פיברוזיס מתמשך עם שקיעה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מוגזמים מוביל לשחמת. שימוש לרעה באלכוהול הוא אחד הגורמים העיקריים למחלת כבד קשה. הקמנו מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול כדי לחקור את המנגנונים והאסטרטגיות לקידום התחדשות הפטוציטים בעת פציעה הנגרמת על ידי אלכוהול.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיברוזיס מתמשך בכבד עם המשך הצטברות חלבון מטריצה חוץ-תאית (ECM) גורם לאובדן היכולת התאית של הכבד, מה שמוביל לשחמת עם תפקוד לקוי של הכבד. בין עלבונות רבים בכבד, שימוש לרעה באלכוהול יכול להוביל לבעיות בריאותיות משמעותיות כולל אי ספיקת כבד וקרצינומה של הכבד. עם זאת, זהותם של מקורות תאיים אנדוגניים המחדשים הפטוציטים בתגובה לאלכוהול לא נחקרה כראוי. יתר על כן, מעט מחקרים דגמו ביעילות את התחדשות הפטוציטים על פגיעה הנגרמת על ידי אלכוהול. לאחרונה דיווחנו על הקמת מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי אתנול (EtOH) בדגי זברה שבו תאי אב בכבד (HPCs) הולידו הפטוציטים לאחר אובדן הפטוציטים כמעט מוחלט בנוכחות גירוי פיברוגני. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים באמצעות מודל זה, זיהינו מספר מולקולות קטנות המשפרות את התחדשות הפטוציטים. כאן אנו מתארים בפירוט את ההליכים לפיתוח מודל כבד פיברוטי המושרה על ידי EtOH ולביצוע מסננים כימיים באמצעות מודל זה בדגי זברה. פרוטוקול זה יהווה כלי קריטי לתיאור המנגנונים המולקולריים והתאיים של האופן שבו הפטוציטים מתחדשים בכבד הפיברוטי. יתר על כן, שיטות אלו יקלו על גילוי פוטנציאלי של אסטרטגיות טיפוליות חדשות למחלת כבד כרונית in vivo.
מבוא
למרות יכולת ההתחדשות המרשימה של hepatocytes 1, שהם סוג תא parenchymal העיקרי של הכבד, אי ספיקת כבד כרונית פוגעת ביכולת הזאת, מה שמובילה תאים ובתאים בכבדים (HPC) התחדשות תלויה 2.
נזק כבד כרונית נגזרת בעיקר שימוש לרעה באלכוהול, וירוס הפטיטיס C כרונית (HCV) 3 ו מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) 4. זה מוביל פיברוזיס כבד מתמשך, אשר מזוהה עם ההצטברות של תאי מטריקס חלבונים (ECM). מתמיד הצטברות ECM מעווה אדריכלות כבדה ללא פגעה על ידי יצירת רקמת צלקתית סיבית 5, לאחר מכן וכתוצאה מכך שחם עם תחלואה ותמותה גבוהות. ניס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דג הזברה הועלו וגדל באמצעות פרוטוקול סטנדרטי אשר עונה על הקריטריונים של המכונים הלאומיים לבריאות ואושר על ידי המכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.
1. הכנת פתרונות
- הכן מים ביצה 20 L (לסירוגין בשימוש עם "בינוני העובר ') כדי לשמור על דג הזברה הזחל / עובריים. ממיסים 1.5 גרם קאסו 4 ו -6 גרם מלח ים האוקיינוס מיידית ב -250 מ"ל מים מזוקקים. יוצק לתוך קרונית מלאה 20 מי L מזוקק להתסיס.
- כן 1 L 1-פניל-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג את התפתחות מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה הזחל. כדי לייעל את פרוטוקול על חשיפת זחלי דג זברת EtOH, אנו מעריכים הראשון רעיל EtOH. 2.5 ימים שלאחר ההפריה (DPF) הזחלים נחשפו ריכוז 1% EtOH, 1.5%, או 2% למשך 24 שעות ואחריו טיפול EtOH במקביל 24 שעות / MTZ. חשיפת 2% EtOH נגרמת תמותה גבוהה, בעוד שכמעט כל זחלים חשופים 1% EtOH או פחות הראו שינויי fibrogenic מינימאליים עם בתצהיר נדיר של חלבונים תאים מטריקס כמו קולגן. בהתבסס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צפינו התחדשות hepatocyte בתיווך HPC ב EtOH / MTZ שטופלו כבדי מחלים, דבר המצביע על כך אפילו בנוכחות של כמות משמעותית של חלבונים ECM כולל סוג סיבי לי קולגן, HPCs לשמור וכשירותו להתחדש כמו hepatocytes. הטיפול בלבד MTZ לא להגדיל בתצהיר של חלבוני ECM משמעותי, ואילו הטיפול רק EtOH לא לגרום HPC הפעלת 15. על ידי ניצול של טיפול EtOH / MTZ בשילוב, הצלחנו לחקור התחדשות HPC מונחה בכבד fibrotic. כמו חיסול כמעט מוחלט של hepatocyte מעורר התחדשות hepatocyte מונחה HPC, חשוב לברר זחלי MT.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של GTEC (2731336 ו 1411318), ה- NIH (K01DK081351), ואת NSF (1,354,837) כדי CHS אנו מודים Alem גיורגיס לקריאה ביקורתית של כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סידן גופרתי המיהידראט (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| מגנזיום גופרתי (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)- N,N,N′,N′,N′ -חומצה טטראצטית (EGTA) | סיגמא-אולדריץ' | E3889 | |
| אתנול | סיגמא-אולדריץ' | E7023 | 200 הוכחה |
| פורמלדהיד | פישר סיינטיפיק | F79-500 | |
| מטרונידזול (MTZ) | סיגמא-אולדריץ' | M3761 | |
| 1-פניל-2-תיאוריאה (PTU) | סיגמא-אולדריץ' | P7629 | |
| 3-אמינו חומצה בנזואית אתיל אסטר (טריקאין) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| טבלית מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) | Amresco | E404 | ממיסים טבליה אחת עם 100 מ"ל מים מזוקקים |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| אלבומין סרום בקר | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| נמס נמוך אגרוז | Amresco | BP165 | |
| Selleck Chemicals | L2100 | 10 מלאי mM בספריית DMSO | |
| ActiProbe-1K | Timtec | ActiProbe-1K | 10 מלאי mM ב-DMSO |
| SB | 415286-Selleck Chemicals | S2729 | מתמוסס עם DMSO ל-10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | מתמוססים עם DMSO ל-10 mM |
| Anti-Collagen I נוגדן | Abcam | ab23730 | השתמש ב-1:100 לצביעה חיסונית, מגיב עם דגים |
| AlexaFluor 647 חמור נגד ארנב IgG (H+L) | בדיקות מולקולריות | A31573 | השתמש ב-1:200 לצביעה חיסונית |
| מדיה הרכבה (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| צלחת פטרי 100 מ"מ | VWR | 25384-088 | |
| 24-well צלחת | VWR | 10062-896 | |
| מלקחיים | כלי מדע עדינים | 11255-20 | Dumont #55 |
| שקופית זכוכית | VWR | 48312-003 | 75x25 מ"מ |
| כיסוי זכוכית | VWR | 48366-045 | 18 מ"מ |
| עטיפת פלסטיק | פישר סיינטיפיק | 22305654 | |
| רדיד אלומיניום | פישר סיינטיפיק | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| מיקרוסקופ סטריאו | Leica | M80 | |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסנטי | Leica | M205 FA | |
| מיקרוסקופ קונפוקול | Zeiss | LSM700 |
מקורות
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
