סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

היכולת לדמות מבנים נוירו-אנטומיים שלמים היא בעלת ערך עצום להבנת המוח בבריאות ובחולי. באופן מסורתי, הדמיה תלת מימדית דרשה חתך רקמות כדי לספק את הרזולוציה הצירית וכדי לדמיין מבנים אנטומיים עמוקים. גישה זו יכולה לייצר מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה, אך דורשת טכניקות שחזור תמונה מתוחכמות והיא עתירת עבודה. כתוצאה מכך, הוא הוגבל להדמיה של נפחים קטנים של רקמה^1-3. חתך אופטי, לעומת זאת, מתאים היטב ליצירת תמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה של רקמות המסומנות בפלואורסצנט. מכיוון שחתך אופטי הוא תלת מימדי מטבעו, הוא אינו דורש חישוב נרחב כדי לייצר נפח תמונה תלת מימדי. עם זאת, פיזור אור ואטימות רקמות מגבילים את העומק שבו ניתן לחתוך רקמות אופטית. עומק ההדמיה מוגבל לכ-150 מיקרומטר במיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר ולפחות מ-800 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ עירור דו-פוטוני^4-8.

על מנת להתגבר על מגבלות אלה, פותחו לאחרונה מספר טכניקות ניקוי אופטי ולאחר מכן שוכללו עוד יותר כדי לאפשר הדמיה מיקרוסקופית עמוקה של רקמות שלמות. השימוש בבנזיל אלכוהול ובנזיל בנזואט (BABB) כדי להפוך רקמות קבועות לשקופות היה בין הגישות המוקדמות ביותר⁹. עם זאת, גישה זו הוגבלה על ידי כיבוי הקרינה בדגימות ופינוי לא שלם של מבנים בעלי מיאלין גבוה¹⁰. שיפורים של טכניקה זו, כגון הדמיה תלת מימדית של איברים מנוקים ממסים (3DISCO), הובילו לניקוי רקמות מהיר ומלא מאוד, אך עדיין סובלים מאובדן מהיר של אותות פלואורסצנטיים, במיוחד חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)¹⁰. תמיסות ניקוי על בסיס מים, כגון Sca/e¹¹ ו-SeeDB¹², משמרות אותות פלואורסצנטיים, אך אינן מנקות לחלוטין רקמות מיאליניות מאוד. קוקטיילים של הדמיית מוח נקייה ללא הפרעה וניתוח חישובי (CUBIC) היא טכנולוגיית קלירינג אופטית חדשה ומבטיחה שנראה כי היא מתגברת על המגבלות של פתרונות ניקוי על בסיס מים שפותחו בעבר¹³. בניגוד לטכניקות ניקוי אופטיות אחרות, רקמה תואמת הדמיה קשיחה (CLARITY)¹⁴ מטמיעה את המוח במטריצה נקבובית המספקת שלמות מבנית לחלבונים, חומצות גרעין ומולקולות קטנות, תוך השארת שומנים לא קשורים. לאחר מכן מסירים את השומנים באופן אלקטרופורטי, ומגיעים לשיאם במוח מנוקה אופטית שניתן לדמיין בקלות ובאותה קלות לחקור אותו באותה מידה באמצעות טכניקות נפוצות הזמינות.

ניקוי רקמות אלקטרופורטי (ETC) משמש להסרת שומנים מרקמות משובצות הידרוג'ל ב-CLARITY, עם זאת, ETC יכול להיות קשה ליישום באופן עקבי ורקמות הכפופות לאלקטרופורזה יכולות להפגין עיוות רקמות, השחמה, אובדן פלואורסצנטיות ותגובתיות נוגדנים. ניקוי שומנים פסיבי נמנע ממגבלות אלה, אך דורש זמני ניקוי מוגברים^15-17. קלירינג פסיבי מאפשר גם ניקוי של מספר רב של דגימות במקביל, מכיוון שהוא אינו מוגבל על ידי מספר מכשירי ה-ETC הזמינים. הפחתת ריכוז הפרפורמלדהיד והוצאת ביס-אקרילאמיד מההידרוג'ל הובילו לעלייה גדולה במהירות הפינוי על חשבון התרחבות גדולה יותר של רקמות¹⁶. חלופות זולות יותר לפתרון התאמת מקדם השבירה ששימש בטכניקת CLARITY המקורית פותחו^17-19. 2,2'-תיודיתנול (TDE) הוא חומר ניקוי מוח זול ומהיר ההופך חלק מהתרחבות הרקמה המתרחשת במהלך הסרת שומנים¹⁸. דוח זה משלב ניקוי פסיבי של רקמה משובצת הידרוג'ל ושימוש ב-TDE כפתרון תואם מקדם שבירה לטכניקת CLARITY המקורית כדי לייצר פרוטוקול זול וניתן לשחזור לניקוי אופטי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר.

כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הנחיות. Thy1-YFP, PLP-EGFP ו- PV-tdTomato עכברים ששימשו בניסויים אלה, אבל כל בעכברים המבטאים חלבוני ניאון ניתן לפנות בהצלחה צילמו.

1. רקמות הכנה

זהירות: Paraformaldehyde (PFA) ו acrylamide רעילים מגרים. בצע ניסויים ניצול ריאגנטים אלה במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן).

1. להקריב את החיה בתא המתת חסד עם ~ 1 מ"ל של isoflurane עד הנשימה נפסקת (~ 2 - 3 דקות).
2. השתמש משאבת peristaltic מוגדר ~ 5 מ"ל / דקה כדי intracardially perfuse את העכבר עם פתרון זלוף (טבלה 1) ב 4 ° C עד דם מנוקה מן הרקמות (5 - 10 דקות).
3. שנה את perfusate לפתרון מקבע (טבלה 1)ב 4 מעלות צלזיוס עד צוואר וזנב החמירו משמעותית (5 - 10 דקות).
4. לסיום זלוף לערוף את החיה. בזהירות לנתח את המוח מהגולגולת על ידי הסרה הראשונה רקמת החיבור המקיפה את הגולגולת ואז הסרת עצם מפני שטח הגחון של הגולגולת מרים את המוח (איור 1 א), כמתואר ^20.
   הערה: תן טיפול מיוחד להסרת עצם שמסביב אונות flocculonodular של המוח הקטן ואת נורות חוש הריח.
   1. לנתח את חוט השדרה של עמוד השדרה על ידי הכנסת הקצה בעדינות של מספריים בסדר, חדו בין חוט השדרה ואת עמוד השדרה וחיתוך מגזרי עמוד השדרה הבודד משם, כמתואר ^21.
5. Hemisect המוח על ידי הצבתו במטריצה ​​במוח העכבר פלסטיק חיתוך לאורך קו האמצע עם להב מטריקס.
6. להוסיף כל חצי הכדור וחוט השדרה להפריד צנטריפוגה 50 מ"ל גיגיתes עם ~ 40 מ"ל של תמיסת הידרוג'ל (טבלה 1). מכריכה קדימה בשלב זה את הצינורות עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על fluorophores במהלך כל הצעדים הבאים.
7. דגירת הצינור המכיל את הדוגמא הידרוג'ל ב 4 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל"ד) למשך 7 ימים.

2. פילמור

1. בטל ~ 25 מ"ל של הידרוג'ל, שמירה על מדגם ו ~ 25 מ"ל של הידרוג'ל בצינור צנטריפוגות.
2. Deoxygenate המדגם על ידי הסרת מכסה והצבת צינור צנטריפוגות בצנצנת ייבוש וחיבור צנצנת ואקום. החלת את הוואקום במשך 10 דקות לפחות להתיר גזים מומסים לצאת בועות פתרון וצורה. נער בעדינות כדי לסלק את הבועות.
3. החזר את הוואקום בצנצנת הייבוש בגז חנקן 100% לעומת 2 - 3 דקות. לאחר לחץ המשווה (פעם בראש צנצנת הייבוש ניתן לפתוח), במהירות מכסה את הצינור כדי למנוע החידוש של חמצן.
4. פּוֹלִימֵרize הידרוג על ידי הנחת צינור עם מדגם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות עד פילמור הושלמה. הידרוג'ל polymerized ייקח על (איור 1b) דמוי ג'ל עקבי. הערה: כמות קטנה של הידרוג'ל unpolymerized בראש מקובל.
5. להשתמש במרית להסיר את מדגם polymerized מצינור צנטריפוגות, ואז לחתוך את הידרוג'ל העודף מן המדגם.
6. הסר את הידרוג'ל הנותרים על ידי הצבת המדגם על מוך חינם לנגב ומשפשף בעדינות לגלגל את הרקמה על זה, והותיר אחריו רק שכבה דקה של הידרוג'ל polymerized על המדגם.

3. הסרת שומנים

הערה: רקמת פינה ליפידים הוא שברירי, להישמר מהם. השתמש מסננת תא כאשר רוקנה את הצינור כדי למנוע אובדן של מדגם. כמו כן, המדגם יתנפח לאורך כל תהליך הסליקה, לעומת זאת, נפיחות יכולה להיות הפוך במהלך תהליך ההתאמה מקדם השביר.

זהירות: Sodiאממ סולפט dodecyl (SDS) וחומצה בורה הם מגרים. בצע ניסויים ניצול אותם במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות ומשקפי מגן).

1. העבר מדגם מפולמר צינור צנטריפוגות נקי 50 מ"ל ולהוסיף 45 מ"ל של סליקה חיץ (טבלה 1). לדגור על 45 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ 30 סל"ד). שינוי למאגר יומי 7 ימים ראשונים על ידי ניגר למאגר הסליקה בשימוש לתוך פסולת כימית והוספה ~ 45 מיליליטר של חיץ סליקה טרי. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores.
2. לאחר 7 ימים הראשוניים, דגירת המדגם ב 40 מעלות צלזיוס ו חיץ חליפי סליקה כל 2 - 3 ימים. המשך סליקה עד שכל השומנים הם solubilized ורקמות מגיעות השקיפות (איור 1 ג '). זה יהיה 4 - 6 שבועות למשך חצי כדור במוח עכבר 2 - 4 שבועות עבור חוט שדרה.
3. לאחר רקמות מנוקות, להעבירהמדגם לצינור צנטריפוגות חדשות 50 מ"ל ולשטוף 4 פעמים ב PBST (טבלה 1) ב 40 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל"ד) מעל 24 שעות כדי להסיר SDS שיורית.

4. מולקולרי מכתים

זהירות: 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole dihydrochloride (DAPI) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה צריך להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן).

1. מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל נקי ומלא עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI ב 1x PBST, pH 7.5. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores.
2. לשטוף 3 פעמים ב PBST ב RT במשך 6 שעות / לשטוף לפחות.

5. התאמת מקדם השבירה

זהירות: 2,2'-Thiodiethanol (TDE) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה shולד להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן).

1. מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל נקי ומלא עם 30% (v / v) TDE ב PBS 1x, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ סל"ד 30) למשך 24 שעות.
2. המרת 30% TDE עם 63% (v / v) TDE ב 1x PBS, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין למשך 24 שעות.
   הערה: המדגם יתכווץ חזרה לגודל כ מקורי.
3. על משטח שטוח ונקי לגלגל חתיכת דבק לשימוש חוזר לגליל בקוטר אחיד רק מעט גדול יותר בעובי של המדגם.
4. הנח את הגליל הדבק לשימוש החוזר במעגל פתוח (~ 25 מ"מ קוטר פנימי עם פתח קטן בחלק העליון) על צלחת תחתית זכוכית 40 מ"מ. אם תיקונים צריכים להיעשות, להסיר את הגליל מהכוס לחתוך עם סכין גילוח.
5. השתמש טיפ p1000 פיפטה ליצור חותם בין דבק לשימוש חוזר וזכוכית ידימגלגל אותו סביב השפה החיצונית של הגליל.
6. המקום ~ 100 μl 63% TDE על צלחת הזכוכית להפיץ מסביב כדי לכסות את משטח הזכוכית בתוך המעגל של דבק לשימוש חוזר.
7. בעזרת מרית, מניח את המדגם בזהירות באמצע המעגל, נזהר שלא ליצור בועות.
8. פיפטה עוד 100 μl של TDE 63% ישירות על גבי המדגם, ומייד למקם כוס כיסוי עגולה 40 מ"מ מעל הדבק לשימוש החוזר.
9. באמצעות האינדקס, אמצע קמיצה של שתי הידיים, לחצו בזהירות מסביב למעגל עד הזכוכית המכסה יצר קשר עם המדגם.
10. לאט לאט מביאים את התבשיל בתחתית הכוס בתנוחה זקופה נחה על פני השטח, ולאחר מכן להוסיף 63% TDE עם טפטפת עד שהתמיסה תגיע פתח קטן בראש. השתמש חינם מוך לנגב להתנגב קצה פיפטה כך שהפתרון לא לטפטף על זכוכית. כדי למנוע בועות בתא, לא לרוקן את פיפטה כל הדרך.
11. להפתח הקטן, להוסיף אלסטומר סיליקון לצרף המעגל ליצור תא סגור. מתן 5 דקות עבור לו להתייבש לפני ההדמיה.

מיקרוסקופי 6.

זהירות: הלייזרים המשמשים confocal, תאורת מטוס בודדת במיקרוסקופ גיליון האור הם מאוד חזקה ויכולה לגרום לעיוורון. כל ניסויי ניצול לייזרים צריכים להתבצע לאחר אימונים רבים בזהירות רבה ומשקפי מגן מתאים.

1. הנח את תא הדמיה עם המדגם בתוך על הבמה של מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר.
2. פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלה של חומרים). כדי להפעיל את הלייזר עירור ארגון, לחץ על הכרטיסייה תצורת בחלק העליון של התוכנית ולאחר מכן בסמל לייזר. סמן את התיבה לצד ארגון כוח לייזר ולעבור סולם שקופית 30%. שים את המצביע להתחמם לאט למצב שנבחר.
   1. חזור לכרטיסייה לרכוש בחלק העליון. בתיבת הדו הגדולה "הגדרות נתיב קרן &# 34; ללכת העומס / לשמור הגדרת תיבה ובחר את תפריט הנפתח כדי לבחור ערוץ גל מתאים לתמונת YFP (527 ננומטר).
3. בחר יעדים מתאימים הדמיה ידי איתור הקישור האדום שכותרתו "מטרה: אובייקט נוכחי" תחת תיבת גדרות ערוץ. לחיצה על הכרטיסייה פותחת את כל המטרות הזמינות ומבחר באופן אוטומטי לסובב את הצריח.
   1. השתמש מטרות (למשל., 10X) עם מרחק עבודה גדולה (יותר מעובי של הרקמות להיות צלמו, למשל, 11 מ"מ) וכן מספרי צמצם גדול (למשל., 0.3) על מנת למקסם רזולוציית תמונת המטוס ולמזער עובי סעיף אופטי.
4. על העמוד השמאלי של תפריטים נפתחים, לפתוח את "XY: רזולוציה" החלון להגדיר מטריצת רכישה, בשם "תבנית", 1,024 x 1,024 או ערך מתאים עבור מגבלת רזולוציה לרוחב של המטרה. הגדר את גורם זום נמוך ככל האפשר (למשל., 1.7).
5. באותו החלון, להגדיר ממוצע 8 קו 1 פרמטרים ממוצעים מסגרת ידי הטלה למטה בתפריטים שכותרתו בנפרד בהתאם. השתמש בערכים גדולים עבור יחס אות לרעש גבוה וערכים קטנים לרכישה מהירה.
   הערה: 8 ממוצעי קו ממוצע מסגרת 1 ירכשו תמונות באיכות גבוהה של אונה במוח עכבר בתוך כ -4 שעות.
6. אתר את המדגם באמצעות הפקדים הבמה. לאחר שדה נציג גלוי, להגדיר את הרווח לקזז.
   הערה: הרווח לקזז ישתנה מבוסס במידה מהותית על סוג הרקמה, fluorophores, ו / או להיות הדמית תכונה אנטומית. עבור YFP, להגדיר ערכים מ 760 ל 780 טוב רווח ומתוך -1.0 ל -1.5 עבור לקזז.
7. בחר "סריקת אריח" ובחר את גבולות האזור של עניין. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של Z- מחסנית להירכש. הגדר את העובי של הסעיף האופטי המבוסס על מגבלת רזולוצית סעיף האופטית של המטרה.
   הערה: המטרה שלמגבלת רזולוצית סעיף אופטית מוגדרת בראש ובראשונה על ידי הצמצם המספרי שלה. רוב תוכנות מיקרוסקופ שליטה תחשבנה מתאים ערך באופן אוטומטי עבור המטרה בשימוש. עבור מטרת 10X עם צמצם מספרי של 0.3 זה יהיה כ 11 מיקרומטר.
8. הפעל את הרכישה.
   הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות.
9. איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות בהגדלה גבוהה יותר מאזורים ספציפיים של עניין.

לדמיין את המבנה הארגוני של המוח הוא קריטי להבנת איך מורפולוגיה וקישוריות להשפיע על תפקוד המוח בריאות ומחלות. טכניקות סליקה אופטיות מאפשרות אוכלוסיות תאי תמונת 3D ברקמות ללא פגע, מה שמאפשר לנו ללמוד מורפולוגיה וקישוריות cohesively.

עכברים המבטאים חלבוני ניאון מונע על ידי יזמים ספציפיים עבור תת-אוכלוסיות של תאים להתיר אחת ניסו להפריד דפוס המורכב של קישוריות עצבית במוח. עכברים מהונדסים Thy1-YFP נעשה שימוש נרחב בספרות הסליקה האופטית כי עכברים אלה מבטאים YFP משנה של נוירונים הקרנה הנמצאים בקליפת המוח ואת ההיפוקמפוס, כמו גם מבנים אחרים במוח (איור 2 א & B). יתר על כן, YFP + נוירונים V שכבת קליפת המוח להקרין דרך מערכת corticospinal בשנות הכבל Pinal (איור 2 ג & D), מה שהופך אותם מאוד שימושי בהערכת ההשפעה של עלבון axonal ו / או פגיעה בחוט השדרה על נוירונים בקליפת המוח 15. באמצעות השימוש במיקרוסקופ confocal חתך אופטי של רקמות פינה אופטית אחד יכול להעריך הבדלים בקלות בצפיפות עצבית ברחבי מבנים אנטומיים גדולים.

בנוסף עכברים מהונדסים Thy1-YFP, כל מספר של עכברים מהונדסים ניתן הדמיה. עכברים מהונדסים PLP-EGFP מפורשות משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ב oligodendrocytes הבוגרת לבטא חלבון proteolipid (PLP) בכל רחבי המוח וחוט שדרה (איור 3 א). עכברים מהונדס PV-tdTomato להביע tdTomato משנה של parvalbumin (PV) להביע interneurons במוח הקטן, הסטריאטום ובהיפוקמפוס (איור 3 ב). גם בעכברים כי אינו מבטא transgenes פלורסנט, צבעי ניאון משקל מולקולרי קטנים, כגון DAPI, יכול לנטרל בקלות לתוך רקמות מוטבעות הידרוג'ל ולהתיר בהערכה לגרעיני תא המוח (איור 4).

איור 1:. בשלבים שונים של מוח סליקת תצלום של Thy1-YFP + עכבר מוח שהוסר מהגולגולת (א). תצלום של האונה במוח הידרוג'ל-מוטבע Thy1-YFP + עכבר (ב). תצלום של אונה במוח Thy1-YFP + עכבר לאחר הסרת שומנים (ג). ברי סולם הם 5 מ"מ בפנל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: Thy1-YFP ביטוי המוחnd בחוט השדרה. Thy1-YFP + נוירונים בקליפת המוח ואת ההיפוקמפוס צילמו בהגדלה 5X ושיחזר ב 3D (א). היטל העוצמה המקסימלית של ערימה תמונה 10X של קליפת המוח הוכחת arborization הדנדריטים של נוירונים פירמידליים V שכבת קליפת המוח (ב). Thy1-YFP ביטוי בתוך חוט השדרה הצווארי החזי שלמים צילמו בהגדלה 5X ושיחזר ב -3 D (ג). היטל עצמה המקסימלית של ערימת תמונת 10X של חוט השדרה הוכחת אקסונים פרט (ד). ברי סולם הם 1 מ"מ (א), 100 מיקרומטר (ב), 2 מ"מ (ג), ו- 100 מיקרומטר (ד). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: PLP-EGFP ואת הביטוי PV-tdTomato במוח. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: DAPI מכתים בביטוי DAPI המוח במוח הקטן של חצי כדור ארץ מוחות שלם צלם בהגדלת 5X.. הדימוי הוא כ 1 מ"מ ממטוס midsagittal. הבלעה מראה את רמת הפירוט גלוי בעומק הדמיה זו בהגדלה 10X. סולם סורגיםמחדש 250 מיקרומטר הלוח הראשי ו -50 מיקרומטר הבלעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: רשימת חוצצים ופתרונות.

למחברים אין מה לחשוף.