כתב יד זה מתאר את השימוש בזן ביולומינסנט של טריפנוזומים אפריקאים כדי לאפשר מעקב אחר זיהום בשלב מאוחר ומדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה חיה in vivo כדי להמחיש זיהומים בתוך מערכת העצבים המרכזית בזמן אמת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה
במאמר זה
סיכום
תקציר
טריפנוזומיאזיס אפריקאית אנושית (HAT) היא מחלה רב-שלבית המתבטאת בשני שלבים: שלב מוקדם בדם ושלב מאוחר שבו הטפיל פולש למערכת העצבים המרכזית (CNS). מחקר in vivo של השלב המאוחר היה מוגבל מכיוון שהמתודולוגיות המסורתיות דורשות הסרת המוח כדי לקבוע את נוכחות הטפילים.
הדמיית ביולומינסנציה היא צורה לא פולשנית ורגישה ביותר של הדמיה אופטית המאפשרת הדמיה של פתוגן שעבר טרנספקט לוציפראז בזמן אמת. על ידי שימוש בזן טריפנוזום שעבר טרנספטציה שיש לו את היכולת לייצר מחלה בשלב מאוחר בעכברים, אנו מסוגלים לחקור את הקינטיקה של זיהום במערכת העצבים המרכזית בבעל חיים בודד במהלך ההדבקה, כמו גם לצפות בתנועה ובהתפשטות של זיהום מערכתי.
כאן אנו מתארים פרוטוקול חזק לחקר זיהומים במערכת העצבים המרכזית באמצעות מודל ביולומינסנציה של טריפנוזומיאזיס אפריקאי, המספק תצפיות לא פולשניות בזמן אמת שניתן לנתח עוד יותר עם גישות אופציונליות במורד הזרם.
מבוא
טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי (HAT), או מחלת שינה, נגרמת על ידי טפילי הפרוטוזואה הנישאים על ידי וקטור של Trypanosoma brucei spp1. המספר המשוער של המקרים הנוכחיים הוא פחות מ-7,000 מדי שנה, כאשר כמעט 70 מיליון אנשים חשופים לסיכון של זיהום הטפיל ביבשת אפריקה. המחלה, שהיא לרוב קטלנית אם לא מטפלים בה, כוללת שלב המולימפטי מוקדם שבו טפילים נמצאים בדם, ומתקדמת לשלב מאוחר שבו טפילים פולשים למערכת העצבים המרכזית (CNS) ואינם רגישים עוד לטיפול על ידי תרופות טריפנוזומליות בשלב מוקדם2. לטיפולים התרופתיים הנוכחיים ל-HAT בשלב מאוחר יש משטרי טיפול מורכבים וממושכים ותופעות לוואי חמורות כמו גם עמידות מדווחת, ולכן מחקר על טיפולים תרופתיים חדשים הוא הכרחי
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אֶתִיקָה
כל העבודה בוצעה תחת אישור של בעלי חיים משרד הפנים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 בלונדון סקול אוף צער בעלי חיים רפואה היגיינה & Tropical המועצה לביקורת אתיקה. ARRIVE מנחה מלוות בדוח זה.
1. בקטע Vivo של Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei
- הסר מניה cryopreserved (המכונה stabilate) של T. ב. brucei זן GVR35-VSL-2 (זמין פרופ 'ג'ון קלי ב"לונדון סקול אוף להיגיינה ורפואה טרופית & דרך MTA) 9 מ חנקן נוז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב התקדמות המחלה בעקבות זיהום של עכברים עם ט ב. brucei, מודל trypanosomiasis אדם אפריקני. איור 1 מציג את ציר הזמן של פרוטוקול הניסוי, הוכיח את לוח הזמנים עבור טיפול שלבים והדמיה. איור 2 הדגים שדה טיפוסי של נוף כתם דם Giemsa מוכתם קבוע משמש לכמת parasitemia ההיקפי, עם trypanosomes ותאי דם אדומים הנוכחי. פיתוח של הזיהום בחיות יכול להיות מלווה מדידת פליטת האור כמו באיור 3,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההתפתחות המינית של ט bioluminescent ב. זן brucei GVR35 מאפשר הדמיה של זיהום trypanosome מן המוקדמות בשלב מאוחר. מודלי זיהום קודמים לא הצליחו לזהות בשלב מאוחר, כאשר טפילים הם במוח, בזמן אמת במיקרוסקופ סרט דם, ודרשו קולינג והסרת המוח של עכברים הנגועים לקבוע טפיל נטל 12. פליטת אור מפחית השתנות בין עכבר כמו עכבר אחת ניתן לעקוב לאורך כל כולו של זיהום הערכה איכותית מהירה של זיהום ניתן לראות בכל שלב. השיטה רגישה מאוד של הדמיה פליטת אור מאפשר זיהום בר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים ג'ון קלי מרטין טיילור (London School of Medicine טיפוח טרופי) למתן ט ב. GVR35-VSL-2 brucei וד"ר אנדריאה Zelmer (LSHTM) עצה הדמיה in vivo. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית ביל ומלינדה גייטס גלובל בריאות (OPPGH5337 מספר מענק).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| PBS | Sigma, בריטניה | P4417 | טבליות pH 7.4 |
| גלוקוז | סיגמא, בריטניה | G8270 | 99.5% (מולקולרי) |
| אמוניום כלוריד | סיגמא, בריטניה | A9434 | 99.5% (מולקולרי) |
| הפרין (מלח ליתיום) | סיגמה, בריטניה | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, UK | 10500-064 | 500 מ"ל |
| DPBS | סיגמא, בריטניה | D4031 | סטרילי מסונן |
| מר פרוסטי | נלג'ן, בריטניה | ||
| ג'ימסה | סיגמה, בריטניה | G5637 | |
| D-לוציפרין | פרקין אלמר, בריטניה | ||
| סיגמא, בריטניה | 115144-35-9 | ||
| דימינאזן אצטוראט | סיגמה, בריטניה | D7770 | כיתה אנליטית |
| IVIS לומינה II | פרקין אלמר, בריטניה | מצלמות ביולוגיות אחרות זמינות e. מבית Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, | תוכנה קניינית בריטית למכשירי Perkin Elmer IVIS; מכשירים אחרים עשויים להיות בעלי | |
| גריינר ביו-אחד | N2516 | ||
| 21 גרם מחטים | גריינר ביו-אחד | N2138 | |
| שקופית מיקרוסקופ חלבית כפולה | VWR, בריטניה | 631-0117 | |
| 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה | StarLab, בריטניה | I1415-1000 | |
| 7 מ"ל שפופרת ביז'ו | StarLab, בריטניה | E1412-0710 | |
| מסנן עכבר | סיגמא, בריטניה | Z756903 | הריסון שלנו נעשה בבית, זהו דגם דומה |
מקורות
- Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).
- Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).
- Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
