הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מנהל Intra-קנה נשימה של

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53964

⸱

2 במרץ 2016

 ,  , 
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

במאמר זה

סיכום

אנו מדגימים את ההליך לחיסון תוך קנה הנשימה של המופילוס אינפלואנזה לדרכי הנשימה התחתונות של עכברים. זהו כלי שימושי מאוד לחקר מסלולי איתות המווסתים דלקת בדרכי הנשימה במודלים של עכברים.

תקציר

כאן אנו מתארים הליך מפורט ביעילות ישירות לספק אינפלואנזה המופילוס לתוך שטחי הנשימה התחתונות של עכברים. אנו מדגימים את הליך הכנת H. בידוד אינפלואנזה, החדרת תוך-קנה נשימה של H. אינפלואנזה לתוך הריאות, אוסף של נוזל שטיפת broncho-מכתשים (BALF), ניתוח של תאים חיסוניים BALF, ובידוד RNA עבור ניתוח ביטוי גני הפרש. הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את תגובת הריאות דלקתית לכל חיידקים, וירוסים או פטריות. החדרה קנה נשימה ישירה היא המועדפת בעיקר על נהלי משאיפת אפים או תרסיס כי זה יותר יעיל מספק את בידוד החיידקים לתוך דרך הנשימה התחתונה עם עמימות פחות.

מבוא

דלקת היא מנגנון חיסון יסוד של הגנה מפני גורמים מזהמים. זה מקדם מיגור פתוגן ותיקון של רקמות אשר ניזוקו. זה גם מקל על שחזור למצב נורמלי בריא 1. עם זאת, דלקת dysregulated מובילה לעיתים קרובות מחלות דלקתיות כרוניות 2. דלקת דרכי הנשימה היא טריגר ראשוני למחלות ריאה שונים כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה פיברוזיס ריאתי 3.

אינפלואנזה המופילוס הלא typeable (unencapsulated) (NTHi) קשורה למחלות ריאה דלקתיות העליון כרונית והתחתון 4,5. זהו המין השולט שבודד את דרכי הנשימה התחתונה של ילדים ומבוגרים עם 4,6,7 מחלת ריאות חסימתית כרונית. התגובה הדלקתית לאחר ההדבקה NTHi מתאפיין הגברת הביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת (כגון TNF ו- IL-1β), וזה מתווכת בmitogen y פרוטאין קינאז מופעל (MAPK) גורם-κB גרעיני (NF-κB) באמצעות קולטנים דמוי האגרה (TLRs) 8.

מודלי Mouse הם כלים שימושיים מאוד לניתוח הפתולוגיה הבסיסית של מחלה דלקתית ריאות בגלל הזמינות של קווי גן מחסר שונים. כמה שיטות שימשו לחסן חיידקים חיים / נחלש ומוצרים חיידקים, כולל החדרה אפי ו 9,10 משאיפת תרסיס. הנה, אנחנו מדגימים החדרת תוך-קנה נשימה. למרות בשימוש לעתים רחוקות, גישה זו היא יותר יעילה מאוד לשחזור בגלל המשלוח הישיר של הבידוד אל דרך הנשימה התחתונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) של מכון המחקר ביילור.

1. Culturing ללא typeable אינפלואנזה המופילוס (NTHi) ואת הכנת הבידוד

  1. פלייט NTHi על צלחת אגר שוקולד ולשמור הצלחת הפוכה CO 2 באינקובטור humidified לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. למחרת, התרבות החיידקים במרק עירוי הלב והמוח. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של מרק לתוך צינור 1.5 מ"ל סטרילי.
  2. צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, לבטל את supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBS 1x סטרילי. חזור על פעולה זו פעם.
  3. העברת 100 μl של פתרון מחדש מושעה לתוך 900 μl של 1x PBS ולמדוד את ספיגת התרבות המדוללת ב 600 ננומטר אורך גל ספקטרופוטומטר.
  4. לקבוע את הכדאיות ואת המושבה היחידה להרכיבs (CFUs) של הבידוד על ידי culturing דילולים 1:10 סדרתי על צלחות אגר שוקולד דוגרים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. בהתבסס על הכדאיות CFUs נקבע מהשלב הקודם, להתאים את הבידוד לריכוז סופי של 20 x 10 6 CFU / ml.

2. Intra-קנה הנשימה (זה) החדרה

  1. להזריק את העכבר intraperitoneally (IP) עם 0.1 מ"ל / 10 g משקל הגוף של עכבר עם פתרון 150 מ"ג / מ"ל ​​קטמין + 20 מ"ג / מ"ל ​​xylazine. ההליך צריך להיעשות בשכונה עם מקור אור כדי לשמור על חומו של בעלי החיים.
  2. לצבוט את החלל interdigital של העכבר על מנת לוודא כי העכבר הוא מורדם כראוי.
  3. מניחים את העכבר על גבו. לגלח את האזור הגחון של הצוואר ולחטא עם chlorhexidine ואלכוהול אתיל 70%.
  4. הרם את העור של חלק הגחון העליון של הצוואר באמצעות מלקחיים שיניים חולדה. לעשות חתך קטן (0.5-1.0 ס"מ) מעל התימוס באמצעות אזמללנתח את השריר בזהירות כדי לחשוף את קנה הנשימה.
    1. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G, להזריק לאט 0.05 מ"ל אוויר, ואחריו 0.05 מ"ל NTHi המתקבל בסעיף 1 או מלוחים כביקורת, ואחריו עוד אוויר 0.05 מ"ל. שמור חיה אנכי כ 1 דקות.
  5. סגירת החתך עם דבק כירורגי. שמור את העכבר רוחבי שכיבה וחמה למשך כ -10 דקות.

3. אוסף BALF

  1. להקריב את העכבר על ידי hr 24 נקע בצוואר הרחם לאחר ההדבקה.
  2. פתח את חלל הבטן של העכבר במספריים אנטומיים וחותכים האאורטה הגחון לדמם. לחשוף את החלק הגחוני של הריאה.
  3. לחשוף את קנה הנשימה לצנרר אותו עם קטטר 20 מד. להחדיר 0.8 מ"ל של חיץ BALF (PBS 1x, 0.1% דקסטרוז, 10 הפרין U / ml) לאסוף את שטיפה ידי שאיפה עדינה. חזור על הליך זה שלוש פעמים.
  4. לספור את המספר הכולל של תאים ב 100 μl של השעיה BALF באמצעות hemocytoמטר בהגדלה 10X עם מכתים כחול Trypan.
  5. כן שקופיות עבור מכתים Giemsa שונה. μl Aliquot 100 של BALF לתוך הבארות המתאימות של cytospin ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות. לייבש את השקופיות עבור 10 דקות ו להכתים את התאים באמצעות צביעה גימזה מעודכנת על פי הפרוטוקולים של היצרן.
  6. השתמש התאים הנותרים לניתוח שלאחר מכן, כגון התא מופעל בתפרחת מיון (FACS), מיקרוסקופיה confocal, ביטוי גנים ומערב כתם 11-13.

4. הכנת Histopathology

  1. לניתוח histopathology, להדביק עכברים עם NTHi כמתואר בשלב 2.4. לאחר 24 שעות של זיהום, להקריב את בעלי החיים באמצעות פריקת צוואר רחם. גזור לפתוח את חלל בית החזה במספריים אנטומיים לחשוף את הריאות ואת קנה הנשימה כפי שהוזכר קודם לכן. לאחר מכן, הכנס את הקטטר 20 מד לתוך קנה הנשימה.
  2. מלאו את הריאות עם 2 פתרון agarose חם% מוכנים בפורמלין 4%. פעם הריאות מנופחות לחלוטין, במקום קרח על גבי הריאות כדי לחזק פתרון agarose.
  3. לאחר מכן, להסיר בזהירות את התקע החזה והכניס אותו בתמיסה 50 מ"ל של פורמלין 4% ב 1x PBS עד שהוא יעובד עבור hematoxylin ו eosin (H & E) סעיפים.

5. FACS מכתים תאים בתוך BALF

  1. שים 1 x 10 5 תאים מן הנוזל BALF בצלחת כייל מיקרו 96-גם V-התחתון.
  2. שטפו תאים עם 300 μl של 1X PBS ו ספין קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C.
  3. כתם התאים עם פתרון כתם תא 100 μl 1x PBS (1: 1,000 דילול) לשמור בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
  4. שטפו תאים עם 300 μl של PBS 1x קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C.
  5. שמור את התאים ב 100 μl של חיץ לשטוף FACS [חיץ לשטוף (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, אזיד הנתרן 0.1%] המכיל 1: 100 Fc-בלוק בדילול במשך 15 דקות ב 4 ° C..
  6. תאים צנטריפוגה ב 4000 XG 3 דקות וזורקים supernatant.
  7. תאי כתם עם 100 קוקטייל משטח מכתים μl (1: 100 דילול) במאגר לשטוף FACS למשך 30 דקות ב 4 ° C..
  8. שטפו תאים שלוש פעמים עם 300 μl של חיץ לשטוף FACS ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C.
  9. תקן תאים ב 100 μl של paraformaldehyde 4% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. פעמיים שטפו תאים עם 300 μl 1x PBS ב 400 XG 3 דקות ב 4 ° C מחדש להשעות ב 300 μl של חיץ לשטוף FACS.
  11. להפוך פקדים מכתימים יחיד צבע באמצעות זרימת cytometry חרוזים.
    1. הוסף טיפה אחת של חרוזים לתוך צלחת מיקרוליטר V-התחתון 96-היטב ולשטוף עם 200 μl 1x PBS.
    2. הוסף 1 μl של נוגדן מכתים 100 μl 1x PBS וחרוזים לדגור על טמפ 'החדר למשך 5 דקות.
    3. לשטוף חרוזים פעמיים עם 300 μl 1x PBS.
  12. לנתח שולטת חד מוכתמים ותאים ידי cytometry זרימת 14.

המגון 6. של רקמת הריאה כדי לבודד RNA

  1. לאחר ההדבקה, לאסוף חתיכה קטנה של הריאות (20-40 מ"ג) ולשמור אותו RNA ייצוב מגיב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לשלב הבא.
  2. שטפו את רקמות הריאה ב PBS 1x קר להיפטר של מגיב ייצוב RNA.
  3. הנח את רקמת לתוך המאגר תמוגה המכיל צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה (חיץ תמוגה 1 מ"ל + 10 μl β-mercaptoethanol).
  4. קוצצי הרקמה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מחודדים homogenize באמצעות עלי גלול מנוע אלחוטי עבור 20-40 שניות.
  5. שמור על lysate על קרח למשך 5 דקות ולהמשיך עם צעד 7.1.

בידוד RNA 7. מן הריאות

  1. צנטריפוגה lysate ב 18,000 XG במשך 3 דקות. הסר את supernatant ידי pipetting ובזהירות להעביר אותו צינור 1.5 מ"ל חדש.
  2. הוסף 1 נפח של אתנול 70% על lysate. מערבבים מיד על ידי pipetting ולחכות 2-4 דקות.
  3. העבר עד 700 μl של lysate לעמודה ספין להציבבצינור אוסף 2 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 9,600 XG במשך 15 שניות וזורקים את הזרימה דרך.
  5. להוסיף 350 μl לשטוף חיץ צנטריפוגות קפדני 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
  6. הוסף 80 μl DNase אני ישירות הממברנה טור ספין ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  7. להוסיף 350 חיץ לשטוף מחמירים μl לעמודה ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
  8. הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
  9. הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ ספין על 9,600 XG למשך 2 דקות. מחק את הזרימה דרך.
  10. מניחים את הטור ספין צינור צנטריפוגות הקולקציה החדשה 2 מ"ל ב 9,600 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך.
  11. להוסיף 30-50 מים RNase ללא μl ישירות לעמודת ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG דקות 1. RNA החנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  12. בצע RNA-seq ניתוח 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

החדרת Intra-קנה נשימה הביאה מספר גדל במידה ניכרת של לויקוציטים ב BALF (איור 1 א ', פנל משמאל) מ התקנה עם מי מלח. ניתוח ספירת ההפרש של לויקוציטים הראה חדיר נויטרופילים עלו בבירור (איור 1, פנל מימין). הניתוח FACS של התאים BALF עוד חיזק את מספר גדל של נויטרופילים (איור 1B). ניתוח היסטולוגית סעיפים H & E מוכתם של רקמת הריאה והראה הגדילה ודלקות בדרכי הנשימה (איור 1 ג). נתונים אל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בזאת, אנו מתארים הליך ייחודי פולשנית לחסן הריאות של עכברים עם פתוגן ריאות חיידקית. אנו מראים כי הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את הפונקציה של גנים שונים באמצעות עכברים כי חסרים גנים של מסלולי איתות דלקתיים. הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את התגובות הדלקתיות לזיהומי ריאות ויראלית פטרייתי. היתרונות של הליך זה על פני שיטות אחרות כגון אף או שאיפת תרסיס הם (1) בהליך זה, הבידוד פתוגניים מוטמע ישירות דרכי הנשימה התחתונה; (2) את היכולת לשלוט על גודל הבידוד; ו (3) צמצם את הסיכון של חשיפת חייד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר קרסון הרוד על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למר מינג-הווי זנג ולד"ר מאהש קאתניה ופרשאנט קארה על תרומותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית לסרטן (מענק חוקר מחקר, 122713-RSG-12-260-01-LIB) ומרכז הסרטן סאמונס (מענק פרויקט פיילוט) ל-K. Venuprasad.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת אגר שוקולדפישר סיינטיפיקCAS50-99-7
דקסטרוז נטול מיםThemo ScientificR01300
HeparinHospira, IncRL-3010
Deft פתרון מהירSigmaGS500-500ML
מחט מזרק 20/26G BD(REF305115/175)
מזרק BDREF 309602
קטטר 20GABDREF
מספריים לניתוח, ישר, באורך 10 ס"מkentscientificINS600393
מלקחיים לאיריס, משוננים, 10 ס"מאורך kentscientificINS650915
פינצטה #5 נירוסטה, אורך 11 ס"מkentscientific
10% פורמליןפישר סיינטיפיקCAS 67-56-1
Agarosepeqlab35-1020
5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגולים תחתוניםBDREF 352058
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהLight LabsA-7001-R
Reasy Mini  kit Qiagen74104
מנוע הדברה גלולה (הומוגיניזר רקמות)SigmaZ359971-1EA
96 באר צלחות מיקרוטיטר V תחתוןתרמו2605
1X PBSGibco10010-023
OneComp eBeadseBioscience01-1111-42
CD45.2-APCeBioscience17-0454-81דילול עבודה 1:100
Ly-6G-eFlor 450eBioscience48-5931-82דילול עבודה 1:100
BSAHyCloneSH30574.03
מאגר ליזה RBC (10X)Biolegend420301
ערכת כתמי תאים מתים חיים / מתיםInvitrogenL-34957
EDTA (0.5M)lifetechnologies15575-020
CD16/ CD32 FcBlockBD553142
Facs צינורות פוליסטירן צינור תחתון עגולBD352052
פורמלדהידPolyscience4018
381433 INS600095

מקורות

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376(2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446(2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22(2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA
מנהל Intra-קנה נשימה של
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.