מאמר שיטה

שילוב קרינה זוגית באתרו כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

DOI:

10.3791/53976

⸱

26 במרץ 2016

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתור של ביטוי גני סוגים שונים של תאים במוח למשל, נוירונים, האסטרוציטים, oligodendrocytes, מבשרי oligodendrocyte ו microglia, ניתן הקשה על ידי חוסר נוגדנים ספציפיים ראשוניים או משניים עבור immunostaining. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות את הביטוי של שלושה גנים שונים באותו סעיף המוח באמצעות קרינה כפולה הכלאה באתרו עם שתי חלליות גן ספציפי ואחריו immunostaining עם נוגדן של סגוליות גבוהות המכוונות נגד החלבון מקודד על ידי גן שלישי. Aspartoacyclase (ASPA) הגן, מוטציות של מה שעלולות להוביל מחל חומר לבנה אנושית נדירה - מחלת קנבן - נחשב להתבטא oligodendrocytes ו microglia אבל לא האסטרוציטים ונוירונים. עם זאת, את דפוס הביטוי המדויק של ASPA במוח טרם הוקם. פרוטוקול זה אפשר לנו לקבוע כי ASPA מתבטא קבוצת משנה של oligodendrocytes הבוגרתnd זה יכול להיות מיושם בדרך כלל מגוון רחב של מחקרי דפוס ביטוי גנים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גלייה, אשר הוא התאים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), מהווים oligodendrocytes (תאי myelinating של CNS), מבשרי oligodendrocytes (OPS, הידוע גם בשם "תאי NG2"), האסטרוציטים ו microglia. יש עניין הולך וגובר את הפונקציות של תאי גלייה ותפקידים הפוטנציאל שלהם במחלות נוירולוגיות 1. לדוגמה, מחלת קנבן (CD) היא הפרעה תורשתית ניוונית של מערכת העצבים מתחיל מוקדם בינקות עם leukodystrophy ע"ש וכן אובדן מתמשך של נוירונים, המובילה למוות בדרך כלל לפני גיל 10 2,3. מוטציות בגן Aspartoacyclase (ASPA) שמובילות באופן דרסטי פעילות ASPA 4 ב CD זוהה. ASPA הוא אנזים catalysing deacetylation של N-acetylaspartate (NAA), מולקולה מאוד מרוכז במוח, אצטט שהניבו ו aspartate 5-7. חולי CD רבים מראים רמות גבוהות יותר של NAA בשל חוסר ASPA activity. כמה מחקרים משער כי יצטט נגזרות NAA יכול להיות מקור עיקרי של חומצות שומן / שומנים במוח במהלך פיתוח CD לנבוע ירד סינתזה המיאלין במהלך ההתפתחות שנגרמה על ידי הכישלון של NAA להיות מפורק 3,5,6.

ASPA נמצא בעיקר בכליות, בכבד בחומר הלבן של המוח, ולנוכח התפקיד החשוב של ASPA ב CD, הביטוי התאי של אנזים זה במוח נחקרה על ידי מספר מעבדות. על ידי הסתכלות על הפעילות האנזימטית ASPA במוח, מחקרים קודמים מצאו כי העלייה בפעילות ASPA במהלך התפתחות המוח מקביל את מהלך הזמן של מעטפת המיאלין 8-10. ברמה התאית, מבחני עבור הפעילות האנזימטית וכן הכלאה באתרו (שאני עורך) אימונוהיסטוכימיה (IHC) ניתוחי מראים כי ASPA מתבטאת בעיקר oligodendrocytes במוח אבל לא בנוירונים או האסטרוציטים 11-16. מספר מחקרים מצאו כי ASPA אולי גםלהתבטא microglia במערכת העצבים המרכזית 12,14. אז נתונים כה על הביטוי ASPA ב OPS מוגבלים. על פי מחקר שנערך לא מכבר ובו transcriptomes של תאים מסוגים שונים בקליפת המוח העכבר כולל נוירונים, האסטרוציטים, OPS, oligodendrocytes שהוקמה זה עתה, oligodendrocytes myelinating, microglia, תאי אנדותל, ואת pericytes נותחו על ידי רצף RNA 17, ASPA מתבטא באופן בלעדי oligodendrocytes , בפרט ב myelinating oligodendrocytes (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). למרות המחקרים הללו על דפוס הביטוי ASPA במוח, מספר הוודאות להישאר.

ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי ללמוד דפוסי ביטוי גנים. IHC היא שיטה נפוצה לאיתור המוצר הפונקציונלי (כלומר, חלבון) של ביטוי גנים בסעיפי רקמות. למרות השירות שלה גדול, טכניקה זו יש מגבלות כיישום והספציפי שלה כפופה to הזמינה הספציפי של הנוגדן הצורך. לשם השוואה, שאני עורך יש את היתרון של להיות מסוגל לחשוף את הביטוי של כל גן ברמת mRNA. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית להשתמש כמה בדיקות בו זמנית על מנת למקם ביטוי גני סוגי תאים ספציפיים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשלב RNA קרינה הכפולה הכלאה באתרו עם הקרינה immunolabelling של חלבון. השתמשנו זו קבוצה של טכניקות כדי לבחון את דפוס הביטוי של Aspa במוח העכבר. שיטה זו מאפשרת המחקר המדויק של ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה:
בעלי וטיפול Mouse הם בהתאם לתקנות משרד הפנים בבריטניה והנחיות ועדת האתיקה UCL, עולות בקנה אחד עם בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986 של הממלכה המאוחדת ותקנות תיקון ל -2012.

הערה: כל הפתרונות צריכה להיעשות עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) - מים מטופלים להרוס כל RNase שיורית. לטיפול DEPC, להוסיף DEPC (1 מ"ל לליטר), לנער במרץ עד שכל כדוריות DEPC נעלמו אז החיטוי כדי לבזות את DEPC.

סינתזה 1. RNA Probe

  1. זהירות: בעת טיפול לפוראמיד, ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ולהשתמש בארון בטיחות. הכן חיץ הכלאה: מים ללא יונים DEPC שטופלו עם 50% (v / v) לפוראמיד deionized, 200 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 מ"מ לאא 2 4 PO, 5 מ"מ Na 2 HPO 4, 0.01 מ"ג / tRNA שמרים מיליליטר, 1 × soluti של Denhardtעל, ו -10% w / v סולפט dextran.
  2. בחר שיבוט DNA המכיל את רצף cDNA של הגן של עניין פלסמיד עם היזמים RNA פולימראז. בדוגמה זו, השתמש שיבוט pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), עם T7 ומקדמי פולימראז SP6 רנ"א עבור Aspa (איור 1 משלים).
  3. הכן את ה- DNA פלסמיד לינארית כתבנית.
    1. לגדל את שיבוט DNA, לחלץ את הפלסמיד עם ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה קטן פי פרוטוקול ורצף של היצרן עם T7 ו פריימרים אוניברסלי SP6.
    2. תקציר פלסמיד דנ"א 1,020 מיקרוגרם עם אנזים הגבלה שחותך בסוף '5 של גדיל תחושה של cDNA. בדוגמה זו, השתמש 100 יחידת סאל לי לעכל את הפלסמיד Aspa pCMV-SPORT6-. דגירה של 1.5 שעות ב 37 מעלות צלסיוס
    3. הפעל aliquot קטן על ג'ל agarose לבדוק כי פלסמיד לינארית לגמרי.
  4. לטהר אתהפלסמיד לינארית באמצעות כלורופורם פנול.
    1. להוסיף 1/10 נפח של נתרן אצטט M 3, כרך אחד של 10 מ"מ טריס HCl (pH 8.0) - פנול equilibrated ונפח אחד של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (רש"ת) (24: 1).
    2. צנטריפוגה ב XG 16,000 דקות 1 ב RT (20 - 25 ° C, RT) ולחלץ בשלב מימי עליון.
    3. להוסיף נפח אחד של כלורופורם / רשות עתיקה, צנטריפוגות ב XG 16,000 דקות 1 ולחלץ בשלב מימי עליון.
    4. חזור על שלב 1.4.3.
    5. מוסיפים 2 כרכים של אתנול ולהשאיר ב -20 o צלזיוס במשך שעה 1. או O / N.
    6. צנטריפוגה ב XG 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בטל supernatant.
    7. שטפו את הכדור עם אתנול קר 70% מחדש להשעות ב cDNA approximatively 1 מיקרוגרם לכל 2.5 μl ב TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5).
  5. לסנתז את שתי בדיקות, אחת שכותרתו עם Digoxigenin (DIG) והשני עם isothiocyanate והעמסת (FITC).
    1. בחר את RNA פולימראז המתאימה לעשות את-se אנטיחללית NSE (משלימה היעד mRNA). בדוגמה זו, השתמש RNA פולימראז T7 לעשות בדיקה Aspa.
    2. הכן בתגובה שעתוק במבחנה: להוסיף 1 מיקרוגרם של ה- DNA לינארית, 4.0 μl 5 חיץ שעתוק x, 6.0 μl של 100 מ"מ DTT, 2.0 μl של 10x תערובת תיוג RNA DIG או FITC dNTPs המכיל, 1 מעכב RNase μl, ו 20 - 40 יחידות של RNA פולימראז; להפוך את עוצמת הקול הסופי עד 20 μl במים שטופלו DEPC.
    3. לדגור על 37 מעלות צלסיוס במשך 1.5 שעות.
  6. μl Run1 של תגובת השעתוק על ג'ל agarose 1.0% לבדוק שהתגובה עבדה. הג'ל צריך להראות את התבנית לינארית להקה בהירה של החללית.
  7. הפוך את עוצמת הקול עד 100 μl עם חיץ הכלאה ולאחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C.

2. זלוף, קיבוע אוסף רקמות

  1. זהירות: בעת טיפול paraformaldehyde (PFA), הן מוצקותמימית, ללבוש PPE ולהשתמש בארון בטיחות. כן פתרון פורמלדהיד ידי המסת 4% (w / v) PFA לתוך 1x בופר פוספט (PBS) פתרון באמצעות חום (55 מעלות צלזיוס). סנן פתרון פורמלדהיד עם נייר סינון.
  2. כן תמיסת סוכרוז על ידי המסת 20% (w / v) סוכרוז במים מזוקקים ולהוסיף 0.1% (v / v) פתרון DEPC. השאר O ​​/ N ב RT עם מכסה רופף ולאחר מכן חיטוי.
  3. סופני לטשטש עכבר ידי הזרקה תוך הצפק של pentobarbitone (50 מ"ג / ק"ג). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה מצביע הרדמה עמוקה.
  4. לאחר העכבר הוא בהרדמה עמוקה, עושה חתך מתחת לבית החזה וחתך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים, להרים אותו כדי לחשוף את הלב.
  5. הכנס מחט 25-G לתוך החדר השמאלי של הלב. ביצוע חתך קטן העלייה הימנית של הלב.
  6. Perfuse החיה עם 20 מ"ל PBS ולאחר מכן 40 בתמיסת פורמלדהיד מ"ל. עבור P30 ומעלהעכברים, השתמש שיעור זלוף של 12 מ"ל / דקה אלא גם לבעלי חיים צעירים להשתמש בשיעור נמוך יותר (7 - 10 מ"ל / דקה).
  7. מנתח את המוח.
    1. לנתק את ראש העכבר עם מספרי כירורגיות על ידי יצירה אחורית לחתוך מהאוזניים. ביצוע חתך קו אמצע זנב בעור ולעבוד rostrally להסיר את העור מפני גולגולת.
    2. החל מחלק הזנב, לחתוך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו אמצע בין העיניים עם מספרי איריס. הסר את הקודקודית וצלחות עצם הפרונטלית ידי הטיית צד אחד של לוחית עצם בכל פעם ומאכל את זה עם פינצטה.
    3. בעדינות להטות את המוח כלפי מעלה מהחלק הקדמי עם פינצטה וחותכי עצבי הראייה ואת עצבי גולגולת אחרים. הרם בעדינות את המוח מתוך הגולגולת.
  8. מניח את המוח לתוך מטריצת מוח עטרת עכבר. פורסים את המוח לחתיכות 3 כ 4 מ"מ עם סכין גילוח נוצה.
  9. מעבירים את פרוסות לתוך פתרון 4% PFA דגירה O / N ב 4 ° C.
  10. מוח העברהפרוסות DEPC שטופלו 20% תמיסת סוכרוז דגירה O / N ב 4 ° C
  11. מניח כל פרוסת מוח לתוך cryomould יבש, להקיף עם מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר) ו הקפאת קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.

3. Cryosectioning

  1. חותכים 15 מיקרומטר חלקים של הרקמה הקפואה בתוך cryostat ולאסוף את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. במידת הצורך, להרטיב את החלקים עם PBS DEPC שטופלו ולשטח אותם עם מכחול בסדר.
  2. השאר את השקופיות להתייבש במשך כ 1 hr על מנת להבטיח כי הרקמה שומרת על השקופית.

הכלאה 4.

  1. הכן 65 ° C לשטוף חיץ: 150 מ"מ NaCl, 15 מ"מ Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= נתרן ציטרט מלוחים 1x), 50% (v / v) לפוראמיד ו -0.1% (v / v) Tween- 20.
  2. הכן חיץ MABT: 100 חומצה maleic מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 0.1% (v / v) Tween-20, pH 7.5.
  3. לדלל את שתי חלליות (DIG שכותרתו FITC-Labelleד) 1 / 1,000 במאגר הכלאה מחומם מראש ל 65 מעלות צלזיוס ומערבבים היטב.
  4. החל בסביבות 300 μl של תערובת הכלאה על כל שקופית, coverslipwith אפויים בתנור (200 מעלות צלסיוס) coverslips דגירה O / N ב 65 מעלות צלזיוס בתא humidified.
  5. העברת שקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל חיץ לשטוף מחומם מראש. שטפו את השקופיות למשך 30 דקות פעמיים ב 65 מעלות צלזיוס עם חיץ לשטוף.
  6. שטפו את השקופיות עבור 10 דקות שלוש פעמים עם MABT ב RT.

ויזואליזציה 5. של החללית FITC

  1. הכין חיץ חסימה שאני עורך: MABT עם מגיב חסימת 2% ו -10% בסרום כבשי חום מומת.
  2. אופציונלי: להשתמש בעט הידרופובי לצייר עיגולים סביב קטעי רקמה בשקופית כדי לצמצם את היקף פתרונות נוגדנים הנדרשים.
  3. דגירה השקופיות במשך שעה 1 ב RT עם ISH חיץ חסימת בתא humidified.
  4. דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם peroxidase חזרת (POD) - המצומדנוגדן אנטי FITC ד בדילול 1/500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ.
  5. מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל PBS עם 0.1% (v / v) Tween-20 (PBST). לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות ב PBST ולהחליף PBST טרי בכל פעם.
  6. מיד לפני השימוש, להכין את tyramide ניאון על ידי דילול 100 פעמים לתוך diluent הגברה. בדוגמה זו, השתמש FITC-tyramide.
  7. הוסף את זה את השקופיות ולהשאיר למשך 10 דקות ב RT.
  8. מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin לשטוף 3 פעמים ב PBST במשך 10 דקות.

ויזואליזציה 6. של החללית DIG

  1. כן 0.1 M כמה העצוב HCl pH 8.2.
  2. דגירת השקופיות עם חיץ חסימה שאני עורך עבור שעה 1 ב RT.
  3. דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם phosphatase אלקליין (AP), מצומדות נוגדן אנטי DIG בדילול 1/1500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ.
  4. לשטוף עם MABT במשך 10 דקות שלוש פעמים.
  5. שטפו פעמיים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 במשך 5 דקות ב RT.
  6. מייד לפני השימוש, להכין פתרון אדום מהיר על ידי המס את הטבליות 0.1 M טריס pH 8.2. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
  7. דגירת השקופיות ב 37 ° C עם פתרון אדום מהיר בתא humidified. ככל שהזמן לפיתוח אופטימלי משתנה, לבדוק את השקופיות באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח על היווצרות של המשקע. בדוגמה זו, לעצור את התגובה לאחר 2 - 3 שעות.
  8. לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים.

7. אימונוהיסטוכימיה

  1. הכן חיץ חסימת IHC: 10% (V / V) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ב PBST.
  2. דגירה שקופיות עם IHC חסימת חיץ במשך שעה 1 ב RT בתא humidified.
  3. הכין נוגדן ראשוני: לדלל את הנוגדן הראשוני על דילול מתאים ב PBST עם 5% בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני). בדוגמה זו, השתמש נוגדן אנטי Olig2 הארנב 1/400 (v / v) דילול.
  4. מדגירים את הפתרון נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N.
  5. לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים.
  6. כן נוגדנים משני: לדלל נוגדנים משני fluorophore מצומדות ב דילול מתאים ב PBST עם 5% (v / v) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ו -0.1% (v / v) Hoechst 33258. לדוגמה זה , להשתמש חמור ארנבת אנטי Alexa647 נוגדנים משני ב 1 / 1,000 (v / v) דילול.
  7. מדגירים את הפתרון נוגדנים משני ב RT עבור שעה 1.
  8. לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים.

שמה 8.

  1. חלקית לייבש את השקופיות ב RT, ולעגן עם הרכבה בינוני קרינה. השאירו את השקופיות להתייבש ואז התמונה מיקרוסקופ confocal תחת 10X, 20X ו 63X מטרות באמצעות 4 ערוצים שונים עם אורכי גל עירור הבאים: 570 ננומטר עבור Fast האדום, 488 ננומטר עבור FITC, 647 ננומטר עבור immunolabelling Olig2 ו -350 ננומטר עבור Hoechst .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה עבור ISH קרינה כפולה ואחריו immunolabelling בסעיפים במוח עכבר. להלן תיאור קצר של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. הצעד הראשון היה לסנתז בדיקות ספציפיות כדי Aspa ו MBP (חלבון המיאלין הבסיסי). כדי לבדוק כי הבדיקות היו מסונתזות, aliquot קטן של כל תגובה נדרס על ג'ל agarose. התבנית ליניארי הקלושה וכמות גדולה של חללית RNA ניתן לראות (איור 2). שאני עורך הקרינה זוגי Aspa ו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק הליך צעד-אחר-צעד עבור RNA כפול הכלאה באתרו ואחריו immunostaining. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לאשר Aspa מתבטא oligodendrocytes בוגרת בכמה אזורים במוח.

יש הליך רב שלבים זה בעיות פוטנציאליות רבות שיכולים להשפיע רגישות וכן יש להימנע. ראשית, כל הפתרונות ואת מאגרים לאחסון התגובה שעתוק צריך להיות RNase חינם. שנית, הבחירה של תבניות cDNA חשובה ואנחנו מעדיפים תבניות כ 1KB באורך. יש צורך לנק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדות המחברים נתמכה על ידי מועצת המחקר הבריטית לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/J006602/1 ו-BB/L003236/1), קרן וולקאם (WT100269MA) ומועצת המחקר האירופית (ERC, תוכנית "רעיונות" 293544). SJ נתמך על ידי מלגה ארוכת טווח של EMBO. המחברים מודים לסטיבן גרנט על עזרתו הטכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
QIAprep MiniprepQiagen27104
פורממיד דה-יוניםSigmaF9037לחסימת ISH מאגר
נתרן כלוריSigmaS3014
Trizma BaseSigmaT1503
חומצה הידרוכלוריתVWR International20252.290
נתרן פוספט חד בסיסינטול מיםSigmaS8282
נתרן פוספט די-בסיסי דיהידראטסיגמא30435
שמרים tRNARoche10109495001
50x הפתרון של דנהרדטLife Technologies750018
דקסטרן סולפטסיגמאD8906
Aspa cDNA שיבוטמקור BioscienceIRAVp968C0654D
SalIניו אינגלנד BiolabsR0138
נתרן אצטטסיגמאS2889
פנול מאוזןסיגמאP4557
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'C2432
אלכוהול איזואמילאולדריץ'496200
אתנולVWR International20821.321
T7 RNA פולימראזPromegaP4074
מאגר שעתוקPromegaP118B
100 mM DTTPromegaP117B
UTP-DIG NTP mixRoche11277073910
RnasinPromegaN251B
ParaformaldehydeSigmaP6148
נייר סינוןפישר מדעי005479470
סוכרוזסיגמא59378
דיאתיל פירוקרבונטסיגמאD5758
פנטוברביטוןAnimalcare בע"מBN43054
מספריים לניתוחמכשירים מדויקים בעולם15922
25 מד מחטTerumo300600
משאבה פריסטלטיתCole-Parmer Instrument Co. LtdWZ-07522-30
מספריים איריסWeiss103227
מס' 2 פינצטהWorld Precision Instruments500230
Coronal Brain MatrixWorld Precision InstrumentsRBMS-200C
סכין גילוחPersonna MedicalPERS60-0138
OCTרקמות4583
Cryostat/microtomeBright
Superfrost פלוס שקופיותThermo ScientificJ1800AMNZ
נתרן ציטראטSigmaS4641עבור 65 מעלות; מאגר כביסה C
FormamideSigma-AldrichF7503
Tween-20Sigma-AldrichP1379
CoverslipsVWR International631-0146
Coplin JarSmith Scientific Ltd2959
מגיבחוסם Roche11096176001
סרום כבשים מושבת בחוםסיגמאS2263
עט הידרופוביCosmo BioDAI-PAP-S1:500
α-FITC POD נוגדן מצומדRoche11426346910
TSA™ בנוסף מערכת פלואורסצאיןPerkin ElmerNEL741001KT1:1,500
α-DIG מצומדAP Roche11093274910
טבליות אדומות מהירותRoche11496549001.22
µ M filterMillexSLGP033RS
α-Olig2 נמלה ארנבMilliporeAB9610
Alexa Fluor® 647-מצומד &אלפא ארנב נוגדןLife technologiesA-315731:1,000
bisBenzimide H 33258sigmaB2883
הרכבה בינוניתDakoS3023
Leica SP2 קונפוקלי מיקרוסקופLeica
בינוניות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  2. Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
  3. Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
  4. Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
  5. Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
  6. Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
  7. Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
  8. D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
  9. Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
  10. Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
  11. Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
  12. Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
  13. Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
  14. Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
  15. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
  16. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
  17. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים