חוסם-1 מאגר Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה130-092-575
תקן ספירה מוחלטת ציטומטרית של זרימהPolyscience, Eppelheim, גרמניה580
תוכנת FlowJo v10 Treestar, אשלנד, ארה"בתוכנת ציטומטריית זרימה
LSRII/Fortessa BD, היידלברג, גרמניהציטומטר זרימה
Ly6G-APC-Cy7 BD , היידלברג, גרמניה560600
Lysing solution BD , היידלברג 349202
Maxima SYBR Green Thermo Scientific, שוורטה, גרמניהK0221צבע מחייב DNA פלואורסצנטי 
ערכת מיני RNeasy Qiagen, Hilden, גרמניהערכת מיצוי RNA74104

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409(2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187(2014).
  13. Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136(2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Experimental Autoimmune EncephalomyelitisMultiple Sclerosis ModelMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freunds AdjuvantPertussis Toxin InjectionLymph Node IsolationSpinal Cord DissectionSpleen Immune CellsFlow Cytometry AnalysisCytokine Expression Analysis

מאמרים קשורים