בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

סיכום

נוזל המרה הוא מקור יקר לשלפוחיות חוץ-תאיות/אקסוזומים המכילים סמנים ביולוגיים בעלי פוטנציאל חשוב. פרוטוקול זה מייצג שיטה חזקה לבידוד אקסוזומים ממרה אנושית לניתוחים נוספים כולל פרופיל miRNA.

תקציר

מחקר Exosome בשלוש השנים האחרונות הרחיב מאוד את ההיקף לקראת זיהוי ואפיון של סמנים ביולוגיים והשימושים הטיפוליים שלהם.

Exosomes הוכחו לאחרונה להכיל מיקרו-רנ"א (מירס). מירס עצמם שהתעורר כסמנים ביולוגיים חשובים למטרות אבחון. כמו אוסף דגימה הניתנות במרפאות ובבתי חולים משתנה מאוד, בידוד מירנה מן המרה כולו משתנה באופן משמעותי. כדי להשיג פרופילים מירנה חזקים, מדויקים לשחזור ממדגמים מרים שנאספו בצורה פשוטה הנדרש לפיתוח פרוטוקול באיכות גבוהה לבודדים ולאפיין exosomes מן המרה. השיטה מחייבת מספר centrifugations וצעד סינון עם צעד ultracentrifugation סופי כדי גלול exosomes המבודד. מיקרוסקופי אלקטרונים, כתמים מערביים, cytometry זרימה וניתוח אופטי ננו-חלקיקים רב-פרמטר, הדבר אפשרי, הם צעדי אפיון חיוניים כדי לאמת את איכות exosomes. עבור הבידוד של מירנה מן exosomes אלה, תוקע את lysate עם מירנה שאינו ספציפי, סינטטי מזן כמו elegans Caenorhabditis, כלומר, Cel-miR-39, חשובים לנורמליזציה של יעילות מיצוי RNA. בידודו של exosome מנוזל המרה הבא שיטה זו מאפשר מירנה המוצלחת פרופיל ממדגמים מרים מאוחסנים במשך מספר שנים ב -80 מעלות צלזיוס.

מבוא

כמו נוזלים ביולוגיים אחרים, כלומר, חלב אם, פלזמה או שתן, מרה מכילה exosomes, שלפוחית ​​עשירה שומנים ^1-4. Exosomes יכול לגרום או לשנות תפקודים ביולוגיים בתאי נמען ^{5, 6,} צורה של תקשורת בין תאים שעלול להיות חלק התפקוד התקין שלהם ^{4, 7-9.} Exosomes יכול להכיל מיני מירנה אשר יכול לספק מקור חשוב של סמנים ביולוגיים לאבחון ^10. פרופילים miRNAs שלנו זכו לתשומת לב משמעותית בשנים האחרונות כסמנים דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים עבור מגוון רחב של מחלות ^11-14.

ניתן למצוא מירנה עצמה נוזלים ביולוגיים, ואולי שפורסמו על ידי תאים מתים ואת כמות התאים המחסן יכול להיות מושפע במידה רבה על ידי המחלה הבסיסית. הפרופיל מירנה של exosomes אינו משקף בהכרח את פרופיל מירנה של שמקורם בתא ^{6, 10, 15-17,} עדיין exosomes עשוי לשאת חתימות מירנה שעשויה להיות מאפיין עבור ce ההוריתll כמו תאים סרטניים. Exosomes הנגזרות גידול זוהתה בפלזמה של חולים עם אדנוקרצינומה ריאות, סרטן הערמונית וגידולים אחרים ^{8, 16, 18.}

המטרה של שיטה זו היא הבידוד האמין ויציב של exosomes דגימות מרת אדם, בלתי תלויות בעיקרם כיצד לטפל בדבר ומראש. הוא פותח כדי לנצל מרה כמקור אמין של מירנה לאבחון פוטנציאל של מחלות של צינור המרה כגון בכיס המרה ^19. זה מורכב של מספר שלבים של צנטריפוגה עם הגדלת מהירויות לבודד exosomes ו שעשויים לחול על נוזלים ביולוגיים אחרים.

פרוטוקול

קבלת המרה מחולה ידי cholangiopancreatography מדרדר אנדוסקופית (ERCP) טעון אישור פרוטוקול מחקר בבני אדם על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי. כל העבודה המוצגת כאן אושרה על ידי הדירקטוריון סקירה מוסדיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. בידוד Exosome מן המרה

1. בצע cholangiopancreatography מדרדר אנדוסקופית (ERCP). מניחים את המטופל במצב שכיבה ו לצנרר.
   1. העבר ערך מסוג duodenoscope דרך הפה של המטופל להכניס אותו לתוך החלק השני של התריסריון ולזהות את הגבשושיות הגדולות.
   2. סלקטיבי cannulate צינור המרה המשותף על ידי החדרת לומן משולש sphincterotome טעון מראש עם guidewire הידרופילי 0.035 אינץ '(0.9 מ"מ).
   3. לקדם את guidewire תחת הדרכתו fluoroscopic אל צינור כבד השמאל מאז בהזדמנות זה יכול להיות קשה להבדיל צינור פיברוזיס מן הצינור הכבד התקין, אז לקדם אתsphincterotome 5 ס"מ לתוך צינור המרה לרכוש עמדה יציבה.
   4. הסר את guidewire, לצרף מזרק 10 מ"ל לנמל guidewire דרך המנעול Luer לשאוב מרה באמצעות 10 מ"ל של לחץ שלילי.
   5. הסר את המזרק המכיל את מרה להמשיך עם ERCP ידי והכנסה מחדש של guidewire והזרקת חומר ניגוד דרך נמל הזרקת opacify העץ המרה.
   6. מעבירים את מרה שנאספו לתוך צינור 15 מ"ל על קרח ולשמור על הקרח עד מוכן להמשיך לשלב צנטריפוגה.
      זהירות: יש להשתמש בכפפות כדי להגן על עצמך ועל הדגימות! פנק את המרה כמקור פוטנציאלי לזיהום כפי שהוא יכול להכיל חלקיקים הפטיטיס ויראלי!
   7. שמור את המדגם (ים) על קרח. כך או להמשיך עם שלב 1.2 או צנטריפוגות ב XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן להקפיא ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
      הערה: דוגמאות מאוחסנות בדרך זו במשך מספר שנים כבר בשימוש שיגרתי עם תוצאות טובות ^19.
2. העברת 400 μl של מרה לתוך צינור microcentrifuge ולאסוף תאים פסולת התא על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. הסר את supernatant ידי pipetting, להעביר צינור microcentrifuge טרי צנטריפוגות לדוגמא (ו) ב 16,500 XG במשך 20 דקות אחרות ב 4 ° C כדי לנקות את supernatant של פסולת נוספת. מחק את הצינורות הפסולים Biohazard. לחלופין, לסובב את הדגימות בתוך ultracentrifuge במקום.
4. אסוף את supernatant ולסנן אותה בתוך ארון בטיחות ביולוגי עם מזרק דרך פילטר קרום 0.2 מיקרומטר polyethersulfone (PES) אשר יש ספיקות טובות וחלבון נמוך מחייבים להסיר כל חלקיקים גדולים יותר מ -200 ננומטר עזבו.
5. Pipet את supernatant המסונן ultracentrifuge צינורות ולהוסיף PBS כך הצינורות הם יותר 2/3 מלאים. אם הצינורות מכילים פחות נוזלים מזה, הצינורות יקרסו במהלך צנטריפוגה! צינורות ניתן לכבס, autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר מספר פעמים.
6. פלואח exosomes דרך ultracentrifugation ב 120,000 XG במשך 70 דקות ב 4 ° C. לאחר מבט צנטריפוגה בתחתית צינור ultracentrifuge לפעמים לראות כדורים צהובים קטנים; אלה הם exosomes.
7. בטל supernatant ידי בקפידה decanting זה ולחטא את פסולת על ידי הוספת אקונומיקה לריכוז סופי של נ 10% v / ולתת לו לעמוד במשך 20 דקות.
8. בניסויים במורד זרם, או לעבד את הגלולה (ים) בנפח קטן של הפתרון המתאים (כלומר, assay radioimmunoprecipitation (Ripa) חיץ לבידוד חלבון, חיץ תמוגה RNA לבידוד miR) או resuspend אותו 50-150 μl של פוספט שנאגר מלוחים (PBS) אשר ניתן לאחסן גם ב -80 ° C לשימוש עתידי (תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת (qRT-PCR) או מיצוי חלבון וכו ') או בשימוש לאפיון של התכשיר exosome ידי TEM או ניתוח אופטי ננו-חלקיקים .

2. Exosome זיהוי על ידימיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) או CryoEM

1. Resuspend שלפוחית ​​תאית 100 μl של PBS על ידי pipetting. באופן אידיאלי, להשתמש exosomes שלא היה מאוחסן ב -20 ° C או -80 ° C, במיוחד בעת ביצוע הבידוד בפעם הראשונה.
2. לספוג aliquot 20 μl (כ -2 מיקרוגרם) ל -400 רשתות נחושת Parlodion רשת מצופה פחמן למשך 2 דקות ולאפשר לו להתייבש ב RT.
3. תקן את exosome ב -1% (v / v) glutaraldehyde (EM-כיתה) במשך 5 דקות ב RT על ידי הצבת טיפות בזהירות על הכנת יבשים.
4. שטוף את הרשתות פעמים במים במשך 5 דקות ולאחר מכן בניגוד כלי רכב חשמלי כתם עם חומצת phosphotungstic 1% (PTA) למשך 30 שניות.
5. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ אלקטרונים עם מתח אץ של 80 kilovolts החל בהגדלות של 20,000X והגדלה כדי 100,000X בעת קביעת גודל החלקיקים.
   הערה: preps אחר כמו שכבות על גבי 200 רשתות נחושת או ניקל רשת Formvar מצופה פחמן והניגודיות המכתים like 1% או 2% אצטט uranyl במשך 10-15 דקות גם אפשרי.
6. לקבלת CryoEM, לערבב aliquot 20 μl (כ -2 מיקרוגרם) עם 60 10 זהב μl חלבון G ננומטר (1: 3 יחס). זה יעזור לקבוע את קוטר exosome.
7. העברת הדגימות על רשתות פחמן מחורר-משוחרר זוהרות במול C ולהסיר נוזל עודף ידי סופג. להקפיא את הרשתות על ידי טבילה אותם מייד לתוך אתאן נוזלי.
8. הר הרשתות בתוך cryoholder בחנקן נוזלי.
9. רוכש את התמונות ב 200 קילו וולט עם בהגדלה של 20,000X ו 100,000X.

3. זיהוי Exosome ידי ניתוח אופטי Nanoparticle Multi-פרמטר

1. Resuspend את exosomes מבודד 100 μl של PBS על ידי pipetting.
2. לדלל exosomes ב 600 μl PBS בכמה יחסים שונים (כמו 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 ו -1: 1,200).
3. דמיינו את exosomes ידי פיזור אור לייזר עם כלי מתאים ותוכנה בזמן אמת על פי manufactu²⁰ פרוטוקול של RER.
4. להעלות את רמת המצלמה במצב לכיד עד החלקיקים להיות גלויים, אז לשנות את הפוקוס כדי להפוך את החלקיקים להיראות חלקים.
5. בעוד במצב רגיל, להקטין את המצלמה לרמה הנמוכה ביותר כי החלקיקים עדיין ניתן לראות, ואם יש צורך להתאים תריס מצלמה ורווח כדי להשיג זאת.
6. מבחינה ויזואלית לבדוק על מנת להבטיח 20-100 חלקיקים גלויים על המסך, אם לא לרוקן את היחידה ולהתאים את הדילול ב PBS.
7. ואז להתאים את משך הזמן ללכוד בין 30-60 שניות. אחרי שהסרט הוא נתפס, להתאים את הפרמטרים עיבוד עד שכל החלקיקים מזוהים על המסך ולעבד את קובץ הווידאו.

4. אפיון Exosome ידי המערב כתם

1. Lyse exosome כדורי 2-5 מ"ל של מרה 100 μl של assay radioimmunoprecipitation קרים כקרח (Ripa) חיץ עם מעכב פרוטאז ידי pipetting למעלה ולמטה ביסודיות ומערבבים lysates במרץ למשך 30 שניותעל מערבולת כדי solubilize החלבונים ביעילות.
2. בעוד רוב הזמן אין צורך, השתמש דופק-sonication של דגימות קרח עם 2 פעימות במשך 10 שניות כל מנת להבטיח תמוגה מלא.
3. גלולה חומר מסיס על ידי צנטריפוגה ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהעביר supernatant לצינור נקי.
4. קביעת ריכוז חלבון עם שיטת הבחירה (כלומר, חומצה bicinchoninic (BCA), Coomassie, שונה לורי, 660 Assay חלבון ננומטר, וכו ') על פי פרוטוקול של היצרן. השיטה היא לא חשובה כמו עוד באותה השיטה משמשת בעקביות להשגת תוצאות שניתן לעומת פני ניסויים.
5. טען 50 מיקרוגרם חלבון לכל מדגם חיץ Laemmli לאחר חימום מדגם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לתוך באר של ג'ל polyacrylamide אלקטרופורזה (עמוד).
6. Electrophorese הדגימות על ג'ל העמוד עבור 1.5 שעות ולהעביר את החלבונים המופרדים על קרום ניילון.
7. Bלנעול את קרום (ים) עם חלב ללא שומן 5% ב מלוחים שנאגרו טריס עם 0.1% Tween 20 (TBS-T) עבור 1 שעה, ואז דגירה עם נוגדנים ספציפיים-exosome כמו אנטי CD63 ואנטי-TSG-101 בדילול של 1: 500 רצוי O / N ב 4 ° C.
8. שטפו את ממברנות עם 10 דקות TBS-T 3 x, ואז דגירה עם מתאים, התאמת נוגדנים משני HRP-מצומדות ללא שומן חלב 5% ב TBS-T במשך 1-2 שעות ב RT.
9. לשטוף את הממברנה (ים) 3 x 5 דקות עם TBS-T לזהות את החלבונים הספציפיים עם ריאגנטים chemiluminescence על פי הפרוטוקול של היצרן.
10. תמונה הממברנות עם סרט או מערכת הדמיה דיגיטלית על פי הפרוטוקול של היצרן.

בידוד MicroRNA 5. מן Exosomes המבודד

הערה: בידוד של מירנה מן exosomes המר מתבצעת באמצעות בידוד מירנה שונה מבוסס על ערכה זמינה מסחרי, אבל כל שיטת בידוד RNA אחרת יכולה לשמש או מותאמת.

1. הוספת 300 &# 181; תמוגה l / חיץ הבניין גלולה exosome (מבודד 400 מרה μl), מערבולת, pipet או לעבור דרך מזרק מחט / כדי lyse exosomes לחלוטין להשיג lysate הומוגנית.
2. להוסיף 1/10 (30 μl) נפח של מירנה homogenate האפס, ומערבבים היטב על ידי vortexing או היפוך הזמן הצינור מספר.
3. דגירת התמהיל של 10 דקות על קרח.
4. הוספת נפח של פנול חומצה: כלורופורם שווה homogenate הראשונית (300 μl).
5. הוסף 5 μl של 5 fmol / μl cel-miR 39 ו מערבולת למשך 30-60 שניות.
6. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 10,000 ב RT להפריד בין המימייה (עליון) ואורגניים שלבים (נמוכים).
7. בזהירות לשאוב את השלב העליון על ידי pipetting והעביר צינור טרי תוך ציון הנפח הועבר. מחק את השלב האורגני בתוך המיכל פסולת אורגנית המתאים.
8. כדי להעשיר את RNA קטנים להוסיף 1/3 נפח של 100% אתנול לשלב מימית התאושש ומערבבים ידי vortexing ביסודיות או היפוך tuלהיות מספר פעמים.
9. Pipet את התערובת lysate / אתנול על מחסנית מסנן, עד 700 μl בכל פעם.
10. צנטריפוגה מחסניות במשך 15 שניות לכל היותר של XG 10,000 או להחיל ואקום כדי להעביר את התערובת דרך מסנן.
11. אסוף את התסנין ואם תערובת lysate / אתנול עולה 700 μl, להעביר את הזרימה דרך לצינור טרי לחזור על התהליך כדי לאסוף את כל filtrates. מסנן אלה מכיל שברי RNA נטולים RNA הקטן וניתן להשתמש בו כדי לשחזר RNAs אלה גדולים.
12. להוסיף 2/3 נפח של אתנול 100% RT אל תסנין הכולל ומערבבים היטב על ידי vortexing.
13. Pipet את תערובת תסנין / אתנול על מחסנית מסנן שנייה. כמו לפני הנפח המקסימאלי שניתן ליישמה מייד הוא 700 μl.
14. צנטריפוגות במשך 15 שניות ב XG 10,000 או להחיל ואקום כמתואר בשלב 5.10.
15. מחק את הזרימה דרך, וחזור עד שכל תערובת תסנין / אתנול סונן.
16. החל 70081; l מירנה לשטוף פתרון 1 למחסנית המסננת, צנטריפוגות במשך 5-10 שניות או להחיל ואקום וזורק את הזרימה דרך.
17. שטפו את המסנן עם פתרון 500 μl לשטוף 2/3 כפי שנעשה צעד 5.16.
18. חזור על לשטוף בפעם שנייה עם 500 μl של פתרון לשטוף 2/3 כמו בשלב 5.16, להשליך את הזרימה דרך ומניח את המסנן בחזרה צינור האיסוף.
19. ספין מחסנית מסנן דקות 1 ב XG 10,000 להסיר את כל נוזל שיורי מהמסנן.
20. מעביר את המחסנית מסנן לתוך צינור איסוף טרי ולהחיל 100 μl של חם (95 ° C) מי nuclease חופשיים אל המרכז של המסנן.
21. ספין מכלולים עבור 20-30 שניות במהירות המרבית כדי לשחזר את רנ"א.
22. אסוף את eluate ולהשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C.

תוצאות

מאז exosomes הם קטנים מדי כדי להיות מזוהים על ידי מיקרוסקופיה רגיל או cytometry זרימה, מיקרוסקופ אלקטרונים או ניתוח ננו-חלקיקים אופטיים צריך להתבצע. הניתוח האופטי nanoparticle יש יתרון על פני במיקרוסקופ אלקטרונים שזה גם כמותית ומספק התפלגות גודל וריכוז. המכשיר מציג קרן לייזר ממוקדת דק דרך פריזמה זכוכית לתוך המדגם. התנועה הבראונית של השלפוחית ​​המבודדת הוא נתפס באמצעות מצלמה רגישות גבוהה EMCCD מסומנת על בסיס מסגרת לפי מסגרת. ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (...

דיון

כדי לנצל exosomes מבודד באופן אמין מר, חשוב לנקוט אמצעי בידוד באיכות גבוהה ועקבי להשיג דגימות באיכות גבוהות בתמורה. המתודולוגיה המוגדר במאמר זה הוא דרך ומבוססת לבודד exosomes ו מירנה מן מרת אדם. זה מדגיש כמה צעדים מכריעים באפיון exosomes המבודד אשר לכל הפחות צריך מהווה במיקרוסקופ אלקטרונים או ניתוח אופטי nanoparticle ו כתמים מערביים.

הצעד החשוב ביותר בכל הבידוד של exosomes, לפחות כשמדובר יציבות מירנה, הוא לעבד מר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 ומיקרו; m מסנן ממברנה פוליאתרסולפון (PES)	קורנינג	431229
צינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליאלומר דק דופן	בקמן קולטר	331374
רוטור SW40Ti	בקמן קולטר
LM10-HS	Nanosight
לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
מעכב פרוטאז שלם	Roche מופץ על ידי Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
נוגדן נגד CD63	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871