הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54026

⸱

9 ביוני 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

במאמר זה

סיכום

ניתן למזער קסנוגרפלים שמקורם בחולה של גליובלסטומה מולטיפורמה למיקרו-גידולים חיים באמצעות מערכת תרבית ביוג'ל אנושית תלת מימדית. בדיקת גידול תלת מימדית זו מתאימה לבדיקת תגובה לתרופות ופרופיל מולקולרי, כולל ניתוח קינומי.

תקציר

השימוש ב-xenografts שמקורם בחולה למידול סרטן סיפק תובנה חשובה לגבי הביולוגיה של הסרטן והיענות לתרופות. עם זאת, הם גוזלים זמן, יקרים ועתירי עבודה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, קבוצות מחקר רבות פנו לתרביות ספרואידים של תאים סרטניים. בעוד שהם שימושיים, ספרואידים או אגרגטים של גידול אינם משכפלים אינטראקציות מטריצת תאים כפי שנמצא in vivo. ככזה, גישות תרבות תלת מימדיות (תלת מימד) המשתמשות בפיגום מטריצה חוץ-תאי מספקות מערכת מודל מציאותית יותר לחקירה. החל מהשתלות תת עוריות או תוך גולגולתיות, רקמת הגידול מתפרקת לתרחיף תא בודד הדומה לנוירוספרות של תאי גזע סרטניים. תאים אלה מוטמעים לאחר מכן במטריצה חוץ-תאית שמקורה באדם, ביוג'ל אנושי תלת מימדי, כדי ליצור מספר רב של מיקרו-גידולים. מעניין לציין כי ניתן לתרבית מיקרו-גידולים במשך כחודש עם כדאיות גבוהה וניתן להשתמש בהם לבדיקת תגובה לתרופות באמצעות מבחני ציטוטוקסיות סטנדרטיים כגון 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) והדמיית תאים חיים באמצעות Calcein-AM. יתר על כן, ניתן לנתח אותם באמצעות אימונוהיסטוכימיה או לקצור אותם לצורך פרופיל מולקולרי, כגון פרופיל קינומי מבוסס מערך בתפוקה גבוהה, המפורט גם כאן. מיקרו-גידולים תלת מימדיים, אם כן, מייצגים מערכת מודל רב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה שיכולה לשכפל בצורה קרובה יותר את הביולוגיה של הגידול in vivo מאשר גישות מסורתיות.

מבוא

גידולים ממאירים במוח הנפוצים ביותר תוך גולגולתי העיקריים הם כיתה III astrocytomas ו multiforme גליובלסטומה IV כיתה (גליובלסטומה או GBM). גידולים אלה מציעים בפרוגנוזה גרועה עם הישרדות לשנה אחת החציוני בין 12 - 15 חודשים עם טיפולים הקיימים כיום עבור GBM בארה"ב 1-3. טיפולי Multimodality כוללים ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה כולל temozolomide (TMZ) וסוכנים במיקוד קינאז. איתות קינאז הוא dysregulated תדיר GBM, כולל תת קבוצות של גידולים עם הגברה או מוטציות הפעלת ב הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), עליות טסיות נגזר הקולטן לגורם הצמיחה (PDGFR) איתות, גדל Phosphatidyl-אינוזיטול-3 kinase (PI3K) ו הגידול בתמיכה איתות angiogenic דרך הקולטן לגורם הצמיחה דם האנדותל (VEGFR) וכן 4-6 מסלולים מונע קינאז אחרים. נוכחי במבחנה במודלים vivo לעתים קרובות לאבד שינויים נציג אלה 7. בנוסף, פרופיל גנטי לא הציע את היתרונות הצפויים בן כדי לשקף את העובדה ששינויים גנטיים אפיגנטיים לא תמיד לחזות שינויים ברמת פעילות חלבון, שבו רוב קינאז מיקוד סוכנים לפעול ישירות, והיכן טיפולים עם מנגנונים אחרים של פעולה רשאית לפעול בַּעֲקִיפִין.

שורת התא המסורתית הנציחה שניתן passaged אינסוף כבר זמן רב את הסטנדרט עבור בדיקות סמים בשל קלות תחזוקת שחזור שלהם. עם זאת, מודל זה סובל תזונתי גבוה (ומלאכותי) בסביבת גידול בוחרת עבור גדל מהר תאים שונים מאוד מן הגידול המקורי. ככזה, חלה התעניינות רבה בפיתוח מערכות מודל מציאותי יותר המשקפים מערכת ביולוגית הגידול מורכב יותר, כפי שוהה המטופל. xenografts גידול שפותח ישירות גידול ראשוני גדל בעכברים ( "xenoline," xenograft נגזרות החולות או PDX) proviדה מערכת מודל רעיונית יותר, במיוחד במקרים של בריפוי הסרטן, כפי שהם מורגשים יותר לנבא הצלחה קלינית. 8 למרות הביולוגיה שמשקפת בצורה טובה יותר, המודלים האלה הם יקרים קשים להקים ולתחזק. יתר על כן, הם לא מקובל מחקרי תפוקה גבוהה. הצורך טוב יותר לפתח מודלים ביולוגיים שיותר לשקף במדויק שינויים מולקולריים גידולים ראשוניים, ו לפרופיל ולבדוק מודלים אלה באמצעות מדדים ישירים פעילות קינאז, לא פונדקאית סמנים גנטיים, ברור.

היא מוכרת היטב שבניגוד דו ממדי תרבויות monolayer (2D), 3D או מודלי assay רבים-תאיים יכול לספק יותר פיסיולוגי נקודות קצה רלוונטיות 9-11. תרבות 3D נפוצה גישות לערב microcarriers מטריקס מצופה היווצרות אליפטית תא. spheroids הגידול יכול להיות שנוצר באמצעות צבירה הסלולר באמצעות בקבוק טווה, צלחת pHEMA ותליית טכניקות טיפה. מגבלות עבור tגישות hese כוללות: חוסר יכולת של תאים מסוימים כדי ליצור spheroids יציב, השתנות בצמיחה ואתגרים עם סוגי תאים מעורבים. לחלופין, סינתטיים רבים (הידרוג'ל, פולימר) ובעלי חיים הנגזרות Engelbreth-הולם-נחיל (EHS) מטריקס מן סרקומות העכבר, קולגן שור) מטריצות פותחו לתרבות 3D לומד 12-14. מטריקס עכבר EHS נעשה שימוש נרחב אך ידוע להאיץ גדילת תאים והתמיינות במבחנה ובחי 15.

על מנת לשכפל ביולוגית גידול 3D, מערכת biomatrix אדם פותחה על ידי ד"ר ראג 'סינג et al. 16. Biogel האנושית טבעית, הצמיחה ללא הגורם מאפשרת פיגומי תרבות 3D (חרוזים, דיסקים), אשר תומכים טיפוח לטווח ארוך של סוגי תאים מרובים. סדרת עיצובי תרבות biogel האנושי 3D מוקמת ללימוד צמיחת גידול, הדבקה, תכונות אנגיוגנזה ופלישה. יתרונות ומאפיינים של biogel האדם לעומת משותף ג'לים העכבר EHS מסוכמים בטבלה 1 ולוח 2.

מָקוֹר: האדם Amnions (רקמת Pooled)
הפתוגן- חינם, IRB-פטור / אושרה
טבע ECM: ללא מפוגל Biogel (הפקת GLP)
מַפְתֵחַ
רכיבים: 		Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin & HSPG (<3%)
GF-חינם: לגילוי EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogenic, אינו רעיל)

טבלה 1: מאפיינים של האדם Biogel לעומת ג'לים נפוצות EHS.

Biogel אנוש ג'לים EHS
מטריקס אנושית טבעית מטריקס עכבר מחדש
צמיחה & התמיינות תאים מבוקרים יכול לקדם את צמיחת & התמיינות תאים
ביטוי גנים פיזיולוגי ביטוי גנים משתנה
מודל בתרבית רקמה דמוית 3D מודל ההתרבות מבוסס פלייט
ה-next.within-page = "תמיד">

טבלה 2: יתרונות של האדם Biogel לעומת ג'לי הנפוצים EHS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הערכות טיפול xenograft נעשו באמצעות מודל גידול orthotopic עבור גליובלסטומה על פרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש.

1. בידוד של תאי xenograft GBM נגזרות חולים

  1. הכנת ריאגנטים
    1. Re-מהווים collagenase-I מים סטריליים בריכוז של 5 מ"ג / מ"ל ​​ולסנן סטרילית. אחסן aliquots 1 מ"ל ב -20 ° C (הריכוז הסופי הוא 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון אנזים 100 מ"ל).
    2. ממיסים 100 מיקרוגרם עוריות Growth Factor (EGF) ב 2 מ"ל פוספט שנאגרו סטרילי מלוחים (PBS). חנות ב 100 μl (5 מיקרוגרם / 100 μl) aliquots ב -20 מעלות צלזיוס למשך לריכוז סופי של 10 ng / ml.
    3. ממיסים 100 מיקרוגרם FGF-β ב 2 מ"ל סטרילי PBS. חנות ב 100 μl (5 מיקרוגרם / 100 μl) aliquots ב -20 מעלות צלזיוס למשך לריכוז סופי של 10 ng / ml.
    4. מוסיפים את בקבוק 500 מ"ל הבאים לאחד Neurobasal MedIA (NBM) להכין המלא NBM: 10 מ"ל B-27 תוספת ללא ויטמין A, 5 מ"ל תוספת N2, 100 EGF μl, 100 μl פיברובלסטים Growth Factor (FGF) -Basic, 5 מ"ל B amphotericin, 0.5 מ"ל gentamycin, 5 מ"ל L- גלוטמין.
    5. כן פתרון אנזים ועדכן הודות לשילוב: 98.5 מיליליטר PBS, 1 מיליליטר collagenase-1, 0.5 מיליליטר 10x טריפסין / EDTA לעקר ידי סינון דרך המסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביים.
    6. כן או להשיג נפח קטן בינוני הנשר השונה של סטרילית Dulbecco (DMEM) / בינוני תרבות F12 תא עם סרום שור העובר 7% (FBS) ו 1x PBS ללא סידן או מגנזיום.
  2. חלוקת גידול
    הערה: עכבר נו / נו athymic מוזרק בעבר עם תאים סרטניים באגף הימני ואפשר ממסת גידול מוחשית יש צורך בהליך זה. בדוגמות המוצגות כאן, השתמשנו תאי GBM חולה נגזר xenograft, JX10 ו JX12 17.
    1. לעקר אזור העבודה על ידי ריסוס כלורהקסידין 2% ולהקים שנינות עבודה באזורh כלים דרושים / אספקה ​​כולל צ'אק פנוי, מלקחיים, אזמל, זכוכית צלחת פטרי, פתרון אנזים, PBS, כלורהקסידין (ראה איור 2 א).
    2. להרדים עכבר / עכברים מחסת גידול אגף. כוון שיעור עקירה 20% / min של CO 2 באמצעות 30% CO 2. לאחר עכבר תערוכות דום נשימה, לשמור על זרימת CO 2 דקות על 1 (בדרך כלל 3 דקות בסה"כ). עכברים יוסרו מאולם נקע בצוואר רחם מבוצע כאישור המתת חסד משני. תרסיס החיה עם chlorhexidine 3% כדי לטהר עור.
    3. תוך כדי לחיצה על העכבר יציב, לעשות חתך בעור חצי עגול ~ 1.5 סנטימטרי מסת גידול (גידול מושתל אגף) באמצעות אזמל חד פעמי סטרילי עם 11 להב # החל גולגולתי למסת גידול חריטה כלפי הבטן של העכבר מסביב לבית סוף הזנב.
    4. Reflect עור מעל מסת גידול באמצעות אצבעות עם מתיחה עדינה על סוף הזנב של החתך ולאחר מכן לדחוף על עורמשטח לרומם גידול לקבל הגישה טובה ביותר בלי לגעת הגידול (ראה תרשים 2B).
    5. השתמש דיסקציה קהה עם מלקחיים כדי מסת הגידול בחינם בעדינות קיר הבטן ואת מהעור (ראה איור 2 ג).
    6. העברת מסת גידול עם מלקחי צלחת פטרי זכוכית סטרילית (אין להשתמש צלחות פלסטיק כדי למנוע שביר במהלך מיותר) ו כראוי להשליך פגר ומניחים מכשירים אלה הצידה.
    7. השתמש סט חדש של מכשירים סטריליים (אזמל עם להב # 11, חצי מעוקל מלקחיים) כדי debride רקמת גידול של רקמות נימקי גידול כיסוי רקמת חיבור מארח קרומי.
    8. מניח 15 מיליליטר פתרון אנזים בבקבוק סטרילי פרק-trypsinizing עם בר ומערבב ומתחיל לבחוש לאט בשכונה.
    9. בצלחת סטרילית זכוכית פטרי, לשטוף גידולים שנקטפו 3 - 5 פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר דם עודף (עשוי יציקה או להשתמש במזרק כדי לשטוף אותם עם PBS). בעדינות להטות צלחת pipet או לשאוב חומר הכביסה. בשר טחון finely באמצעות שני להבי # 11 אזמל (ראה איור 2).
    10. להוסיף 14 מ"ל של תמיסת האנזים הגידול pipet טחון בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים. תערובת העברה פרקה-trypsinizing בקבוק ומערבבת לאט במשך 20 דקות. הכן 5 50 צינורות חרוטי מ"ל ידי הוספת FBS 1.5 מ"ל לכל מנת לנטרל את טריפסין בשלב 1.2.11.
    11. אחרי 20 דקות, לאסוף 14 מ"ל של תמיסת התא מן הבקבוק trypsinizing ולהוסיף צינור אחד עם FBS. הוסף פתרון אנזים טרי 14 מ"ל ל בקבוקון וממשיכים לבחוש.
    12. צנטריפוגה שנאספו תאים ב XG 150 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. להוסיף 45 מ"ל של שלמה NBM על גלולה, ומערבבים בעדינות, וחזור צנטריפוגה לשטוף את בסרום. Re- להשעות גלולה ב NBM 5 מ"ל המלא והחזק על הקרח.
    13. צעדי קציר תא חזרו עבור סכום כולל של 5 יבולים, המשלבים את כל התאים שנקטפו צינור חרוטי יחיד על קרח.
    14. מניחים מסננת תא 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל. Prep tהוא התא מסננת ידי העברת 10 מ"ל של DMEM / F12 + 7% FBS באמצעות ולאחר מכן לשטוף עם 10 מ"ל PBS.
    15. לאט לאט מוסיף השעית תא מסננת, שמאפשר לו לטפטף הדרך (ראה 2M האיור). הרם בעדינות את הלשונית של מסננת התא בין כל תוספת חדשה לשבור שום ואקום ולאפשר לתאים המושעים לעבור בחופשיות (ראה 2N האיור).
    16. צנטריפוגה השעית התא המסוננת כנ"ל. Re- להשעות ב 10 מ"ל להשלים NBM ולספור לקבוע המספר הכולל של תאים קיימא באמצעות 0.04% trypan כחול hemocytometer. חזק תאים על קרח עד דור microtumor.

2. רקמות חלופיות פרוטוקול חלוק

  1. אוטומטיות Dissociator רקמות מערכת חלוקה.
    1. מניחים את הצינור חלוקה לתוך Dissociator הסלולר, בחר את התוכנית "גידול _02_02" ולהתחיל העיתונות ולרוץ 32 שניות. צינור העברת Rotator, מקום 37 ° C חממה עבור 40 דקות.
    2. צנטריפוגה מושעה תאים ב XG 150 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. בעוד centrifuging התאים, להגדיר ריאגנטים לעיבוד של השעית התא. הוסף 10 מ"ל NBM סרום ללא ההשעיה triturate בעדינות.
    3. לאחר צנטריפוגה, להשיג תא גלולה המכילה ~ 10 - 30 x 10 6 תאים קיימא (~ 0.3 מ"ל). מחדש תלויה גלולה ב 10 מ"ל סרום ללא NBM (ראה 2 טו איור). קבע את תאי קיימא על ידי assay דרה (ראה שלב 3.2.2).

3. Microtumor דור

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכן מלאה NBM כמו 1.1.4 ולהכין biogel האדם בצפיפות גבוהה המנוטרל (HuBiogel) (HDHG ב 3 מ"ג / מ"ל) לכל פרוטוקול פנימי. מטריצות biogel דומות יכולות לשמש גם כן.
  2. Microtumor הפקה ותרבות
    1. השג טרי תאים ניתקים PDX כמו השעית תא יחיד מלאה NBM, על קרח.
    2. מערבבים את התא suspension עם נפח שווה של פתרון הכחול trypan (0.4% ב PBS) ולנתח באמצעות hemacytometer כדי לקבוע מספר תא כדאי על ידי הרחקה הכחולה trypan 18. הסר נפח צורך ליצור 50,000 תאים / microtumor שבו נפח = (50,000 תאים / גידול * # גידולים) / (תא קיימא לספור / 1 מ"ל) ומקום לתוך צינור חרוטי טרי.
    3. תתרכז תאים על ידי צנטריפוגה ב XG 150 עבור 8 דקות, בטמפרטורת חדר. בטל supernatant ו resuspend התא גלול עם פתרון HDHG קר כקרח על יחס סופי של 1 תאי חלק FBS ו -4 חלקים HDHG.
    4. השתמש פיפטה רבה אלקטרונית לוותר 10 μl לכל תערובת סיכת התא-HDHG לצלחת פלדה 96 פינים (עם ציפוי הידרופובי) כדי ליצור microtumors (2 חרוזי מ"מ שכל אחת מהן מכיל 50,000 תאים).
    5. מניח חרוזי גידול 3D בתוך חממה בתרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, humidified) במשך 15 דקות כדי gelate החרוזים.
    6. לאחר gelation, להעביר את microtumors (10 μ; L) אל חדר תרבות השעיה מותאמת אישית (50 מיליליטר) או צלחת תרבות נפח גדולה (10 סנטימטרים) המכיל NBM המלא בעזרת פיפטה רב ערוצית האלקטרוני סיכת מכשיר מותאם אישית.
    7. אחרי 1 - 2 ימים בתרבית רקמה החממה, להעביר microtumors צלחות תרבות 96-היטב המכיל 50 μl NBM / גם באמצעות בעל פיה רחבה מחלק פיפטה ולבצע פרוטוקולי assay וניתוח שונות.
  3. טיפול תרופתי ותחזוקה של microtumors
    1. בחר ריכוזים סופיים עבור בדיקות סמים.
      הערה: אם התרופה שידעה יעילה בתרבות 2D, בחרו פי 2 IC 50 כמו ריכוז המנה באמצע ובחר 3 דילולים סדרו מעל ומתחת עבור סכום כולל של 5 רמות מינון. לדוגמא, אם IC 50 הוא 9 מיקרומטר לתרופה בתרבות 2D, בחר 2 מיקרומטר, 6 מיקרומטר, 18 מיקרומטר, 54 מיקרומטר, ו -162 מיקרומטר כמו ריכוז סופי עבור בדיקות סמים.
    2. כן פתרון מינון תרופת 2x ב מוחלט NBM מ דימתיל sulfoxiדה (DMSO) מניות. לדלל פתרון מינון בינוני 1% DMSO להכין דילול סדרתי 5 מנה, פי 3.
    3. הוסף 50 μl של פתרון מינון אל microtumor היטב המכיל 50 μl צלחות assay כדי להשיג ריכוז DMSO הסופי של 0.5%. חזור על פעולה עבור כל לשכפל (למשל, 4) בכל מנת תרופה שנקבעה 3.3.1.
    4. לשמור על תרבויות ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, בתרבית רקמה החממה humidified עבור 1 - 14 ימים. תרבויות Feed פעמים בשבוע על ידי רענון תקשורת פתרון תרופה כנ"ל.

מורפולוגי 4. וניתוח פנוטיפי של Microtumors

  1. לקבוע מורפולוגיה תא microtumors באמצעות מכתים לחיות תאים סטנדרטיים.
    1. כן 1 מ"מ מניות של Calcein-AM ב DMSO. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    2. במרווחי זמן תרבות הרצוי (1, 7, ו -14 ימים), ולהוסיף פתרון Calcein-AM ערוכים PBS (ללא Ca / Mg) לצלחת 96-גם עבור 1 מיקרומטר הריכוז הסופי.
    3. לִדגוֹר20 דקות בתוך CO% 37 מעלות צלזיוס, 5 2, חממת humidified, ותמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 2X, 4X, ו 10X (עירור: 450 - 490 לעבור להקת ננומטר, פליטה: 515 מסירה ארוכה ננומטר, Dichroic 500 ננומטר) .
  2. צמיחת Microtumor / Assay הפצת הנשק
    1. ממיסים אבקת MTT ב PBS (ללא Ca / Mg) להכין מלאי 12 מ"מ. סינון סטרילי, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. במרווחי זמן תרבות הרצוי (1, 7, ו -14 ימים), להוסיף 20 μl של פתרון MTT לצלחת 96-היטב לכל 100 נפח תרבות μl. דגירה 2 שעות באינקובטור בתרבית רקמה.
    3. כן הפתרון תמוגה טרי של 10% SDS ב 0.01 M HCl ולהוסיף סכום השווה נפח תרבות צלחות. דגירה צלחות אטומה לילה 37 ° C חממה.
    4. קראו ספיגה ב 570 ננומטר באמצעות קורא רב-צלחת.
  3. הכנת Microtumor עבור ניתוח Kinomic
    1. הכן חיץ תמוגה ידי מראש מצמרר עד 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הוספת 1: יחס 100 כל אחד 100x Proחלבון phosphatase מונע (PPI) ו 100x חלבון מעכבי פרוטאז (PI). מערבבים היטב ולשמור על הקרח.
    2. העברת 2 microtumors לכל אחת משלוש 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge. הסר supernatant ולהוסיף 40 μl של חיץ תמוגה המכיל PPI ו PI לצינור כל lyse למשך 30 דקות ב 4 ° C.
    3. דגימות פיפטה במרץ לשבור חרוזי גידול. צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C דגימות ולאחסן ב -80 ° C עד לניתוח kinomic.

5. Profiling Kinomic של Microtumors

  1. פרופיל חלבון טירוזין קינאז (PTK)
    1. ריאגנטים ההפשרה (10x חלבון קינאז (PK) חיץ אלבומין בסרום שור 2% (BSA)) עד 4 ° C טען PK חיץ (300 μl 10x PK חיץ המניות 2.7 מ"ל DH 2 O) לתוך מזרק בעמדה מס '2 על פרופיל פּלַטפוֹרמָה.
    2. פתח את תוכנת assay קינאז ו לטעון את קובץ פרוטוקול PTK ולחץ על 'START', המפרש דגימות בתוך softwהם תוכנית לאחר שבבי סריקה. מניחים שבבי על פלטפורמת פרופיל והעומס 25 μl של 2% שור סרום אלבומין (BSA) למערך והקש LOAD להתחיל פרוטוקול שבשליטת תוכנה לחסימת צעד.
    3. לדלל 6 מיקרומטר של 100 המניות mM ATP עם 54 μl DH 2 O להפוך 10 מ"מ אדנוזין אדנוזין (ATP). כשהתוכנה מתחילה ה -3, ו צעד לשטוף סופי (גלוי על מסך) להביא 15 מיקרוגרם של lysate הביאו עד 28 μl עם DH 2 O, לערבב ולהוסיף למערך.
    4. הכן תערובת מאסטר PTK (MM) (עד 12 דגימות). להוסיף 32.6 μl DH 2 O כדי לשקם dithiothreitol (DTT) ולהוסיף 6 μl DTT, ו -60 μl 10x PK פתרון, כדי צינור PTK-MM1 (כבר מכיל 60 μl 10x BSA).
    5. חכה עד בתשובה לשאלה 'האם טען' בתוכנה assay קינאז מופיע ולאחר מכן להוסיף 126 μl של PTK-MM1, 60 μl כתוסף PTK, ו -60 μl 10 מ"מ ATP כדי MM2 (מכיל בעבר aliquoted 4.5 μl נוגדן PY20 FITC) ומערבבים.להוסיף 16 μl של תמהיל מאסטר PTK זה על צינור אחד lysate מדגם ו פיפטה לערבב 5 פעמים.
    6. ודא מכסה זכוכית נקיה ולאחר מכן להוסיף 35 lysate μl / לערבב מאסטר למערך, מכסת קרוסלה קרובה, ואת כפתור Load העיתונות.
  2. פרופיל סרין / תראונין קינאז (STK):
    1. ריאגנטים הפשרה (חיץ PK 10x, 10x STK חיץ, ו -2 BSA%) ל -4 מעלות צלזיוס. חיץ PK טען (300 μl ב 2.7 מ"ל DH 2 0) למצב מזרק # 1, 1:10 ו חיץ STK (300 μl ב 2.7 מ"ל DH 2 0) למצב מזרק # 2.
    2. פתח את תוכנת מחשב assay קינאז ו לטעון את קובץ פרוטוקול STK ולהתחיל עיתונות, המפרש דגימות בתכנית לאחר שבבי סריקה. מניחים שבבי על פלטפורמת פרופיל והעומס 25 μl של 2% BSA למערך, ולאחר מכן הקש LOAD להתחיל את הצעד חסימת שבשליטת תוכנה פרוטוקול.
    3. לדלל 6 מיקרומטר של 100 מ"מ ATP עם 54 μl DH 2 O. במהלך סופי (3 rd) לשטוף צעד תמהיל2 מיקרוגרם של lysate ולהביא עד 32.6 μl עם DH 2 O, לערבב ולהוסיף למערך.
    4. הפוך תערובת אב STK: הוסף 70 μl 10x PK צינור STK-MM1 (מכיל 7 μl 100x BSA), ולאחר מכן להוסיף 42 μl DH 2 O צינור STK-MM1.
    5. חכה עד בתשובה לשאלה 'האם טען' בתוכנה assay קינאז אז: הוסף 18 μl 10 מ"מ ATP כדי STK-MM1, ולהוסיף 9 μl MM1 לכל lysate המדגם. לערבב היטב.
    6. ודא מכסה זכוכית נקיה ולהוסיף 35 lysate μl / לערבב מאסטר למערך, מכסת קרוסלה קרובה, ולטעון עיתונות.
    7. במהלך סופי (3 rd) שלב לשטוף להוסיף נוגדנים משני 1.05 μl STK-FITC צינור DMAB (מכיל 3.03 לערבב נוגדן ראשוני STK μl), להוסיף 39.6 μl AB הצפת DMAB, להוסיף 356.0 μl DH 2 O ל DMAB, להוסיף 30 μl כדי DMAB לכל מערך, ולטעון העיתונות .
  3. ניתוח של Kinomic נתונים 19,20
    1. תוכנת ניתוח להרחיב ולטעון את ניתוח התמונה App. Select תיקיית תמונות המכילה תמונות מערך שלם המינימרקטים זמן חותם על נתוני PTK או STK, קובץ פריסת מערך מתאים מספר מאמר בחר (86,312 עבור PTK ו 87,102 עבור STK), ועומס שנוצרו בעבר קובץ ביאור מערך.
    2. ודא gridding הנכון של כל התמונות, ולהפעיל זמן חשיפה קנה מידה App. סטטיסטית להשוות חשיפה / מדרון ערכים טרנספורמציה log2, ולאמת עם עקומות הקינטית לכביסה מוקדמת 19-21.
    3. להריץ תוכנות חיזוי קינאז זרם לשאילתא פרופילי kinomic שינו בין תנאים קינאזות זרם 22,23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הראינו כי מערכת תרבות biogel 3D תומכת צמיחה לטווח ארוך ותפקוד של סוגי תאים מרובים. בפרויקט שיתופי זה, xenolines GBM נגזרות החולה (PDX) משמש להפקת מאות microtumors. תאים ניתקים (3 x 10 5) או neurospheres (40 - 50) היו משובצים חרוזי biogel (2 מ"מ) ואחרי gelation המהיר הם בתרבית bioreactor אישית תקשורת NB המלאה. כדאיות סלולרית (Calcein-AM), פרופיל צמיחה (MTT), וניתוח מבוסס מערך פעילות kinomic נקבעו. microtumors PDX מתוחזק ארגון רב-תאיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול בעיקר מתייחסים microtumor הדור, כמו גם מינון תרופה ותחזוקה. מכיוון חרוזי microtumor הם שבירים יכולים להיקרע בקלות, בזהירות רבה נחוצה הוא בשלבי ההתפתחות של assay ותחזוקה. אם מתרחשת שגיאה במהלך אחד מהתהליכים אלה, אפשר להתפשר פרשנות ניסיון, גרימת רחבה או חזרה מיותרת של הניסויים או אפילו הדרת נתונים.

שינויים ופתרון בעיות, במיוחד של תהליך פיתוח microtumor, כללו תכנון וייצור של כלי הידרופוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

R.S. ו-R.S.S. הם עובדים של Vivo Biosciences. J.C.A. ממומן בחלקו על ידי UAB Kinome Core.

תודות

נתמך על ידי מענק R21 NIH (PI: ג Willey, CA185712-01), בפרס נבג גידול במוח (PD: GY גילספי, P20CA 151,129-03) וחוזה SBIR (PI: ר 'סינג, N43CO-2,013-00,026).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז-I סיגמא-אולדריץ'CO130
טריפסין EDTA (10x)Invitrogen15400-054 
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 SupplementLife Technologies17502-0481x ריכוז סופי
B-27 עם ויטמין ALife Technologies12587-0101x ריכוז סופי
רקומביננטי אנושי FGF-basicLife TechnologiesPHG026610 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
רקומביננטי אנושי EGFLife TechnologiesPGH031510 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
L-גלוטמיןקורנינג Cellgro Mediatech25-005-CI2 מ"מ ריכוז סופי
FungizoneOmega ScientificFG-702.5 ומיקרו; גרם/מ"ל ריכוז סופי
פניצילין סטרפטומיציןאומגה מדעיPS-20100 יח'/מ"ל פניצילין G, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין ריכוז סופי
GentamicinLife Technologies15750-06050 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
MTTLife TechnologiesM6494מוכן ל-5 מ"ג/מ"ל ב-PBS ומסונן סטרילי, 1 מ"ג/מ"ל בבאר
SDSFisherBP166למאגר ליזה MTT, מוכן ל-10% ב-0.01  M HCl, 5% בבאר
HClFisherA144SI-212עבור מאגר ליזה MTT, מוכן ל-0.01  M עם SDS, 5 mM בבאר
Calcein AMLife TechnologiesC14301 mM במלאי DMSO, 2  ומיקרו; M בתמיסת צביעה PBS, 1  ומיקרו; M בבאר
האלט' s קוקטייל מעכב חלבון פוספטאז Pierce ThermoScientific78420יחס של 1:100 ב-MPER 
מעכב חלבון פרוטאז של Halt Pierce ThermoScientific87786יחס של 1:100 במגיב מיצוי חלבון יונקים MPER
(MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisherBP231להמסת סידן AM ותרכובות
מלח חוצץ פוספט ללא Ca/MgLonza17-517Qמדולל ל-1x עם מים אולטרה-טהורים של MiliQ ומסוננים סטריליים (לתרבית תאים)
תמיסת מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco עם Ca/MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CVמדולל ל-1x עם מים אולטרה-טהורים של MiliQ (לשטיפה מראש)
פרוטוקולפורמלין 10% חוצץ ניטרלי032-060
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
מעכב חלבון פוספטאז בצפיפות גבוהה של HubiogelVivo BiosciencesHDHG-5
Halt'sPierce78420
מעכב פרוטאז חלבון של Halt'sPierce87786
מגיב מיצוי חלבון יונקים (MPER)Thermo Scientific78501
שבב פרופיל מערך חלבון טירוזין קינאז (PTK)PamGene86312
מאגר קינאז PTKPamGene36000300 ומיקרו; l מלאי חיץ PK 10x ב-2.7  ml dH2O, מספר קטלוגי לערכת ריאגנטים PTK
ATPPamGene36000מספר קטלוגי לערכת ריאגנטים PTK
PY20- נוגדן מצומד FITCPamGene36000מספר קטלוגי לערכת ריאגנטים PTK
תוסף PTKPamGene32114
צינור PTK-MM1 (10x BSA)PamGene36000לערכת
ריאגנטים PTKשבב פרופיל מערך סרין/תראונין קינאז (STK)PamGene87102
מאגר קינאז STKPamGene32205מספר קטלוגי עבור ערכת ריאגנטים STK
תערובת נוגדנים ראשונית STK (צינור DMAB)PamGene32205עבור ערכת ריאגנטים STK
נוגדן משני מצומד FITCPamGene32203
STK-MM1 (100x BSA)PamGene32205מספר קטלוגי לערכת ריאגנטים
STK מאגר נוגדניםSTK PamGene32205מספר קטלוגי לערכת ריאגנטים STK
ציוד
#11 להבים, סטריליפישר3120030
#3 ידיות אזמל, סטריליפישר08-913-5
צלחות פטרי זכוכית 100 מ"מפישר08-748D
מלקחיים מעוקלים למחצהפישר12-460-318
בקבוק טריפסיניזציהפישר10-042-12B
מערבל מגנטיפישר14-490-200
3/4 אינץ' מוט ערבובפישר14-512-125
מסננת תאים BD Fisher#352340
B-D 50 מ"ל צינור צנטריפוגהFisher#352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 תוכנת ניתוח קינומי תוכנת בדיקת PamGene
Evolve KinasePamGene
UpKin (חיזוי קינאז במעלה הזרם)PamGene
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
מערכת תרבית תאים סיבובית (RCCS)SyntheconRCCS-Dעם 10 מ"ל HARV חד פעמי
מספר קטלוגי מספר קטלוגי צינור תוכנת אפליקציית

מקורות

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MTT
דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.