פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו תסיסנית זחלים

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת אורך נתיב חיפוש מזון של Drosophila melanogaster. אנו דנים בהכנה ובטיפול בחיות ניסוי, כיצד לבצע את הבדיקה ולנתח את הנתונים.

תקציר

פנוטיפ באורך נתיב הזחל תסיסנית הוא צעד הוקם לשמש כדי לחקור את התרומות הגנטיות וסביבתיות וריאציה התנהגותי. את assay נתיב באורך הזחל פותח כדי למדוד הבדלים אישיים התנהגות שיחור מזון, שחוברו ביניהם מאוחר יותר אל הגן מחפש מזון. נתיב באורך זחל הוא תכונה בקיע המאפשר גביית מדגמים גדולים, בעלות מינימאלית, עבור מסך גנטי. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הפרוטוקול הנוכחי עבור assay נתיב באורך הזחל בשימוש לראשונה על ידי סוקולובסקי. הפרוטוקול מפרט כיצד לטפל reproducibly חיות הבדיקה, לבצע את assay התנהגותיים ולנתח את הנתונים. דוגמה לאופן שבו assay יכול לשמש כדי למדוד פלסטיות התנהגותית בתגובה שינוי סביבתי, על ידי מניפולציה האכלה הסביבה לפני ביצוע assay, הוא גם סיפק. לבסוף, עיצוב הבדיקה המתאימה, כמו גם גורמים סביבתיים שיכולים לשנותנתיב באורך זחל כגון איכות מזון, גיל התפתחותית ואפקטי יום נדון.

מבוא

מאז גילוי הגן הלבן במעבדתו של תומאס הנט מורגן בשנת 1910, זבוב הפרות, תסיסנית (ד melanogaster), נעשה שימוש כמודל לחקר את הבסיס המולקולרי ופיסיולוגי של תהליכים ביולוגיים שונים. הפופולריות של ד melanogaster נובעת במידה רבה את כמות מגוון רב של כלים גנטיים. גודלו הקטן של תסיסנית, הקלות היחסית של זמן טיפול קצר הדור להבהיר את זה מודל אידיאלי עבור מחקרים בגנטיקה. לא פחות חשוב הוא היכולת של תסיסנית להפגין רב של פנוטיפים שהביעו אורגניזמים מורכבים יותר כולל יונקים. זה כולל פנוטיפים מורכבים כגון התנהגות העומדים בקו התפר שבין האורגניזם וסביבתו. כפי מחקרים כאלה, התנהגותיים על זבוב הפירות תרמו משמעותית להבנתנו כיצד גנים ואיכות הסביבה מתווכים התנהגות1.

אחד המחקרים הראשונים של ד התנהגות זחל melanogaster נחקרה הבדלים אינדיבידואליים אסטרטגיות ליקוט זחל על ידי מדידת הנתיב-האורכים של זחלים ² בזמן ההאכלה. נתיב באורך הוגדר כמרחק הכולל נסע ידי זחל אחד על השמרים, תוך פרק זמן של חמש דקות. שני זני המעבדה וזבובים מאוכלוסייה טבעית בטורונטו מגוונות בהתנהגויות הליקוט שלהם ולא היה מרכיב גנטי להבדלים אינדיבידואליים-אורך דרך. שני morphs ליקוט הזחל תואר מן הפצות נתיב באורך כמותית והם נקראו רובר ודוגמנית. רוברס להפגין נתיב-אורכים כבר בעוד חוצי שטח גדול יותר ואילו על מצע מזון מאשר יושבים. שימוש assay הנתיב הארוך הזה, דה בל ואח '. ³ מיפה את ליקוט (עבור) הגן שבבסיס ההבדלים ההתנהגותיים הנפרדים כדי במיקום דיסקרטי על chromosome- 2 (24A3-24C5). ד Melanogaster עבור הגן שובט מאוחר ⁴ וגילה להיות חלבון קינאז תלוי cGMP ^5, מאפנן של הפיזיולוגיה וההתנהגות תסיסנית ואורגניזמים אחרים ^6.

כאן נתאר את הפרוטוקול הנוכחי עבור assay נתיב באורך הזחל פותח במקור סוקולובסקי ^2. למרות היבטים מסוימים של assay השתנו לאורך השנים, הרעיון מאחורי העיצוב לא. כמו כן אנו מספקים נתונים כדי להמחיש את הפוטנציאל של assay להעריך תרומות גנטיות וסביבתיות להבדלים אינדיבידואליים התנהגות השיחור של זחלים תסיסנית. את assay נתיב באורך הזחל הוא פשוט, יעיל עדיין חזקים. אדם יחיד יכול לבדוק עד 500 זחלים בקלות בארבע שעות ניתן להשיג תוצאות עם רמה גבוהה של שחזור. פותח במקור כדי לבצע לוקליזציה עבור, זה יכול לשמש מסך גנטי, מיפוי מוקד תכונה כמותית, ובמחקריםשל גן אחר בסביבה אינטראקציות (GxE). יתר על כן, פשטות השחזור שלו הופכים אותו משאב נהדר עבור הוראה לתואר ראשונה.

פרוטוקול

1. הכינו צלחות ענבים בקבוקים Holding לגביית הזחלים

1. כדי להפוך בקבוקים מחזיקים, לחתוך חורים בצד אחד של בקבוקי תרבות 6 עוז לטוס, גדולים מספיק כדי להתאים תקע בקבוקון זבוב לאספקת אוויר (איור. 1D).
2. כדי להפוך צלחות ענבים, להכין 250 מ"ל של מדיום מיץ ענבים (אגר 1.8%, 45% מיץ ענבים, 2.5% חומצה אצטית, 2.5% אתנול) על ידי הרתחת אגר, מיץ ענבים רוב המים, להתקרר עד 70 ºC ( מערבבים תוך צינון), ולאחר מכן להוסיף חומצה אצטית ואתנול ולהביא עד נפח עם מים.
3. השתמש מזרק (בלי מחט) כדי למלא 35 x 10 מ"מ מכסים בצלחת פטרי עד פני השטח של המדיום מיץ ענבים עושה כיפה מעל השפה של המכסה (איור. 1A).
4. חנות צלחות ענבים במיכל לח אטום ב 4 ºC עד השימוש (עד למקסימום של 2 שבועות).

2. הכנת צלחות מזון

1. כן מתכון אוכל לטוס סטנדרטי.
   הערה: ל- Test גידול מזון אפקטים באיכות על-אורך הדרך השתמשנו אוכל לטוס מזין נמוך: 10% סוכרוז, 1.3% אגרו, 0.8% tartrate אשלגן נתרן, 0.1% פוספט monopotassium, 0.05% נתרן כלורי, 0.05% סידן כלורי, 0.05% מגנזיום כלוריד, 0.05% סולפט ferric, 5% שמרים 0.5% חומצה propionic במים; ואוכל לטוס תזונתי גבוה: 1.5% סוכרוז, 1.4% אגר, 3% גלוקוז, 1.5% קמח תירס, 1% נבט חיטה, 1% קמח סויה, 3 מולסה%, שמרים 3.5%, 0.5% חומצה propionic, 0.2% Tegosept ו 1 אתנול% במים. עבור שני מזונות חיטוי הפתרון ומצנן עד 50 ^מעלות צלסיוס לפני הוספת חומצת propionic, Tegosept ואתנול.
2. יוצקים 40 מ"ל של אוכל לטוס לתוך 100 x 15mm צלחות פטרי.
3. מזון חנות צלחות במיכל לח אטום ב 4 ºC עד השימוש (עד למקסימום של 2 שבועות).

3. להכין צלחות מבחן

1. כן 58 x 25 סנטימטר, 6 מ"מ צלחות פרספקס שחור עבות עם 10, בארות עגולות עמוקות 1 מ"מ, 10 סנטימטרי קוטר ומסודר ד 2 x 5esign (איור. 1C) כדי לבדוק על הזחלים.
   הערה: עד 30 זחלים ניתן לבדוק בכל פעם אם 3 או יותר של צלחות פרספקס לעיל זמינים. לחלופין, הזחלים ניתן לבדוק בצלחות פטרי, 10 ס"מ קוטר. אפשרות זו היא הרבה יותר מייגעת ומאפשרת מספרים נמוכים יותר של זחלים להיבדק.
2. השג מפזר 8 ס"מ שחור 39 x, 6 מ"מ פרספקס עבה להפצת להדביק שמרים על צלחות מבחן פרספקס.
3. הכן 100 x 15 מ"מ מכסים בצלחת פטרי להקלטת אורכי נתיב הזחל על ידי הפרדת מכסים מ תחתית מראש.

4. הגדרת אוכלוסיות הורים

1. שמור תנאי גידול קבועים לאורך כל assay כולו (למשל, 25 ºC, לחות 60% ואור 00:12: מחזור כהה על אוכל לטוס סטנדרטי).
2. תרי אוכלוסיית הורים באותו תנאי גידול.
3. אסוף 100 - 150 נשים ו 50 - 75 זכרים מתבגרים אותם במשך 5 ± 1 ימים עבור פוריות אופטימלית.
4. אפשר females וזכרים להזדווג לילה בבקבוק תרבות זבוב 6 גר עם אוכל לטוס סטנדרטי.
5. העברת זבובים לתוך בקבוק האחזקה ולאבטח צלחת ענבים (כמות קטנה של רסק שמרים טריים על צלחת ענבים תקדם ההטלה;. איור 1B) מעל בנייר דבק (. איור 1E).
6. השאירו בקבוקי עומד במהופך (איור. 1F), עם צלחת ענבים בתחתית לאפשר מבוגרים להטיל ביצים על צלחת ענבים.
7. מחק את צלחת הענבים הראשונה לאחר 24 שעות ומניח צלחת ענבים חדשה בבקבוק ההחזקה. זו תהיה צלחת הענבים שממנו הזחלים נאספים למחרת.
   הערה: צלחות ענבים תצטרכנה להיות מסומנות של זחלי 22 שעות לאחר בשלבי קמה, להגדיר צלחות כדי שיוכלו להיות מסומנים מוקדם למחרת (. למשל, להגדיר צלחת בשעה 12 וברורות בשעה 10 בבוקר למחרת). רצוי לבטל את צלחת הענבים הראשונה, כדי למנוע כל ביצים שנקבות שאולי היו הלנה ו that אולי קודם בפיתוח.

5. איסוף L1 (ראשון Instar) הזחלים מן צלחות ענבים

1. סר צלחות ענבים מהבקבוקים 22 שעות אחרי שהם הוקמו ומניחים בצלחת 60 x 15 מ"מ פטרי.
2. מניח צלחת ענבים חדשה עם רסק שמרים טרי על בקבוק ההחזקה.
3. נקה וזורק כל הזחלים מהצלחת הענבים זרע באמצעות בדיקה לנתח.
4. דגירת פינת צלחות ענבים עבור 4 שעות בתנאים סטנדרטיים.
5. לאחר 4 שעות, לאסוף 100 זחלי L1 לכל זן מהצלחות הענבים ומניחים על צלחות אוכל.
   1. מניח זחלים על המזון בעדינות (ללא ניקוב המזון לקבור את הזחלים) ולהימנע צפיפות על ידי הפצת הזחלים פני הצלחת מזון.
6. דגירת צלחות אוכל עד חי בדיקה כ 10 שעות לפני תחילת נדודים.
   הערה: בגיל 25 ºC, 10 שעות לפני נדודים מתאים בדרך כלל עד 72 - 96 שעות לאחר הבקיעה. exacסכום t זמן דגירה צריך להיקבע לפני תחילת הניסוי על ידי איסוף קבוצה ראשונית של זחלים עבור כל זן והקלטת מספר השעות עד תחילת נדודים (זחלי נדודים יעברו מתוך האוכל על הצדדים ואת המכסה של המזון צלחות).
   הערה: במידת הצורך, אותם הורים יכולים לשמש כדי לאסוף הזחלים 3 - 4 ימים של בדיקות על ידי חזרה על שלבים 4.7 עד 5.5. שנה את הסדר שבו זנים מוגדרים ונבדקו על פני ימים, כדי למנוע השפעה כדי הבדיקה על-אורך הדרך. בדוק את אותו זן "שליטה" / זנים בכל יום של בדיקות כדי לשלוט על תופעות יום.
7. אם זנים רבים נבדקים, להתנודד פעמים להגדיר אוסף של הזחלים כדי לאפשר בדיקה של כל זן בנקודת הזמן המתאים בהמשך.

6. מבחן נתיב באורך זחל

1. ממסי שמרי אופה יבשים פעילים במים ביחס של 1: יחס 2 (משקל והנפח). המשחה שמרים סיימה צריכה להיות רזה יותר paבלילת ncake, באופן שכאשר הרמת כף מתוך העיסה, מטפטף ומשאיר מאחורי סרטים על פני השטח של הדבק כי במהירות להתמוסס.
   הערה: העקביות של רסק שהמרים חשובה וצריכה להיות קבוע לאורך כל הניסוי. השמרים המדויק: יחס המים כאמור עלול צריך להיות מותאם בהתאם למותג ו אצווה של שמרים.
2. בעדינות להרים זחלים של המתח הראשון להיבדק מהצלחת המזון באמצעות מברשת צבע.
3. אסוף זחלים בצלחת פטרי לשטוף בעדינות עם מים כדי להסיר את כל האוכל.
   1. במהירות לשטוף זחלים עם 1 - 2 מיליליטר של מים ויבשת זחלי טיפה בעדינות עם מעבדה לנגב כדי למנוע העברה של מים בעת ביצוע הזחלים על צלחת הבדיקה. כדי למנוע לחץ, לשמור זחלים לחים אך לא טבל במים.
4. מסדרים שלושה לוחות מבחן זה לצד זה להגדיר טיימר 5 דקות עבור כל צלחת הבדיקה.
5. החל שמרי משחה זו על גבי צלחות הבדיקה באמצעות המפזר, מורח עליו שכבה דקהאה של רסק שמרים על כל צלחת בדיקה, כך שכל יש הבארות אפילו שכבה של שמרים.
6. בעדינות במקום זחל אחד במרכז כל טוב, החל טיימר 5 דקות לאחר צבת הזחלים הראשונים על כל צלחת. הערה: שלוש צלחות יכול להיעשות בכל פעם, מניב גודל מדגם של יום 30 / זן / בדיקה, עד לסך של 500 זחלים.
7. מניחי מכסת צלחת פטרי על גבי כל טוב.
8. כאשר שעון העצר שנגמר, מבלי להסיר את הזחלים מהצלחת, להתחיל לעקוב אחר נתיב האורכים שהושארו השמרים באמצעות סמן קבע. נתיב-אורכי עקבות באותו סדר כמו זחלים הונחו על צלחות הבדיקה.
   1. בצע מעקב באותה המהירות כמו זחלים הונחו על הצלחות. לקבלת עקביות ניתוח נתונים מאוחר יותר, להשתמש באותו סמן את כל אורכי הנתיב. סמן קבוע מומלץ.
9. חזור על שלבים 6.2 ל 6.8.1 עבור כל זן להיבדק. פיק כל זן מהמזון מייד לפני הבדיקות כדי למנוע תופעות רעבות על רשותבאורך ה.

7. מניעת מזון

1. אם זחלים להיות מקופח מזון לפני הבדיקה, לאסוף זחלים כמתוארים בשלבי 6.2 ל 6.3, אבל פרק הזמן הרצוי מזון חסך מוקדם (למשל., אם זחלים הוא להיות משולל מזון עבור 4 שעות, לאסוף זחלי 4 שעות לפני בזמן הבדיקה).
2. מחלקי זחלים שטפו לשתי קבוצות ומקום הקבוצה מקופח מזון בצלחת 60 x 15 מ"מ פטרי עם אגר 5 מיליליטר 1% לבין קבוצת הביקורת בצלחת פטרי עם 5 מיליליטר מזון רגיל.
3. מניחי משקל על גבי המכסה ההפוכה של צלחות פטרי (זחלים אחרת מסוגלים לזחול החוצה כאשר הוא מחפש מזון).
4. דגירה לתקופה מניעת מזון הוקמה בעבר והמשך עם בדיקה כמתואר בשלבים 6.2 כדי 6.9.
5. אם זנים רבים להיבדק, להתנודד מניעת מזון להתחיל פעמים כדי לאפשר בדיקה של כל זן בנקודת הזמן המתאים.

ניתוח 8. נתונים

הערה: סעיף זה מתאר שיטה לניתוח נתונים באמצעות ImageJ ⁷ או ⁸ פיג'י לעיבוד של אורכי נתיב, למרות שניתן להשתמש בהם תוכנות אחרות.

1. השתמש שולחן האור כדי להעביר את כל נתיב-אורכי לייחס מן מכסים בצלחת פטרי נייר לבן (העפעפיים ניתן לכבס עם אתנול ולעשות בהם שימוש חוזר עבור הקלטה נתיב באורך נוספת).
2. עקוב אחר קו הפניה ישר 50 מ"מ על אחד גיליונות נייר.
3. סרוק את אורכי הנתיב ברזולוציה של 300 dpi ולשמור כמו קבצי תמונת מפה סיביים או TIFF.
4. פתח את קובץ התמונה, בחר את הכרטיסייה "תהליך"> "בינארי"> "הפוך בינארי". ואז תחת הלשונית "תהליך", בחר "בינארי"> "Skeletonize". זה מייצר קו רוחב פיקסל אחד, ללא תלות בעובי של עקבות.
5. ודא שכל באורך נתיב מופיע בשורה האחת רציפה ללא הצלבות.
6. הפרד כל הצמתים באמצעות "li ישרכלי ne "וצביעה לבנת קו (להמשך קיומו של הנתיב ניתן לבדוק עם" כלי מטה "(התחקות), השביל כולו צריך להיות מודגש בצהוב (איור. 2).
7. בחר בכרטיסייה "נתח"> מדידות סט ובחר "היקפית" ו "תווית תצוגה".
8. בחר בכרטיסייה "נתח"> "סולם הגדר" ובחר "הסר סולם".
9. על התמונה, בחר את שורת העיון בלבד, בחר את הכרטיסייה "הנתח"> "חלקיקי נתח" ובחר "צג: מתאר", "צג תוצאות" ו "טבלת תוצאות מנקות". הערה: התפוקה תציג את מספר הפיקסלים התואמים את קו מידת 50 מ"מימ.
10. בחר "נתח" הכרטיסייה> "סולם הגדר" ומלא את מספר הפיקסלים "מרחק בפיקסלים" ואת המרחק המתאים (50 מ"מ) ב "המרחק ידוע".
11. לבסוף, בחר את כל הציורים באורך נתיב של גנוטיפ אחדזמן ת"א, בחר את הכרטיסייה "הנתח"> "חלקיקי נתח" ובחר "תכנית: קווי מתאר", "צג תוצאות" ו "טבלת תוצאות מנקות".
    1. הסר את כל תוויות בכתב או סימונים זרים ברורים (הם יוכרו-אורכי נתיב) בתוך האזור הנבחר על ידי בחירת האזור וממלא אותו לבן.
12. ראייה לבדוק את קובץ הפלט "מתאר" כדי להבטיח את היקפה היו הוברר כראוי. התפוקה תציג אורך נתיב במ"מ לכל ציור נתיב באורך בבחירה. זה ניתן לייצא בקלות גיליון אלקטרוני לנתח אותם באמצעות כל תוכנה סטטיסטית.

תוצאות

הבדלים נתיב באורך של רובר והדוגמנית עבור זנים והשפעת מניעת מזון על-אורך הדרך מומחשים באיור. . 3 נתונים שנאספו במשך שלושה ימים רצופים של בדיקות הראתה שפעת זן משמעותית (F _(1,421) = 351.89, p <2.20 x 10 ^-16;. איור 3 א), עם רכבים נוסעים רחוקים יותר מאשר יושבים. בנוסף לאפקט הזן, היו גם אפקט טיפול מזון משמעותי (F _{(1, 421)} = 461.62, p <2.20 x 10

דיון

את assay-אורך הדרך המפורט כאן מציע מידה חזקה ופשוט של התנהגות שיחור מזון של זחלים תסיסנית. הפרוטוקול כדלקמן המתודולוגיה הכללית המתוארת סוקולובסקי ^2, אבל מאז שופר ביחס ליעילות ובקרות ניסיוני. למיטב ידיעתנו שיטה זו היא השיטה הזמינה רק למדידת נתיב באורך זחל. הנוסח המקורי של השביל באורך הפרוטוקול ^{2, 3, 15, 16} זחלים נבדקו על צלחות פטרי עם שכבה דקה של ממרח שמרים מיושמת עם מברשת, ולאחר מכן כוס מתפשטת מוט. עוד בגירסאות האחרונות של פרוטוקול ^{10, 17} ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
6 אונקיות  בקבוקי תרבות זבובים	פישר סיינטיפיק	AS355
פקקי בקבוקון זבוב	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 מ"מ צלחות פטרי	פלקון	351008
צלחות פטרי 100 על 15 מ"מ	פישר	875712
60 x 15 מ"מ צלחות פטרי	VWR	25384-168
בדיקות ניתוח	אלמדיק	2325-58-5300
שמרים	מדעית	FLY-8040-20F