הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54002

⸱

13 במאי 2016

 ,  , 
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

פיברוזיס מתמשך עם שקיעה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוגזמים מוביל לשחמת. שימוש לרעה באלכוהול הוא אחד הגורמים העיקריים למחלת כבד קשה. הקמנו מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול כדי לחקור את המנגנונים והאסטרטגיות לקידום התחדשות הפטוציטים בעת פציעה הנגרמת על ידי אלכוהול.

תקציר

פיברוזיס מתמשך בכבד עם המשך הצטברות חלבון מטריצה חוץ-תאית (ECM) גורם לאובדן היכולת התאית של הכבד, מה שמוביל לשחמת עם תפקוד לקוי של הכבד. בין עלבונות רבים בכבד, שימוש לרעה באלכוהול יכול להוביל לבעיות בריאותיות משמעותיות כולל אי ספיקת כבד וקרצינומה של הכבד. עם זאת, זהותם של מקורות תאיים אנדוגניים המחדשים הפטוציטים בתגובה לאלכוהול לא נחקרה כראוי. יתר על כן, מעט מחקרים דגמו ביעילות את התחדשות הפטוציטים על פגיעה הנגרמת על ידי אלכוהול. לאחרונה דיווחנו על הקמת מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול (EtOH) בדגי זברה שבו תאי אב בכבד (HPCs) הולידו הפטוציטים לאחר אובדן הפטוציטים כמעט מוחלט בנוכחות גירוי פיברוגני. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים באמצעות מודל זה, זיהינו מספר מולקולות קטנות המשפרות את התחדשות הפטוציטים. כאן אנו מתארים בפירוט את ההליכים לפיתוח מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי EtOH ולביצוע מסננים כימיים באמצעות מודל זה בדגי זברה. פרוטוקול זה יהווה כלי קריטי לתיאור המנגנונים המולקולריים והתאיים של האופן שבו הפטוציטים מתחדשים בכבד הפיברוטי. יתר על כן, שיטות אלו יקלו על גילוי פוטנציאלי של אסטרטגיות טיפוליות חדשות למחלת כבד כרונית in vivo.

מבוא

למרות יכולת ההתחדשות המרשימה של hepatocytes 1, שהם סוג תא parenchymal העיקרי של הכבד, אי ספיקת כבד כרונית פוגעת ביכולת הזאת, מה שמובילה תאים ובתאים בכבדים (HPC) התחדשות תלויה 2.

נזק כבד כרונית נגזרת בעיקר שימוש לרעה באלכוהול, וירוס הפטיטיס C כרונית (HCV) 3 ו מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) 4. זה מוביל פיברוזיס כבד מתמשך, אשר מזוהה עם ההצטברות של תאי מטריקס חלבונים (ECM). מתמיד הצטברות ECM מעווה אדריכלות כבדה ללא פגעה על ידי יצירת רקמת צלקתית סיבית 5, לאחר מכן וכתוצאה מכך שחם עם תחלואה ותמותה גבוהות. ניסיונות רבים נעשו כדי למתן את התגובה fibrotic בעיקר על ידי התמקדות מעכב ציטוקינים profibrogenic והופעל myofibroblasts 6. האחרון נגזר בעיקר מתאי stellate כבדים (Hגיל), התאים הלא parenchymal הכבד עקרון אחראי צלקת בכבד היווצרות 4. אף על פי כן, טיפולי משובי מעודדי מקורות הסלולר אנדוגני כולל HPCs להתחדש hepatocytes בנוכחות עלבונות fibrogenic מתמשכים מחכים לחקירה נוספת.

דגמים ניסיוניים רבים סיסטיק הכבד תוארו ביונקים. הזרקה חוזרת ונשנית של פחמן טטרא (CCL 4) כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס כבד מודלים בעכברים וחולדה 7. בשילוב עם תזונה עתירת שומן (HF), אלכוהול הובילה upregulation משמעותית של ביטוי גנים profibrogenic ואת הכבד סיסטיק 8. בעוד steatosis (הצטברות שומנים בדם) הנובעת מחשיפת אלכוהול חריפה, זה הופך את הכבד רגיש פציעה בכבד חמורה יותר 9.

דג הזברה, Danio rerio, התפתחה כמערכת מודל חוליות יסולא בפז ללימוד התחדשות. למרותחוליות אחרות תחתונות כגון סלמנדרות ויש axolotls יכולת מרשימה לרגנרציה הדג הזברה יש יתרונות על פני מערכות מודל אחרות לגבי אסטרטגיות מניפולציה וויזואליזציה גנים הדרושים לביצוע מניפולצית משובי פוטנציאל גורמי 10. דג הזברה גם מייצג מודל חוליות אטרקטיבי ללימוד מחלת כבד אלכוהולית (ALD) פשוט על ידי הוספת אתנול (EtOH) למים שלהם. חשיפה אקוטית EtOH כדי דג הזברה הזחל והבוגר שנגרם steatosis בכבד 11-13. כאשר דג זברה מבוגר זכתה לחשיפת EtOH מורחבת, בתצהיר קולגן נצפה עם גברת ביטוי של גנים הקשורים סיסטיק 14. עם זאת, קיים צורך בפיתוח מודלים ללמוד התחדשות כבדה בתגובת EtOH כגירוי fibrogenic.

לאחרונה, פיתחנו מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה 15. שילבנו מערכת אבלציה הגנטי הספציפי hepatocyte עם טיפול EtOH ב הזחל adulדג הזברה t. יצרנו שני קווים מהונדסים, Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1 ו Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, שבו nitroreductase E.coli (NTR) הם התמזגו ציאן חלבון פלואורסצנטי mCherry, בהתאמה, בשליטה של חומצת השומן ספציפי hepatocyte מחייבת 10a חלבון, אמרגן בסיסי כבד (fabp10a). במערכת זו, NTR ממירה metronidazole prodrug רעילה (MTZ) לתוך סוכן ה- DNA בין-גדיל מקשרים צולב 16, גרימת מוות מפורש של hepatocytes. באמצעות מודל זה, הראינו כי אוכלוסייה של תאים כבדים, אשר מגיבים Notch signaling, מומר hepatocytes בהעדר ליד של hepatocytes וב העודף ECM. אנחנו המיועד תאים אלה HPCs. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים, זיהינו activators מולקולה הקטן של איתות Wnt ומעכבים של איתות Notch שמרחיב התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. Therefoמחדש, המודל הכבד fibrotic שלנו דג הזברה מייצג מערכת סינון הכימי מעולה בהשוואה לתא ביותר בתרבות או מערכת סינון מבוסס יונקים. זוהי מערכה in vivo עם עלות משמעותית והטבות לחיסכון בזמן. כאן אנו מתארים את ההליכים המפורטים להקמת מודל כבד fibrotic נגרם EtOH ועל ביצוע מסכים כימיים באמצעות מודל זה דג זברה. יתר על כן, ניתוחי מנות הזמן בוצעו כדי לחקור כיצד hepatocyte התחדשות מתרחש בכבד fibrotic. פרוטוקול זה יספק כלי רב ערך כדי לחקור את המנגנונים ואסטרטגיות של שיפור התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דג הזברה הועלו וגדל באמצעות פרוטוקול סטנדרטי אשר עונה על הקריטריונים של המכונים הלאומיים לבריאות ואושר על ידי המכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. הכנת פתרונות

  1. הכן מים ביצה 20 L (לסירוגין בשימוש עם "בינוני העובר ') כדי לשמור על דג הזברה הזחל / עובריים. ממיסים 1.5 גרם קאסו 4 ו -6 גרם מלח ים האוקיינוס ​​מיידית ב -250 מ"ל מים מזוקקים. יוצק לתוך קרונית מלאה 20 מי L מזוקק להתסיס.
  2. כן 1 L 1-פניל-2-thiourea (PTU) פתרון מניות (20x). ממיסים אבקת PTU 0.6 גרם ב 1 מים מזוקקים L. הוסף 1 מ"ל של פתרון המניות לכל בינוני 20 מ"ל העובר לריכוז סופי של 0.003% כפתרון העבודה.
    זהירות: PTU עלול לגרום לרעילות מערכתית הבאים משאיפת או חשיפה עורי. להכין ולהשתמש בהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
  3. כן 1 L אתיל 3-aminobemethanesulfonate nzoate (Tricaine) פתרון המניות (20x). ממיסים אבקת 4 גרם Tricaine במים מזוקקים. התאם ל- pH 7 על ידי הוספת 1 M טריס חיץ (pH 9), ולהביא את נפח הסופי עד 1 ליטר עם מים מזוקקים. Aliquot לתוך 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C. להפשיר לפני השימוש.
    זהירות: Tricaine יכול לגרום לאובדן תחושה. להכין ולהשתמש בהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
  4. כן 100 metronidazole זחל מיליליטר (MTZ) פתרון עובד. הפוך 15 טרי פתרון מ"מ MTZ ידי המסת אבקת 0.25 גרם MTZ ב sulfoxide 0.1% דימתיל (DMSO) ב 100 מ"ל בינוני העובר. ממיסים אבקת MTZ לחלוטין על ידי טלטול נמרץ. בצע פתרון MTZ טרי ולהשתמש בנייר אלומיניום, כדי למנוע השפלה photocatalytic של MTZ.
    זהירות: MTZ עלול לגרום לגירוי. להכין ולהשתמש בהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
  5. כן 100 / metronidazole אתנול זחל מיליליטר (EtOH / MTZ) פתרון עובד. בצע פתרון MTZ טרי ולהשתמש בנייר אלומיניום כדי למנוע דה photocatalyticהדרגתיות של MTZ. הוסף 1.5 מ"ל 100% אתנול לתוך 100 מ"ל פתרון MTZ לריכוז סופי של 1.5% רק לפני השימוש.
  6. כן 500 מיליליטר פתרון המבוגר MTZ עובד. הפוך 10 טרי פתרון מ"מ MTZ ידי המסת אבקת 0.83 גרם MTZ ב DMSO 0.1% ב 500 מ"ל מים המערכת. ממיסים אבקת MTZ לחלוטין על ידי טלטול נמרץ. בצע פתרון MTZ טרי ולהשתמש בנייר אלומיניום, כדי למנוע השפלה photocatalytic של MTZ.
  7. הכן חיץ 1 L PEM. ממיסים 30.2 צינורות גרם, 0.74 גרם EGTA, ו 0.12 גרם MgSO 4 במים מזוקקים. התאם ל- pH 7 עם NaOH. תביא נפח סופי עד 1 ליטר עם מים מזוקקים.

2. הכנת זחל דג הזברה

  1. הגדרת ההזדווגות של [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 דג הזברה מבוגר עם Tg (hand2: EGFP) pd24 13 דג הזברה מבוגר במיכלים ההזדווגות. השתמש חוצץ לנהל הזדווגות מתוזמן.
  2. הסר את divider למחרת בבוקר ולאפשר דגים להזדווג ללא הפרעה. עובר קציר 2 hr מאוחר יותר על ידי מאמץ מי מערכת ההעברה העוברים לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי עם מדיום עובר.
  3. לשמור על לא יותר מ -100 עוברים לכל צלחת פטרי. תחת סטראו, להסיר את הביצים מופרות באמצעות פיפטה מזכוכית. לגדול עוברים על 28 מעלות צלזיוס ומוסיפים phenylthiourea (PTU) לריכוז סופי של 0.003% לאחר 10 שעות שלאחר ההפריה (hpf) לעכב התפתחות פיגמנט.

3. אתנול, טיפול Metronidazole וכבד התחדשות ב זחל דג זברה

  1. כן פתרון EtOH טרי ידי הוספת אתנול לתוך מדיום העובר לריכוז סופי של 1.5%. אל תוסיף PTU.
  2. פנקו את העוברים עם פתרון אתנול 20 מ"ל לכל צלחת פטרי 56-80 hpf. מכסי צלחות פטרי בניילון נצמד כדי למנוע אידוי אתנול.
  3. מיין החוצה [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) pd24] הזחלים עם גודל הכבד דומה, כפי שנקבע על ידי ביטוי CFP, ב 80 hpf. אין להשתמש Tricaine בעת מיון הזחלים EtOH שטופלו כי זה יגרום לשיעור תמותה גבוה עם טיפול עוקב EtOH / MTZ. שמור זחלי מיון בצפיפות של 30 עובר לכל צלחת פטרי.
  4. הכן טרי 15 מ"מ MTZ במדיום העובר ב 0.1% DMSO. להוסיף כמות נאותה של EtOH לתוך פתרון MTZ לעשות לריכוז סופי של 1.5%. דגירת זחלים ב 20 מיליליטר פתרון EtOH / MTZ לכל צלחת פטרי במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. מכסים צלחות פטרי בניילון נצמד לשמור על ריכוז EtOH ועם בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
  5. בסוף הטיפול, להסיר פתרון EtOH / MTZ ידי העברת זחלי מנות חדשות פטרי עם מדיום העובר טרי. לשטוף הזחלים 3 פעמים עם המדיום העובר ולשמור אותם ב 20 מ"ל בינוני העובר ללא PTU.
  6. כדי למיין את הזחלים עם אבלציה כמעט מוחלטת של hepatocytes, להתבונן קרינהתחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP בהגדלה של 80x. תוצאות אבלציה מוצלחות קרינת CFP מינימאלית בכבד נפח כבד מופחת באופן משמעותי.
  7. כדי למנוע מוות של הזחלים EtOH / MTZ שטופלו, אין להשתמש Tricaine למיון. תקן את הזחלים עבור immunostaining (ראה סעיף 5) או לשמור זחלי מיון בצלחות פטרי על 28 מעלות צלזיוס למשך ניתוחים נוספים.

4. מסכים כימיים EtOH / MTZ שטופל זחל דג זברה

  1. תביאו את הצלחות 96-היטב המכיל 10 מ"מ מניות כימי DMSO (עיין רשימת חומרים לפרטים בדבר ספריות כימיים מסחריים) מן מקפיא -80 מעלות צלזיוס. מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה photocatalytic של כימיקלים. להפשיר את פתרונות המניות ב RT עם נדנדה עדינה.
  2. הכן פתרונות כימיים על ידי דילול 10 פתרונות מ"מ מניות עם מדיום העובר לריכוז סופי של 50 מיקרומטר (ב 96 צלחות גם: שניות ראשוניותקרין; ב 1.5 מ"ל צינורות: retesting). זחלים שליטים טופלו ריכוזים שווים של DMSO במדיום עובר.
  3. הזחלים העברה עם אבלציה hepatocyte כמעט מלא, אשר טופלו 1.5% EtOH / 15 מ"מ MTZ וממוינת כאמור, על כל אחת 96-היטב (מסך הראשונית) או 24 גם (retesting) צלחות prefilled עם המדיום העובר בצפיפות של 5 זחלים לכל טוב. להשתמש בבארות כפולות לכל כימיקל.
  4. הסר בינוני העובר ולהוסיף או 250 μl (96-גם הצלחות) או 500 μl (24 גם צלחות) תמיסות כימיות היטב כל אחד. אטמים ברדיד אלומיניום ולטפל זחלים במשך 50 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. בדוק זחלים השריית-כימיים יומי וסר זחלים מתים מבארות פרט.
  5. בסוף הטיפול הכימי, להתבונן במספר ו / או עוצמת CFP להביע hepatocytes תחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP בהגדלה של 80x. תמונה בה נראה זחלי חיים משופרים או להפחיתד מספר ו / או עוצמת hepatocytes להביע CFP עם מצלמה דיגיטלית רשומות.
  6. שמור על הזחלים ידי קיבוע פורמלדהיד הדמיה confocal כמתואר בסעיף 5.
  7. כדי לבדוק שוב את הכימיקלים המאפשרים התחדשות hepatocyte במסך הראשוני, לבחון את כוחם בריכוזים גבוהים או נמוכים יותר כדי למצוא את הריכוז היעיל ביותר עם ההליכים המתוארים 4.1-4.5 ( 'retesting').

5. קיבוע דג הזברה הזחל, Immunostaining, והדמיה Confocal

  1. להרדים זחלים ידי הוספת Tricaine לריכוז סופי של 0.02%. העבר 10-15 זחלים אל צינור 1.5 מ"ל ולשטוף פעם עם פוספט שנאגר מלוח (PBS). הסר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של פורמלדהיד מוכן טרי 2% במאגר PEM לתקן O / N ב 4 ° C.
    זהירות: פורמלדהיד גורמת לגירוי ידוע כמסרטן אנושי. טפל במנדף כימי.
  2. בטל תיקון פתרון כראוי ואז ווהsh 3 פעמים עם PBS ב RT. זחלים קבועים יכולים להישמר PBS ב 4 ° C עד כמה ימים. שאמשיך לשלב הבא מייד נותן תוצאות immunostaining טובות יותר.
  3. מוציא בזהירות חלמון עור המכסה את האזור הכבד באמצעות מלקחיים 55 # תחת סטראו.
  4. Permeabilize וזחלים לחסום חיץ בלוק (אלבומין בסרום שור 4% ו -0.3% Triton X-100 ב PBS) O / N ב 4 ° C.
  5. דגירה עם נוגדן אנטי קולגן אני ארנב בדילול של 1: 100 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף (0.3% Triton X-100 ב PBS).
  6. דגירה עם AlexaFluor 647 נוגדן נגד ארנב החמור מצומדות בדילול של 1: 200 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף. לאחר מכן לשטוף פעם אחת עם PBS.
  7. בעדינות להעביר זחלי שקופיות זכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית, וזחלים קבועים אוריינט עם הצד לרוחב השמאל פונה כלפי מעלה. הסרת עודפי Kimwipes באמצעות PBS. הוסף ירידה של תקשורת הרכבה, וזכוכית כיסוי חותמת עם לק. הדמית confocal ניצוח מייד מומלצת מאוד.
  8. השתמש במערכת confocal מצוידת בעדשת שמן 40X / 1.3 ללכוד תמונות. השתמש כוח לייזר 20-50%. צלמו תמונות מחסנית Z ב 1 מיקרומטר במרווחים.

6. הכנת דג זברה למבוגרת

  1. הגדרת ההזדווגות של [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 דג הזברה מבוגר במיכלים ההזדווגות. הקציר עובר למחרת בבוקר על ידי מאמץ מי מערכת ההעברה העוברים לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי עם מדיום עובר.
  2. לשמור על לא יותר מ -100 עוברים לכל צלחת פטרי. תחת סטראו, להסיר את הביצים מופרות באמצעות פיפטה מזכוכית. לגדול עוברים על 28 מעלות צלזיוס ומוסיפים PTU לריכוז סופי של 0.003% לאחר 10 hpf לעכב התפתחות פיגמנט.
  3. בשעה 4 DPF, השתמש Tricaine להרדים הזחלים ולמיין [Tg (fabp10a: CFP-NTR)Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] הזחלים. יש לשטוף היטב את Tricaine על ידי שינוי מספר פעמים בינוני עובר טריים. אפשר זחלים להתאושש על 28 מעלות צלזיוס עד שהם להשיג קצב לב רגיל של 120-180 פעימות לדקה 18.
  4. תרי זחלי מיון כדי 6-12 חודשים מבוססים על ההליך הרגיל 19.

אתנול 7., Metronidazole טיפול ושיקום הכבד למבוגרים דג הזברה

  1. העבר הישן 6-12 חודשים [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] דג הזברה מבוגר כדי טנקים ההזדווגות באמצעות נטו. יש לשמור את הדגים בצפיפות של לא יותר מ -10 דגים לכל טנק.
  2. כן פתרון EtOH טרי ידי הוספת EtOH במי מערכת לריכוז סופי של 1%. פנקו את הדגים הבוגרים עם 500 מ"ל פתרון EtOH בכל טנק ולשמור אותם בתוך חממה C 28 °.
  3. העברת דגים בוגרים כדי פתרון EtOH טרי מדי יום, לבטל אבזר דג מתכיאות כמו Biohazard. ברציפות לטפל בבעלי חיים במשך 72 שעות לפני הטיפול MTZ.
  4. כן 10 טרי פתרון המ"מ MTZ במי מערכת של 0.1% DMSO. טרום לחמם את הפתרון MTZ C חממה 28 °. פנקו את הדג עם 500 מ"ל פתרון MTZ במיכל מעבר 1 L עבור 8 שעות ב 28 ° C, להגן מפני האור באמצעות רדיד אלומיניום.
  5. שימו לב לשעה במהלך הטיפול ולהסיר דג מת מיד. בטל דגים מתים כראוי כתוצאה Biohazard. בסוף טיפול MTZ, לשטוף את MTZ ידי העברת חיות למי מערכת טרי פעמים.
  6. אפשר חי להתאושש ולשמור אותם באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס. Feed ולהעביר דג למי מערכת טריים מדי יום עד לנקודת זמן מסוים עבור ניתוחים.

8. דג הזברה למבוגרים כבד קיבוע, Immunostaining, והדמיה Confocal

  1. להרדים דגים בוגרים עם 0.02% Tricaine ו להרדים במי קרח למשך 15 דקות. פאט יבש דגים על מגבת נייר ומניחים אותו על מחצלת לנתח.
  2. לחשוף איברים במערכת העיכול על ידי הסרת העור והשרירים כפי שתואר לעיל 20. השתמש במספריים לחתוך את העור ושרירים בסיסיים לאורך הבטן מן הסנפיר האנאלי אל operculum, ולאחר מכן בדיעבד לאורך הצד של הדג אל הסנפיר השת.
  3. מכניסים את הדגים בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל ולשטוף פעם עם PBS. הסר PBS ולהוסיף 4 מ"ל של פורמלדהיד מוכן טרי 2% במאגר PEM לתקן O / N ב 4 ° C.
  4. בטל תיקון פתרון כראוי, לשטוף 3 פעמים עם PBS ב RT. אפשר לשמור דגימות קבועות PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. שאמשיך לשלב הבא מייד נותן תוצאות immunostaining טובות יותר.
  5. לנתח את הבטן כולה עם כבד מחלל הגוף של הדג על ידי חיתוך הוושט. שבץ איברים במערכת העיכול עם 4% נמוך ההיתוך agarose בתוך תבנית חתך.
  6. השתמש vibratome לחתוך דגימות למקטעים רוחבי ב 50 מיקרומטר במרווחים ב PBS קר כקרח, החל מסוף הקדמי. עבר שניותמשא לצלחת 6-היטב עם PBS באמצעות מברשת צבע # 1.
  7. Permeabilize וחתכים בלוק O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.
  8. דגירה עם נוגדן אנטי קולגן אני ארנב בדילול של 1: 100 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים, 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף.
  9. דגירה עם AlexaFluor 647 נוגדן נגד ארנב החמור מצומדות בדילול של 1: 200 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים, 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף ופעם עם PBS.
  10. בעדינות להעביר חלקי שקופיות זכוכית באמצעות מברשת צבע # 1. הסר PBS העודף באמצעות Kimwipes, להוסיף טיפה של תקשורת הרכבה, ואת מכסה זכוכית חותם עם לק. הדמית confocal ניצוח מייד מומלצת מאוד.
  11. השתמש במערכת confocal מצוידת בעדשת שמן 40X / 1.3 ללכוד תמונות. השתמש כוח לייזר 20-50%. צלמו תמונות מחסנית Z ב 1 מיקרומטר במרווחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג את התפתחות מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה הזחל. כדי לייעל את פרוטוקול על חשיפת זחלי דג זברת EtOH, אנו מעריכים הראשון רעיל EtOH. 2.5 ימים שלאחר ההפריה (DPF) הזחלים נחשפו ריכוז 1% EtOH, 1.5%, או 2% למשך 24 שעות ואחריו טיפול EtOH במקביל 24 שעות / MTZ. חשיפת 2% EtOH נגרמת תמותה גבוהה, בעוד שכמעט כל זחלים חשופים 1% EtOH או פחות הראו שינויי fibrogenic מינימאליים עם בתצהיר נדיר של חלבונים תאים מטריקס כמו קולגן. בהתבסס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צפינו התחדשות hepatocyte בתיווך HPC ב EtOH / MTZ שטופלו כבדי מחלים, דבר המצביע על כך אפילו בנוכחות של כמות משמעותית של חלבונים ECM כולל סוג סיבי לי קולגן, HPCs לשמור וכשירותו להתחדש כמו hepatocytes. הטיפול בלבד MTZ לא להגדיל בתצהיר של חלבוני ECM משמעותי, ואילו הטיפול רק EtOH לא לגרום HPC הפעלת 15. על ידי ניצול של טיפול EtOH / MTZ בשילוב, הצלחנו לחקור התחדשות HPC מונחה בכבד fibrotic. כמו חיסול כמעט מוחלט של hepatocyte מעורר התחדשות hepatocyte מונחה HPC, חשוב לברר זחלי MT...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של GTEC (2731336 ו 1411318), ה- NIH (K01DK081351), ואת NSF (1,354,837) כדי CHS אנו מודים Alem גיורגיס לקריאה ביקורתית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סידן גופרתי המיהידראט (CaSO4)AcrosAC385355000
מגנזיום גופרתי (MgSO4)EMDMX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)Sigma-AldrichP6757
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-
N,N,N′,N′,N′ -חומצה טטראצטית (EGTA)		סיגמא-אולדריץ'E3889
אתנולסיגמא-אולדריץ'E7023200 הוכחה
פורמלדהידפישר סיינטיפיקF79-500
מטרונידזול (MTZ)סיגמא-אולדריץ'M3761
1-פניל-2-תיאוריאה (PTU)סיגמא-אולדריץ'P7629
3-אמינו חומצה בנזואית אתיל אסטר (טריקאין)Sigma-AldrichA5040
טבלית מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS)AmrescoE404ממיסים טבליה אחת עם 100 מ"ל מים מזוקקים
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD2438
אלבומין סרום בקרFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
נמס נמוך אגרוז AmrescoBP165
Selleck ChemicalsL210010  מלאי mM בספריית DMSO
ActiProbe-1KTimtecActiProbe-1K10  מלאי mM ב-DMSO
SB415286-Selleck ChemicalsS2729מתמוסס עם DMSO ל-10  mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924מתמוססים עם DMSO ל-10  mM
Anti-Collagen I נוגדןAbcamab23730השתמש ב-1:100 לצביעה חיסונית, מגיב עם דגים
AlexaFluor 647 חמור נגד ארנב IgG (H+L)בדיקות מולקולריותA31573השתמש ב-1:200 לצביעה חיסונית
מדיה הרכבה (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
צלחת פטרי 100 מ"מVWR25384-088
24-well צלחתVWR10062-896
מלקחייםכלי מדע עדינים11255-20Dumont #55
שקופית זכוכיתVWR48312-00375x25 מ"מ
כיסוי זכוכיתVWR48366-04518 מ"מ
עטיפת פלסטיקפישר סיינטיפיק22305654
רדיד אלומיניוםפישר סיינטיפיק1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomeLeicaVT1000 S
מיקרוסקופ סטריאוLeicaM80
מיקרוסקופ אפיפלואורסנטיLeicaM205 FA
מיקרוסקופ קונפוקולZeissLSM700
ספריית תרכובות איתות תאי גזע

מקורות

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137(2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

1MTZ
פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.