אנו מדגימים את ההליך לחיסון תוך קנה הנשימה של המופילוס אינפלואנזה לדרכי הנשימה התחתונות של עכברים. זהו כלי שימושי מאוד לחקר מסלולי איתות המווסתים דלקת בדרכי הנשימה במודלים של עכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן אנו מתארים הליך מפורט ביעילות ישירות לספק אינפלואנזה המופילוס לתוך שטחי הנשימה התחתונות של עכברים. אנו מדגימים את הליך הכנת H. בידוד אינפלואנזה, החדרת תוך-קנה נשימה של H. אינפלואנזה לתוך הריאות, אוסף של נוזל שטיפת broncho-מכתשים (BALF), ניתוח של תאים חיסוניים BALF, ובידוד RNA עבור ניתוח ביטוי גני הפרש. הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את תגובת הריאות דלקתית לכל חיידקים, וירוסים או פטריות. החדרה קנה נשימה ישירה היא המועדפת בעיקר על נהלי משאיפת אפים או תרסיס כי זה יותר יעיל מספק את בידוד החיידקים לתוך דרך הנשימה התחתונה עם עמימות פחות.
מבוא
דלקת היא מנגנון חיסון יסוד של הגנה מפני גורמים מזהמים. זה מקדם מיגור פתוגן ותיקון של רקמות אשר ניזוקו. זה גם מקל על שחזור למצב נורמלי בריא 1. עם זאת, דלקת dysregulated מובילה לעיתים קרובות מחלות דלקתיות כרוניות 2. דלקת דרכי הנשימה היא טריגר ראשוני למחלות ריאה שונים כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה פיברוזיס ריאתי 3.
אינפלואנזה המופילוס הלא typeable (unencapsulated) (NTHi) קשורה למחלות ריאה דלקתיות העליון כרונית והתחתון 4,5. זהו המין השולט שבודד את דרכי הנשימה התחתונה של ילדים ומבוגרים עם 4,6,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) של מכון המחקר ביילור.
1. Culturing ללא typeable אינפלואנזה המופילוס (NTHi) ואת הכנת הבידוד
- פלייט NTHi על צלחת אגר שוקולד ולשמור הצלחת הפוכה CO 2 באינקובטור humidified לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. למחרת, התרבות החיידקים במרק עירוי הלב והמוח. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של מרק לתוך צינור 1.5 מ"ל סטרילי.
- צנטריפוגה ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
החדרת Intra-קנה נשימה הביאה מספר גדל במידה ניכרת של לויקוציטים ב BALF (איור 1 א ', פנל משמאל) מ התקנה עם מי מלח. ניתוח ספירת ההפרש של לויקוציטים הראה חדיר נויטרופילים עלו בבירור (איור 1, פנל מימין). הניתוח FACS של התאים BALF עוד חיזק את מספר גדל של נויטרופילים (איור 1B). ניתוח היסטולוגית סעיפים H & E מוכתם של רקמת הריאה והראה הגדילה ודלקות בדרכי הנשימה (איור 1 ג). נתונים אל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בזאת, אנו מתארים הליך ייחודי פולשנית לחסן הריאות של עכברים עם פתוגן ריאות חיידקית. אנו מראים כי הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את הפונקציה של גנים שונים באמצעות עכברים כי חסרים גנים של מסלולי איתות דלקתיים. הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את התגובות הדלקתיות לזיהומי ריאות ויראלית פטרייתי. היתרונות של הליך זה על פני שיטות אחרות כגון אף או שאיפת תרסיס הם (1) בהליך זה, הבידוד פתוגניים מוטמע ישירות דרכי הנשימה התחתונה; (2) את היכולת לשלוט על גודל הבידוד; ו (3) צמצם את הסיכון של חשיפת חייד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לד"ר קרסון הרוד על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למר מינג-הווי זנג ולד"ר מאהש קאתניה ופרשאנט קארה על תרומותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית לסרטן (מענק חוקר מחקר, 122713-RSG-12-260-01-LIB) ומרכז הסרטן סאמונס (מענק פרויקט פיילוט) ל-K. Venuprasad.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת אגר שוקולד | פישר סיינטיפיק | CAS50-99-7 | |
| דקסטרוז נטול מים | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira, Inc | RL-3010 | |
| Deft פתרון מהיר | Sigma | GS500-500ML | |
| מחט מזרק 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| מזרק BD | REF 309602 | ||
| קטטר 20GA | BD | REF | |
| מספריים לניתוח, ישר, באורך 10 ס"מ | kentscientific | INS600393 | |
| מלקחיים לאיריס, משוננים, 10 ס"מ | אורך kentscientific | INS650915 | |
| פינצטה #5 נירוסטה, אורך 11 ס"מ | kentscientific | ||
| 10% פורמלין | פישר סיינטיפיק | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים תחתונים | BD | REF 352058 | |
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| מנוע הדברה גלולה (הומוגיניזר רקמות) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 באר צלחות מיקרוטיטר V תחתון | תרמו | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | דילול עבודה 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | דילול עבודה 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| מאגר ליזה RBC (10X) | Biolegend | 420301 | |
| ערכת כתמי תאים מתים חיים / מתים | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/ CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs צינורות פוליסטירן צינור תחתון עגול | BD | 352052 | |
| פורמלדהיד | Polyscience | 4018 |
מקורות
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
