הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

סיכום

גרורות ממלאת תפקיד משמעותי באלימות הסרטן, ומהווה כ-90% ממקרי המוות. אנו מדווחים על פרוטוקול למודל מלנומה גרורתית בעכברים השימושי לקביעת יעילותם של חומרים טיפוליים כנגד תופעה קלינית זו.

תקציר

כ-90% ממקרי המוות מסרטן בבני אדם קשורים לגרורות. למרות השכיחות והנזק היחסי של גרורות, חסרים טיפולים לטיפול או למניעה. אנו מדווחים על שיטה להקמת גרורות ריאתיות בעכברים, שימושית לחקר תופעה זו. הזרקת וריד זנב של עכברי B57BL/6J עם B16-BL6 היא בין הדגמים הנפוצים ביותר לגרורות מלנומה. חלק מתאי הגידול המסתובבים מתבססים בריאות העכבר, ויוצרים מוקדים גרורתיים "ניסיוניים". בעזרת מודל זה ניתן למדוד את ההשפעות היחסיות של חומרים טיפוליים על התפתחות גרורות סרטניות. ההבדל במוקדי הריאה שנמנו בין עכברים שטופלו ולא טופלו מעיד על יעילות נטרול גרורות. עם זאת, לפני חקירת חומר טיפולי, יש צורך לקבוע מספר אופטימלי של תאי B16-BL6 מוזרקים לניתוח כמותי של מוקדים גרורתיים. הזרקה של תאים רבים מדי עלולה לגרום לשפע יתר של מוקדים גרורתיים, לפגוע בכימות נכון ולהכריע את ההשפעות של טיפולים אנטי-סרטניים, בעוד שהזרקה של מעט מדי תאים תעכב את ההשוואה בין המטופלים לביקורת.

מבוא

גרורה היא אחד הגורמים העיקריים למוות בקרב חולים עם ממאירויות. תהליך הפצת גרורתי של תאים סרטניים הוא הבין היטב אך נראה לערב כמה צעדים, כולל פלישה של הרקמות הסמוכות, intravasation לתוך lymphatics ואת כלי הדם, הישרדות טרנסלוקציה בתוך מערכת הדם, extravasation מן כלי הדם באתר של גרורות, הסתגלות אל המיקרו-הסביבה החדשה של האתר החדש, וההתנחלות באתר החדש על ידי התפשטות היווצרות של גידולים משניים. ¹ כל אחד אירועים ביולוגיים אלה כרוכים תאי טרנספורמציה, ההפצה וההישרדות של גידול גרורתי. לדוגמא, את הטרנספורמציה של פנוטיפ אפיתל של התאים הסרטניים לתוך פנוטיפ mesenchymal, יחד עם האינטראקציה המוצלחת עם מטריקס, לאפשר להם לפלוש לרקמות סמוכות ולשלוח גרורות לחלקים אחרים של הגוף. ^2,3 זאת ועוד, גרורתי אלה תאיםחייב לשרוד בתוך הדם במחזור להתחמק מעקב חיסוני מהמארח. ^4,5 לבסוף, כאשר מושתלים באתר מרוחק בגוף, תאי הגידול חייבים להסתגל microenvironment שלהם כדי להתרבות וליצור גידולים משניים. ^6,7 לכן , אם כי גרורות היא תופעה נפוצה בקרב חולי סרטן, יש תאים סרטניים עם גרורות באזורים מרובים של פגיעות כי ניתנים התערבות טיפולית.

בהתחשב באופי של מלנומה immunogenic, ואת הריבית האחרונות immunotherapies, מודלים למלנומה מועילים יותר ויותר. ⁸ בארצות הברית לבדה, מלנומה הוא הגורם של 9,000 מקרי מוות בשנה. ⁹ המיקומים הנפוצים של גרורות מלנומה עצמות, מוח , כבד וריאות. רוב גרור לאתרים מרוחקים להתרחש דרך מחזור הדם. תאים סרטניים במחזור בדם חייב להתחמק אישור חיסון, להגיע למיטת נימים של איבר דיסטלילפלוש דרך תאי האנדותל של כלי הדם על מנת לבסס את עצמם בהצלחה. ^{4-7,10, 11}

כדי לחקות את לתופעה שכיחה ארסית של גרורות, שורת תאים בעכברים B16-BL6 נוצר. המנוחה של הקו הסלולרי מלנומה הורית C57BL / 6 B16-F0, B16-BL6 הוא התוצר הסופי של 10 בחירות רצופות עבור גרורות ריאה מן הזרקה תוך ורידית (וכתוצאה מכך B16-F10), ואחריו 6 בחירות רצופות לחדירה קרום השלפוחית. ¹² ככזה, הוא קו התא מלנומה אמין להקמת מוקדי גרורתית העכבר, במיוחד כאשר הוא מוזרק לווריד. ¹³

לאחר הזרקה של כמות מספקת של תאי B16-BL6 לווריד הזנב של העכבר B57BL / 6, ואחריו שבועיים או יותר כדי לאפשר השתלה וצמיחה של תאים B16 / BL6, מוקדים גרורתי יהוו בתוך הריאות. לאחר המתת חסד ובדיקה על ידי מיקרוסקופ לנתח, מספרניתן לכמת כיום מוקדים בודדים. זה, בתורו, יכול לשמש כדי להקים אפקט מנה-גרור, כמו את מספר תאי B16-BL6 מוזרקים בקורלציה עם מספר המוקדים נוצרו על פני השטח של הריאות. מודל זה ידוע בשם "גרורות ניסיון," שבו תאים-גרורתי ידועה מוצגים ישירות לתוך זרם הדם, להקל על התפשטות מהירה וצפויה והקמה של הריאות, הכבד, או אורגן אחר של חקירה. זאת בניגוד ל "גרורות ספונטניות," שבו תאים סרטניים מושתלים, לעתים קרובות מתחת לעור, וגרורות מקורן אורגני לשפוך תאים סרטניים. ^14,15

חשוב להזריק כמות מתאימה של תאי B16 / BL6 לתוך ורידי הזנב של העכברים. יותר מדי, ואת הריאות תכוסינה עם גרורות ומוקדי שכנות יהיו נבדלים אחד אחרת. מעט מדי, ואת ההשפעה של סוכן טיפולי תהיה סמויה עקב Vari טמוןations בין זריקות. על מנת לקבל מספר אופטימלי של מוקדים על הריאות של C57BL / 6 עכברים, יש צורך לתאם את מספר התאים הוזרקו בכמות מוקדים גרורתי, שהתבססו על משטח של הריאות תוך לקיחה בחשבון את distinguishability של הפרט מוקדים. פרוטוקול זה יהיה להדגים מודל מלנומה בעכברים גרורתי לעכברים C57BL / 6.

פרוטוקול

משפט ואתיקה: השימוש עכברים במחקר מקובל רק במקרים שבהם היא עשויה לקדם את ההבנה האנושית של ביולוגיה בסיסית או כלפי הטיפול הסופי של המחלה.

סידור 1.

1. נקבת רכישת C57BL / 6 עכברים (גיל 6 - 8 שבועות), 5 עכברים בכל קבוצה. אפשר מספר ימים העכברים להתאים.

2. הכנת תאים B16-BL6

1. הסר צלחות תרבית תאים מן החממה 37 מעלות ומניחים מכסה המנוע סטרילית. צלחות צריכות להיות כ 70% ומחוברות עם תאים מלנומה בעכברים-BL6 B16. מפגש גדול יותר יכול לשנות את תאי פוטנציאל גרורתי.
2. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA לכל צלחת, ולתת לשבת במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשאוב את הפתרון טריפסין-מדיה.
3. הוסף 1 מ"ל של טריפסין לכל צלחת ולחזור צלחות בחממה במשך 10 דקות.
4. לאחר המעבר את הצלחות מן החממה עד למכסה המנוע סטרילית, להוסיף 4 מ"ל של Mediu מכון הזיכרון סרום ללא Rosewell פארקמ '(RPMI) על כל צלחת.
5. אוספים את התאים עם פיפטה סטרילית, ממונע. הוצא תאים נגד בתחתית הצלחת, עם הקצה לחוץ בזווית מאוד קלה, כדי לשבור את התאים. חזור מספר פעמים על מנת להבטיח הפרדה נאותה של גושי תאים, אשר שאחרת סותמים את מחט הפליטה. לזכור ולהעביר צינור חרוטי 50 מ"ל.
6. השתמש hemocytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים. שמירה על המספר הכולל של תאים B16-BL6 מתמיד, לקבוע את עוצמת הקול של RPMI סרום ללא צורך להגיע ריכוזי הסופי של 0, 0.065, 0.015, 0.25, ו -0.5 מיליון תאים / מ"ל.
7. לא פחות aliquot התקשורת בצינור 50 מ"ל ל 15 מ"ל צינורות חרוטי. בצנטריפוגה צינורות חרוטי 2,250 XG במשך 5 דקות. למזוג התקשורת. להוסיף נפח מתאים של RPMI סרום ללא ולאשר את צפיפות התאים הרצויים באמצעות hemacytometer. התאם densities- ידי הוספת נוספים RPMI או ספינינג resuspending בתוך volume- קטן בהתאם.
8. Aliquot 500 μlכל השעית תא לתוך שכותרתו 1.8 מיליליטר צינורות על קרח.

הזרקת 3. זנב וריד

1. קח עכבר, שבידי הזנב, ולהדריך אותו אחורי ואחת לתוך עוצר העכבר. עם פלג הגוף העליון בתא הראשי של העוצר, עם הזנב מחוץ לה, למשוך את העכבר לקראת הסוף העוצר. הכנס את הבוכנה עוצר, ממשיך לדחוף עד שהעכבר מאובטח.
2. סובב את העכבר 90 מעלות כזה שאחד הוורידים הזנב לרוחב פונה מעלה. באמצעות כרית אלכוהול, במרץ לנקות את הצד של זנב העכבר, במיוחד כאשר וריד הזנב הוא בולט ביותר.
   הערה: תאורה טובה חיונית להדמיה וריד הזנב יעיל על עכברים B57BL / 6J. מנורות חימום או רפידות ניתוח מחומם, בעוד אין צורך, גם תעזורנה ידי הגדלת הנפח של וריד הזנב.
3. במנדף תרבות סטרילי, לאסוף 300 μl של התקשורת בתרבות התא מהצינור 2 מיליון תאים / מ"ל. הפוך את המחט, מצליף sIDE ודוחף את הבוכנה, כדי להוציא בועות מן המזרק. הוצא תרבות-RPMI כדי לגרום לנפח סופי של 250 μl.
4. הארך את זנב העכבר עם היד הלא דומיננטית. החזק את הזנב עם הקצה הפרוקסימלי של הזנב מורם עם האצבע של היד הלא דומיננטית, ואת החלק הדיסטלי של הזנב מדוכא עם האגודל.
   הערה: בדרך זו, וריד הזנב מוחזק במצב לרוחב, במקביל לפני השטח העוצר, עם כניסה חופפת אפשרית בחלק דיסטלי יותר של הזנב.
5. הכנס את המחט לוריד הזנב, לקראת סוף דיסטלי, בזווית כלפי מטה דקות מלכתחילה, ולאחר מכן להתאים את המחט כדי להתאים את הזווית של וריד הזנב עם החדרה נוספת (הורדת בוכנה סוף ביחס מזרק המחט) .
6. הכנס את המחט כ 1 ס"מ לתוך וריד הזנב. לאחר החדרה, מתחיל לדחוף את הבוכנה, מחזיק את המחט יציבה.
   הערה: אם שהמחט נמצאת וריד הזנב ואת הקצה של המחט הוא not חסום התקשורת צריכה לזרום ללא הפרעה לווריד. הזרקה אפקטיבית מאופיינת אישור דם מהעורק. אם יש התנגדות, או בועה מתחילה להיווצר באתר ב ההזרקה, להוציא את המחט ולנסות שוב בבאתר הפרוקסימלי יותר לאורך וריד הזנב.
7. הסר את המחט מן הווריד וזורק אותו. החזק גזה נגד אתר הכניסה לעצור דימום.
8. הסר את הבוכנה מן העוצר ומניח את העכבר בכלוב הנמען.
9. חזור על הפעולה עבור כל ריכוזי אחרים.
   הערה:. הקמת מוקדי ריאות לוקח כ 2 - 3 שבועות, עם השתנות בהתאם שורת התאים לגודל הרצוי של מוקדים ⁹ בינתיים, עכברים צריך להיות פיקוח על סימפטומים שיכלו להצדיק המתת חסד מוקדם, כמו נשימות כבדות.

4. ספירת מוקדי הריאות

1. להרדים את העכבר על ידי צבת בתא CO ₂ וחשיפה ל -100% CO ₂ הציג 10-30% של נפח תא לדקה למשך 5 דקות. עקוב עם נקע בצוואר הרחם.
2. פשוק את העכבר על קלקר. בעזרת מספריים כירורגיות, ליצור חתך ניתוחי לאורך עצם החזה.
3. לעשות שני חתכים נוספים, הוא מהחלק העליון של חתך עצם חזה הסתעפות לכיוון הכתפיים של העכבר, חשיפת כלוב הצלעות.
4. לעשות שני חתכים, אחד לאורך הצדדים לרוחב החזה, כדי להסיר את כלוב הצלעות מהגוף, חשיפת הריאות והלב.
5. מחזיק את הלב עם פינצטה כירורגית, לחתוך את הוושט ואת קנה הנשימה, לשחרר את הלב והריאות מן העכבר. מניחים מתחת מיקרוסקופ לנתח, בהגדלה 10X, להדמיה טובה יותר.
6. לנתח בלב מהריאות ולהסיר התימוס, עוזב את הריאות רק שתיים.
7. עם הריאות מתחת היקף הניתוחים, מתחילים לספור את מוקדי ריאות. כל מוקדים אמורים להופיע בתור obtrusion עגול, חום על פני השטח של הריאות.
   1. לעקביות בין עכברים, לספור את מספר מוקדים על פני השטח של אונה, ולאחר מכן להפוך באונה זה. עושה כל אחד מארבע האונות בנפרד מאפשר ספירה קלה.
8. שמור ולתקן את הריאות אם ביצוע IHC, אחרת, ולזרוק את השאריות.

תוצאות

לאחר הבדיקה חזותית, וריאצית מוקדי שטח ניכרת. ספירת מספר הגידולים תחת מיקרוסקופ לנתח אמורה להניב קשר לינארי בין מספר תאים סרטניים מוזרקים והמספר שהתקבל מוקדי ספיר. שימוש המספר האופטימלי של תאים להזרקה, המטרה היא אחד שבו הריאות אינן מכוסות לגמרי, כפי שהם 500,000 תאים / מ"ל באיור 1 א ', ולא מכוסה גם בדלילות, כפי שהם 62,500 תאים / מ"ל ו 125,000 תאים / מ"ל. זהו גם לכימות על ידי קשר לינארי (איור 1B).

איור 1. מוקדי ריאות כתוצאה מן וריד הזנב מוזרק B16 / BL6 תאים. (א) מוקדי ריאות ניתן דמיינו על פני השטח של ריאות מעכברי C57BL / 6 כפי המונים עגולים חומים (מוקדי נציג תחת חיצים). כמו מאורותity של תרבית תאים מוזרק (מעל כל תמונה) גדל, כך גדל גם מספר המקביל וכתוצאה מכך מוקדים ריאות (מתחת לכל תמונה). הריאות מן העכבר עם הצפיפות הגבוהה של תאים מוזרקים יש הסיקור החזותי הגדול של מוקדי ריאות. ברי סולם מייצגים 20 מ"מ. (ב) ספירה יחסית מוקדי ריאות לצפיפות תרבית תאים. קיים יחס לינארי כ מעל 125,000 תאים / מ"ל, כפי שנקבע על ידי hemacytometer. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

תאים סרטניים במחזור מתוך הזרקה לוריד זנב לייצג את הגרורות כי להתחמק אתרים של צמיחה עיקרית ולהעביר דרך נתיבים כמו מחזור הדם או מערכת הלימפה, מדי פעם ומתבסס על המיטות נימי של למקומות מרוחקים. ¹⁴ הפרוטוקול המתואר לעיל משמש כמודל עבור משני גרורות. עם מספר אופטימלי של תאי B16-BL6 המוזרק, הנסיינים יכולים לקבוע את ההשפעה היחסית של תרופה מנוהלת או אוכלוסיית תא חיסון, שלאחר ניטרול, על גרורות של תאים סרטניים.

פרוטוקול זה יש מגבלות. תאי הגידול במחזור נבחרו על יכולותיהם הגרורות ולכן הם בלתי immunogenic, שיש רמות נמוכות של 1 מולקולות מורכבות המרכזי histocompatibility בכיתה. ¹² יתר על כן, את ההקדמה הפתאומית באשכול של מספר רב של גרורות היא בניגוד התרחיש האופייני בחולים שם מספר קטן של תאים סרטניים עם גרורותלהפיג פני תקופה ממושכת של זמן ממיקום הגידול הראשוני. בנוסף, התאים הסרטניים לוריד הציגו הן מתרבות רקמות ולא ממקור גידול ראשוני. לכן, תאים אלה הם בניגוד הגרור מהשניים הנובעים שינויי הידבקות תא, הגירה, הכרה חיסונית ומערכת איבר נמען. ^15,16

פרוטוקול חלופי יהיה הזרקה תת עורית של B16 / BL6 עבור הדור של גידולים ראשוניים ועל ניתוח של ריאתי גרורות "ספונטנית" שהתקבל. אלה "ספונטנית" גרורות נמצאו להכיל יותר הטרוגניות מאשר עמיתיהם "ניסיוני" שלהם, יותר שלהן תואמות לאלה של חולים אנושיים. הפרוטוקול הגבלה ביכולתה לקבוע את ההשפעה של תרכובת ניסיוני על גרורות. עם הזרקה לוריד זנב לרוחב, מספר תאים מלנומה מוזרקים לתוך זרם הדם יכול להיות מקורב באמצעות hemocytometer. עם גרורות "ספונטניות", לעומת זאת, ישן הטרוגניות רבה בין גידולים, הוספת משתנה נוסף למספר וכתוצאה מכך מוקדי ריאות. ¹⁶

לסיכום, המודל מלנומה בעכברים B16-BL6 וריד הזנב מהווה מודל פשוט לקביעת ההשפעה של טיפול או טיפול חיסוני על גרורות. על ידי לוריד הזרקת תאים סרטניים במחזור, חוקרים יכולים לשכפל, במידה מסוימת, חולים לאחר גרורות. שוקל את ההשפעות ההרסניות של תאים סרטניים גרורתי בין חולי סרטן, מודל זה הוא כלי רב עוצמה להבנת תהליך רב שלבי של גרורות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טריפסין	קורנינג	MT25052CV
RPMI 1640	קורנינג	MT15040CM
שלב קונטראסט המציטומטר	Hausser	02-671-54
מזרקי אינסולין מיקרו-עדינים IV	BD	14-829-1D
רפידות הכנת אלכוהול סטריליות	פישרברנד	22-363-750
מסנן	עכברבחירת Braintree Scientific		NC9999969 Restrainer תלויה בגיל/גודל העכברים
כרית חימום	הארי שיין	NC0012697	אופציונלי

בינוני