בניית מודלים לחיזוי הורס של תוכן מרכיב האוכמניות ידי ספקטרוסקופיה האינפרה-אדום הקרוב בהתבסס על מדידות HPLC

סיכום

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבנייה ואימות מודלים לחיזוי לא הרסני של סך הסוכר, סך החומצה האורגנית ותכולת האנתוציאנין הכוללת באוכמניות בודדות על ידי ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום.

תקציר

חיזוי לא הרסני של תכולת המרכיבים של מוצרי החווה שימושי למשלוח ומכירה של מוצרים עם איכויות מובטחות. כאן, ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום משמשת לחיזוי סך הסוכר, סך החומצה האורגנית ותכולת האנתוציאנין הכוללת בכל אוכמניות. הטכניקה צפויה לאפשר בחירה של אוכמניות טעימות בלבד מכל אלה שנקטפו. ספקטרום הספיגה הקרוב לאינפרא אדום של אוכמניות נמדד במצב החזר מפוזר במיקומים שאינם על הגביע. תכולת המרכיבים של אוכמניות שנקבעה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים משמשת לבניית מודלים לחיזוי תכולת המרכיבים מהספקטרום הנצפה. רגרסיה חלקית של ריבועים מינימליים משמשת לבניית הדגמים. יש צורך לבחור כראוי את הטיפולים המוקדמים עבור הספקטרום הנצפה ואת אזורי אורך הגל של הספקטרום המשמשים לניתוחים. אימותים נחוצים עבור המודלים הבנויים כדי לאשר שתכולת המרכיבים צפויה בדיוק מעשי. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבנייה ואימות של המודלים לחיזוי לא הרסני של תכולת המרכיבים באוכמניות על ידי ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום.

מבוא

קרוב אינפרא אדום (NIR) ספקטרוסקופיה מוחלת נרחבת כטכניקה הורסת לנתח תוכן של פרות וירקות מסוגים שונים. ^1,2 הורסות מנתח ידי ספקטרוסקופיה NIR לאפשר המשלוח של פרות וירקות טעימים רק עם איכויות מובטחות. ספקטרוסקופיה NIR כבר הותקנה כדי תפוזים, תפוחים, אבטיח, דובדבן, קיווי, מנגו, פפאיה, אפרסק וכן הלאה לדעת בריקס שלהם שמקביל שתכולת הסוכר הכולל, חומציות, TSC (תוכן מוצק הכולל), וכן הלאה . לאחרונה, דיווחנו היישום של ספקטרוסקופיה NIR להערכת האיכות של אוכמניות. ³ מדד לא רק את תכולת הסוכר הכולל ואת התוכן הכולל אורגני החומצה מתאים חומציות, אלא גם תוכן אנתוציאנין הכולל. אנתוציאנין הוא רכיב ביו אשר מאמינים לשיפור בריאות הציבור. זה נוח לצרכנים אם הם יכולים לקנות אוכמניות טעימות עם הבטחה של תכולת הסוכר שלהם, acidity ותוכן אנתוציאנין.

בספקטרום הקליטה NIR של פירות וירקות, רק להקות קליטה רחבה הם נצפו. הם בעיקר הלהקות בשל סיבים ולחים. למרות הרבה להקות חלשות בשל מרכיבים שונים של היעד הלא תחסל הם נצפו בעת ובעונה אחת, הלהקות הנצפות לא ניתן להקצות אופני תנודה ספציפיים של רכיבים ספציפיים של היעד ברוב המקרים. לכן, הטכניקה המסורתית כדי לקבוע את התוכן של רכיב ספציפי באמצעות החוק של למברט-באר אינה יעילה עבור ספקטרום NIR. במקום זאת, מודלי כיול לחזות את תכולת רכיבי יעד הספקטרום הנצפה נבנו באמצעות chemometrics ידי בחינת המתאם בין הספקטרום הנצפה ואת תוכן המרכיב מתאים הספקטרום. ^4,5 כאן, פרוטוקול לבן ותיקוף המודלים עבור חיזוי של תכולת סוכר הכולל, תכולת חומצות הכולל אורגניות מתאימה acidity, ותוכן אנתוציאנין הכולל של אוכמניות מן הספקטרום NIR מוצג.

איור 1 מציג את תרשים זרימה הכללי לבנות מודלי כיול אמינים ויציבים. דוגמאות של מספר מספיק נאספות. חלקם משמשים לבניית מודלים בעוד האחרים משמשים תיקוף המודלים שנבנו. עבור כל אחד דגימות שנאספו, ספקטרום NIR נמדד, ולאחר מכן מרכיבי היעד מנותחים כמותית עם שיטות אנליזה כימית הרסניות מסורתיות. הנה, כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) משמשת עבור הניתוחים הכימיים של סוכרים, חומצות אורגניות, ו אנתוציאנינים. ריבועים לפחות חלקית (PLS) רגרסיה משמשת לבניית מודלי כיול שבו המתאם בין הספקטרום הנצפה ואת התוכן המרכיב שקבע בדיקות כימיות נבחן. על מנת לבנות מודלים חזקים עם יכולת החיזוי הטובה ביותר, pretreatments של obserספקטרה ved ואת אזורי הגל המשמשים לניבוי גם נבחנים. לבסוף, המודלים שנבנו הן תוקפים כדי לאשר את יכולת החיזוי המספיקה שלהם. בשנות ה אימות, תוכן חזה מהספקטרום הנצפה על ידי המודל בנוי (הערכים החזויים) מושווים עם תוכן שקבע ניתוחים כימיים (הערכים שנצפו). אם המתאם מספיק לא ניתן למצוא בין הערכים החזויים והעירה, מודל הכיול ראוי לעיין מחדש נבנה עד קורלציה די מתקבלת. למרות שזה עדיף להשתמש קבוצות שונות של דגימות לבנייה ותיקוף מודל כפי שמוצג בתרשים זה (אימות חיצונית), דגימות באותה קבוצה משמשות הן להקמת האימות (אימות צלב) כשמספר דגימות אינן גדולות מספיק.

Fתרשים igure 1. תזרים להקמת תיקוף מודל הכיול. הנהלים המוקפים קווים כחולים וירוקים מתאימים, בהתאמה, לבניית מודל כיול והאימות שלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול

1. איסוף של דגימות

1. החלט אילו זנים ייכלל היעד של מודל הכיול.
2. אסוף מספר מספיק וסוגים שונים של אוכמניות מדגם של זני היעד.
   1. אסוף רצוי 100 אוכמניות לבניית מודל הכיול, ולפחות 10 עבור תיקוף המודל הבנוי. על מנת לבנות מודלים חזקים, לאסוף דגימות מסוגים שונים, כלומר עם צבעים שונים, גדלים בתנאים בשלים שונים.
3. לשקול כל אוכמניות. הערה: המשקולות נמדדות משמשות מאוחר יותר לחישוב אחוזי תוכן של מרכיבים של כל אוכמניות.

2. מדידות של ספקטרה

1. ספקטרופוטומטר התחממות מספיק (יותר מ 1 hr) לפני המדידות לקבל ספקטרום אמין.
2. הגדר את ספקטרופוטומטר. ודא כי התנאים הם קבועים לאורך כל המדידות.דוגמה טיפוסית תנאי למדידות היא כדלקמן.
   1. הגדר את טווח של מדידות כדי 12,500-3,600 ^-1 ס"מ.
   2. הגדירו את רזולוציית רפאים 16 ס"מ ^-1.
   3. הגדר את ההצטברות ל -32 פעמים.
3. בחר החזרה מפוזרת כמצב של מדידה.
4. שים את רפלקטור הרגיל על החלון של ספקטרופוטומטר למדידות החזרה מפוזרות. באמצעות "ערוץ יחיד רקע" הפקודה, למדוד את ספקטרום רקע המשמש באופן אוטומטי לחישוב ספקטרום החזרה ביחס הספקטרום של אוכמניות מדגם נמדד לאחר מכן.
5. שם מדגם אוכמניות במרכז החלון של ספקטרופוטומטר למדידות החזרה מפוזרות. באמצעות הפקודה "יחיד ערוץ מדגם", למדוד ספקטרום של כל אוכמניות רצויות בכמה נקודות של הפרי.
   הערה: ^6,7 טרנספורמציה Kubelka-מונק גם יבוצע אוטומטיתmatically עבור הספקטרום הנצפה של אוכמניות מדגם אם התנאי של רכישת ספקטרלי מוגדר לעשות זאת. Kubelka-מונק שינוי משנה את הספקטרום הנמדד במצב ההחזרה המפוזר על הספקטרום המקביל לאלו שנמדדו במצב ההולכה דרוש הניתוחים של ספקטרום עם דיוק גבוה. ספקטרה בהיקף הספיגה משמשת ניתוחים.
6. חשב את ספקטרום הממוצע של הספקטרום של כל דגימה באמצעות תוכנית עיבוד נתונים כגון MS Excel אם ספקטרה מדגם אוכמניות נמדדים במספר נקודות. השתמש הספקטרום בממוצע עבור ניתוחים.

Pretreatment 3. מדידות HPLC של סוכרים אורגני חומצות ⁸

הערה: חלץ סוכרים וחומצות אורגניות של כל אוכמניות, אשר מסיסים במים, עם מי ultrapure כדלקמן. השלם של כל אוכמניות משמש עבור ניתוחים.

1. שמור על האוכמניות במקפיא מתחת -30 ° C מוכנים FOכימי r מנתח אם הם אינם מנותחים רק לאחר מדידות ספקטרליות.
2. חותך אוכמניות למספר חלקים כך שהוא יכול להיות הומוגני בקלות בשלבים הבאים. חותך את האוכמניות ללא הפשרה כאשר הוא קפוא.
3. לשים את החתיכות לתוך מבחנה 50 מ"ל.
4. להוסיף בקירוב 10 מ"ל מים ultrapure (מים מזוקקים אשר מוליכות חשמלית פחות מ -0.1 מיקרו-שניות / ס"מ) אל מבחנה.
5. מחמם את אוכמניות קיצוץ מי ultrapure במיקרוגל במשך 20 שניות כדי לבטל את האנזימים שעשויים לפרק סוכרים במהלך הניתוחים.
6. להוסיף בערך 10 מ"ל מי ultrapure אל המבחנה.
7. Homogenize את התערובת במשך 5 דקות ב 12,000 סל"ד עם homogenizer מצויד פיר גנרטור סטנדרטי.
8. צנטריפוגה תערובת הומוגני במשך 10 דקות ב 3000 סל"ד (2,000 גרם ×).
9. אסוף תסנין ידי סינון ואקום של המדגם centrifuged באמצעות מסנן נייר 5B.
10. חזור על השלבים 3.6-3.9 פעמיים על הסינון דואר שאריות לאסוף את כל סוכרים וחומצות אורגניות, ולשלב את כל filtrates.
11. מדדו את רמת החומציות של תסנין ולהתאימו 7 עם חומצה הידרוכלורית לדלל (0.1 ו 0.01 mol ל ^-1) לדלל תמיסות מימיות של נתרן הידרוקסידי (0.1 ו 0.01 mol ל ^-1).
12. לדלל את תסנין 50 מ"ל עם מים ultrapure.
13. מחלקים את המדגם לשתי; אחד לניתוח סוכרים והשני לניתוח חומצות אורגניות.
14. להעביר את הפתרון מדגם הראשון בין עמודות (שני C18, CM ו QMA) המחוברים בטור להוציא פיגמנטים, קטיונים, ואניונים. זרוק את 1 המ"ל הראשון של הפתרון המדגם מהטורים. ואז להשתמש בפתרון המדגם מהטורים לניתוח סוכרים על ידי HPLC.
15. להעביר את הפתרון מדגם השני באמצעות עמודות (שני C18 ו- CM) המחוברים בטור להוציא פיגמנטים קטיונים. זרוק את 1 המ"ל הראשון של הפתרון המדגם מהטורים. ואז להשתמש בפתרון מדגם גolumns לניתוח חומצות אורגניות על ידי HPLC.
16. צנטריפוגה כל פתרון מן הצעדים 3.14 ו 3.15 ב 6,600 סל"ד (5,800 גרם ×), במשך 10 דקות ב microtube המצוידת במסנן 0.45 מיקרומטר עם צנטריפוגות מיני לפני הניתוח על ידי HPLC.

4. מדידות HPLC של סוכרים

הערה: במחקר זה, התוכן סכום של סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז של כל אוכמניות נחשב שתכולת הסוכר הכולל. לכן, עקומת העבודה עבור כל אחד משלושה סוכרים מתקבלת ראשונה, ולאחר מכן תוכן הסכום של סוכרים בכל אוכמניות מתקבל. התכנים תקן מדווחים 0.3-0.4% WT (סוכרוז), 3.8-4.8% WT (גלוקוז), ו 4.2-5.3% WT (פרוקטוז). ⁹

1. מדוד כ -200 מ"ג של סוכרוז במדויק, לפזר אותו במים 50 מ"ל ultrapure להכין פתרון סטנדרטי. לדלל 5 מ"ל של הפתרון 50 מ"ל עם מים ultrapure להכין את פתרונות סטנדרטיים השני. כן דומה הדוכן השלישיפתרון ARD מפתרון התקן השני.
2. הכן את פתרונות סטנדרטיים של גלוקוז ופרוקטוז, באופן דומה.
3. מסדרים את מערכת HPLC כדלקמן:
   1. השתמש בעמודת חלחול ג'ל בתנור הטור ב 40 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש במים ultrapure degassed עם קצב הזרימה של 0.1 mL / min כמו eluate.
   3. יש להשתמש בגלאי מקדם שביר.
4. מדוד את הספקטרום HPLC של פתרונות סטנדרטיים על ידי הזרקת aliquot 20 μl לכל מדידה. הערה: כאן, PAC הפתרון משמש תוכנה עבור המדידה.
5. קבל את עוצמת השטח של הלהקה של סוכר על הכרומתוגרמה של כל פתרון סטנדרטי ידי לחיצה על 'מחדש ניתוח' עם הכפתור הימני של העכבר.
6. מגרש בעוצמות באזור נגד הריכוזי המתאים כדי לקבל את עקומת העבודה עבור כל סוכר על ידי רגרסיה ליניארית, שבו המשוואה המייצג את היחס בין עוצמת האזור והריכוז מתקבלת FOr כל סוכר.
7. מדוד את ספקטרום HPLC של פתרונות מדגמים באמצעות הזרקת aliquot 20 μl לכל מדידה.
8. קבל את העוצמות באזור של הלהקות של סוכרים על הכרומתוגרמה של כל פתרון מדגם כפי שתואר לעיל בשלב 4.5.
9. השג את ריכוזי סוכרי הפתרונים באמצעות המשוואות מתאימות עקומות העבודה שהושגו בשלב 4.6.
10. להשיג את הסכום של כל סוכר בכל אוכמניות מריכוזים של הפתרון המדגם המתקבל בשלב הקודם ואת הנפח הכולל של הפתרון המדגם (50 מ"ל, ראה שלב 3.12).
11. השג את כמויות סוכר הכוללות של כל פרי מסיכום התכנים של שלושה סוכרים.
12. השג את תוכן האחוזים של הסוכר הכולל של כל אוכמניות באמצעות המשקל נמדד צעד 1.3.

5. מדידות HPLC של חומצות אורגניות

הערה: במחקר זה, תוכן סכום של חומצת לימון, חומצת quinic, מאליתחומצה, חומצה succinic נחשבים כתוכן חומצה האורגני. לכן, עקומה עובדת עבור כל אחת מארבע חומצות אורגניות מתקבלת ראשונה, ולאחר מכן את תוכן החומצה האורגני בכל אוכמניות נמדדת. התכנים תקן מדווחים 0.42-0.62% WT (חומצת לימון), 0-0.15% WT (חומצת quinic), 0.08-0.23% WT (חומצת מאלית), ו 0.06-0.25% WT (חומצת succinic). ⁹

1. מדוד על 5 מ"ג החומצה ציטרית במדויק, לפזר אותו לתוך מי ultrapure 50 מיליליטר להכין פתרון סטנדרטי. לדלל 5 מ"ל של הפתרון 50 מ"ל עם מים ultrapure להכין את פתרונות סטנדרטיים השני. כן דומה הפתרון הסטנדרטי השלישי מפתרון התקן השני.
2. הכן את פתרונות סטנדרטיים של חומצה quinic, חומצה מאלית, חומצה succinic, באופן דומה.
3. מסדרים את מערכת HPLC כדלקמן:
   1. השתמש בשתי עמודות אניון-חילופי מחובר בסדרה בתנור הטור ב 40 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש degassed 0.1% בתמיסה מימית של זרחתיתחומצה עם קצב הזרימה של 0.02 מ"ל / דקה כמו eluate.
   3. השתמש סט גלאי אולטרה סגול-גלוי ב 210 ננומטר.
4. מדוד את ספקטרום HPLC של פתרונות סטנדרטיים על ידי הזרקת aliquot 20 μl של פתרון סטנדרטי עבור כל מדידה.
5. קבל את עוצמת השטח של הלהקה של חומצה אורגנית על הכרומתוגרמה של כל פתרון סטנדרטי ידי לחיצה על 'מחדש ניתוח' עם הכפתור הימני של העכבר.
6. מגרש בעוצמות באזור נגד הריכוזי המתאים כדי לקבל את העקומה עובדת לכל חומצה אורגנית על-ידי רגרסיה ליניארית, שבו המשוואה המייצג את היחס בין עוצמת האזור והריכוז מתקבלת עבור כל חומצה אורגנית.
7. מדוד את ספקטרום HPLC של פתרונות מדגמים באמצעות הזרקת aliquot 20 μl של המדגם עבור כל מדידה.
8. קבל את העוצמות באזור של הלהקות של חומצות אורגניות על הכרומתוגרמה של כל פתרון מדגם כפי שתואר לעיל בשלב 5.5.
9. השג את הריכוזים של החומצות האורגניות ב הפתרונים באמצעות המשוואות מתאימות עקומות העבודה שהושגו בשלב 5.6.
10. להשיג את הסכום של כל חומצה אורגנית בכל אוכמניות מהריכוזים של הפתרון המדגם המתקבל בשלב הקודם ואת הנפח הכולל של הפתרון המדגם (50 מיליליטר, ראה שלב 3.12).
11. השג את כמות החומצה הכולל אורגנית בכל אוכמניות מסיכום התוכן מארבע החומצות האורגניות.
12. השג את תוכן האחוזים של חומצה אורגנית הכוללת של כל אוכמניות באמצעות המשקל נמדד צעד 1.3.

Pretreatment 6. מדידות HPLC של אנתוציאנינים

1. שמור על האוכמניות במקפיא מתחת -80 ° C מוכן בדיקות כימיות אם הם אינם מנותחים רק לאחר מדידות ספקטרליות.
2. לייבש כל פרי קפוא עם ואקום lyophilizer במשך 12 שעות.
3. חלץ אנתוציאנין מן האוכמניות המיובשות o פתרון מתנול 1%f חומצה trifluoroacetic [משקל של אוכמניות (ז) / נפח של הפתרון (מ"ל) = 1/10] על ידי השארת את התערובת במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
4. צנטריפוגה לחלץ במשך 15 דקות בתוך microtube 2 מ"ל באמצעות ultracentrifuge ב -8 מעלות צלזיוס ו -15,000 סל"ד (21,900 × ז).
5. סנן את תמצית דרך פילטר 0.45 מיקרומטר כדי לקבל את המדגם למדידות HPLC.

7. מדידות HPLC של אנתוציאנינים

הערה: כ -13 אנתוציאנינים סוג כלולים ב- אוכמניות. מאחר וקשה להשיג עקומות עבודה לכל אנתוציאנינים, עקומת עבודה עבור כלוריד O -glucoside cyanidin-3- בלבד, אחד אנתוציאנינים הפופולרי ביותר אוכמניות, מתקבל. העקומה עובדת מוחלת עבור quantifications המשוער של אנתוציאנינים אחרים.

1. מדוד על 1.5 מ"ג כלוריד cyanidin-3- O -glucoside במדויק, לפזר אותו לתוך 10 מ"ל של תמיסת מתנול 1% של חומצה trifluoroacetic כדי prepare פתרון סטנדרטי. לדלל 5 מ"ל של הפתרון 10 מ"ל עם פתרון מתנול 1% של חומצה trifluoroacetic להכין את פתרונות סטנדרטיים השני. באופן דומה, להכין את השלישי ואת ברצף פתרונות סטנדרטיים הרביעי.
2. מסדרים את מערכת HPLC כדלקמן:
   1. השתמש בעמודת שלב ההפוך C18 בתנור טור ב 40 מעלות צלזיוס.
   2. ליישם את שיטת שיפוע באמצעות eluates של חומצה מימית 0.1% trifluoroacetic (א elute) ו -0.5% חומצה trifluoroacetic ב אצטוניטריל (B elute) עם קצב הזרימה של 0.1 mL / min, ואשר היחס בין עליות B elute מ -8% ל -15% במהלך 0-50 דקות לאחר ההזרקה, ומ -15% ל -75% במהלך 50-60 דקות לאחר ההזרקה.
   3. השתמש ניטור גלאי photodiode מערך ב 520 ננומטר.
3. מדוד את הספקטרום HPLC של פתרונות סטנדרטיים על ידי הזרקת aliquot 10 μl לכל מדידה. "פתרון LC" משמש את התוכנה עבור המדידה.
4. קבל את עוצמת השטח של הלהקה שלcyanidin-3- כלוריד O -glucoside על הכרומתוגרמה של כל פתרון סטנדרטי ידי לחיצה על 'מחדש ניתוח' עם הכפתור הימני של העכבר.
5. מגרש בעוצמות באזור נגד ריכוזי המתאים כדי לקבל את עקומת העבודה עבור כלוריד -glucoside O cyanidin-3- ידי רגרסיה ליניארית, שבו המשוואה המייצג את היחס בין עוצמת אזור וריכוז מתקבל עבור כלוריד -glucoside O cyanidin-3-.
6. מדוד את ספקטרום HPLC של פתרונות מדגמים באמצעות הזרקת aliquot 10 μl לכל מדידה.
7. קבל את עוצמת שטח של הלהקה של כל אנתוציאנין על הכרומתוגרמה של כל פתרון מדגם כפי שתואר לעיל בשלב 7.4.
8. השג את הריכוזים של אנתוציאנינים ב הפתרונות באמצעות המשוואה המתאימה עקומת העבודה שהושגו בשלב 7.5.
9. השג את הסכומים של כל אנתוציאנין בכל אוכמניות מהריכוז שהושג הקודםצעד ואת הנפח הכולל של הפתרון המדגם המשמש בשלב 6.3.
10. השג את הסכום הכולל של אנתוציאנין בכל אוכמניות מסיכום התכול שלושת העשרה אנתוציאנינים.
11. השג את תוכן האחוזים של אנתוציאנין הכולל של כל אוכמניות באמצעות המשקל נמדד צעד 1.3.

8. בניית מודלי כיול עבור חיזוי של תוכן המרכיב

הערה: PLS רגרסיה, ^4,5 שהוא סוג של טכניקת רגרסיה מרובה באמצעות הגירסות סמויות, משמש לבניית מודלי כיול עבור כל מרכיב מן הספקטרום נצפה ואת התוכן המרכיב שקבע ניתוחים כימיים. PLS רגרסיה מבוצעת גם עם תוכניות מסחריות או עם תוכניות תוצרת בית. ראה ^5,10 אזכור עבור התהליכים המפורטים של בניית מודלים.

1. לבחון איזו pretreatments עבור ספקטרום נצפה יעיל ביותר עבור מדויקחיזוי חזק.
   1. לבנות מודלים כיול על ידי יישום אחד או שניים של pretreatments הבאים: MSC (תיקון פיזור כפלי), ^1,2,5 SNV (משתנים רגיל רגיל), ^1,2,5 MMN (Min-Max נורמליזציה), COE (קונסטנט אופסט ביעור ), והראשון או החישוב נגזר השני בשיטה SG (Savitzky-Golay). ^1,2,5 לחזות את תוכן המרכיב של האימות להגדיר מן הספקטרום שלהם עם המודלים שנבנו.
      הערה: MMN, קשת הוא מנורמל כך ערכי מינימום ומקסימום להיות 0 ו -1, בהתאמה. בשנת COE, את לתאם של ספקטרום מוסט כך את הערך המינימלי מתאפס.
   2. חישוב מקדם הסבר, R ^2, וסטיית חזוי שיורית, RPD, בין שנצפה וחזה ערכים של האימות להגדיר לבחון איזה pretreatments עבור ספקטרום נצפה הוא היעילות ביותר. בחר את השילוב של pretreatments נותן יותרR ² ו RPD.
2. בדוק אילו אזורי wavenumber הנם אפקטיביים כדי החיזוי המדויק ויציב על ידי יישום, למשל, טכניקת PLS חלונות נעה ¹¹ כדי לחפש האזורים היעילים.
   הערה: ההליך מתאים הסרת אזורי wavenumber שבו ספקטרה אינו מכיל מידע יעיל לתחזיות או מכילים מידע המפריע תחזיות.

אימות 9. של מודלי כיול נבנו

הערה: ראה אזכור ^5,10 עבור התהליכים המפורטים של ותיקוף מודלים שנבנו.

1. לחזות תוכן מרכיב של האימות להגדיר מן הספקטרום שלהם עם דגמי כיול נבנו עם השילוב הטוב ביותר של pretreatments ועבור אזורי wavenumber היעילים לניבוי. ^5,10
2. חישוב R ² ו RPD בין שנצפתה וחזהערכים של סט האימות. ^5,10
3. בדוק אם הקריטריונים הכלליים לביצוע המעשי של מודלי כיול, ^12,13 R ^2> 0.85 ואת RPD> 2.5, מרוצים. שקול מחדש של מודל אם הקריטריונים אינם מרוצים.

תוצאות

תרשים 2 מציג כדוגמה סט של ספקטרום הקליטה NIR של אוכמניות שבו הספקטרום של 70 אוכמניות מוצגים בו זמנית. מאז הלהקות בהחלט להמחאת סוכרים, חומצות אורגניות, או אנתוציאנינים הם לא נצפו בספקטרום NIR, חוק למברט-באר המסורתי אינו ישים לכמת את התוכן המרכיב. לכן, בניית מודלים לניבוי תוכן מרכיב הכרחית.

איור 3 מראה chromatograms ...

דיון

כמה הערות נוספות על הפרוטוקול מתוארים כאן. ראשית, בשלב 1.1, היא מוזכרת להחליט הזנים הכלולים היעד. למרות שניתן לבנות מודלים מכסים אוכמניות מן זנים רבים או מבלי לציין זנים, את דיוק החיזוי עם הדגמים הם לפעמים נמוך בהרבה מאלו עם המודלים עבור זן יחיד עבור זנים מוגבלים. כמו כן יש לציין כי מודלי הכיול צריכים להיות בנויים על אוכמניות מכל אתר ייצור כדי לקבל ביצועי חיזוי גבוהים בגלל אוכמניות שנקטפו באתרי ייצור שונים יש מאפיינים שונים אשר משפיעים על ביצועי חיזוי. ¹

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ספקטרופוטומטר FT-NIR	Bruker Optics GmbH	MPA
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים	Shimadzu Corporation	228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31	לניתוח
		223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31	גלאי מקדם שבירה
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים	Shimadzu Corporation	228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31	לניתוח
		228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31	גלאי אולטרה סגול גלוי
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים	Shimadzu Corporation	228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31	לניתוח
		228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31	גלאי
		228-45009-31
מד	pHMettler-Toledo	30019028	S220, פיצוי טמפרטורה אוטומטי
ציוד לטיפול במים טהורים במיוחד	ORGANO Corporation	ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0	PURELAB אולטרה;
מקפיאים ביו-רפואיים PURELITE	SANYO	2-6780-01	MDF-U338
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד	Panasonic healthcare Co., Ltd.	KM-DU73Y1-80	° C
ואקום ליופילייזר	IWAKI GLASS ושות', בע"מ	119770	DRC-3L; FRD-82M
הומוגיניזר	מיקרוטק ושות', בע"מ	Physcotron
אולטרה-צנטריפוגה	היטאצ'י קוקי ושות', בע"מ	S204567
CF15RXII מיני צנטריפוגה	LMS ושות', בע"מ	KN3136572	MCF-2360
צנטריפוגה	קוקוסאן ושות', בע"מ	2-5534-01	H-103N
נייר סינון	Advantec	1521070	5B, שווה ערך לוואטמן 40
ספטמבר-פאק C18 עמוד	תאגיד ווטרס מילפורד	WAT020515
ספטמבר-פאק עמוד CM	תאגיד ווטרס מילפורד	WAT020550
עמוד QMA ספ-פק	תאגיד ווטרס מילפורד	WAT020545
יחידת מסנן צנטריפוגלי	Merck Millipore Corporation	R2SA18503	PVDF, 0.45 μ m
Microtube	As One Corporation	1-1600-02	PP, מסנן מזרק 2 מ"ל
	GE Healthcare Co., LTD.	6788-1304	עמ', 0.45 μ m
סוכרוז	Wako תעשיות כימיות טהורות, בע"מ	194-00011	מגיב בדרגת
גלוקוז	Wako תעשיות כימיות טהורות, בע"מ	049-31165	מגיב בדרגת
פרוקטוז	Wako תעשיות כימיות טהורות, בע"מ	123-02762	מגיב
חומצת לימון	Wako תעשיות כימיות טהורות, בע"מ	036-05522	בדרגת ריאגנט
	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	355-17971	בדרגת ריאגנט
	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	190-04332	בדרגת ריאגנט
	אלפא אזר, חברת ג'ונסון מאטי	10176328	בדרגת ריאגנט
	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	162-20492
HPLC חומצה טריפלואורואצטית	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	208-02746	מתנול בדרגת ריאגנט
	Wako Pure תעשיות כימיות, בע"מ	131-01826	ריאגנט כיתה
אצטוניטריל	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	015-08633
HPLC כיתה ציאנידין-3-O-גלוקוזיד כלוריד	Wako Pure Chemical Industries, Ltd	306-37661	HPLC-grade
תוכנה לניתוחים	Bruker Optics GmbH	OPUS ver. 6.5
Softoware עבור עיבוד מקדים	של Microsoft	Excel מופעל על ידי Visual Basic for Applications
Software לבניית מודלים		Freemat 4.0	http://freemat.sourceforge.net/