הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של

9.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54043

⸱

18 ביוני 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

במאמר זה

סיכום

שיטת תשואה גבוהה לטיהור שלילית חד-שלבית של רקומביננטי הליקובקטר פילורי חלבון ההפעלה-נויטרופילים (HP-NAP) ביתר coli Escherichia באמצעות שרפי diethylaminoethyl במצב תצווה מתואר. HP-NAP מטוהר בשיטה זו מועיל לפיתוח של חיסונים, תרופות, או אבחון עבור H. פילורי -associated מחלות.

תקציר

חלבון הליקובקטר פילורי הפעיל-נויטרופילים (HP-NAP) היא גורמת ארסיויות גדולות של הליקובקטר פילורי (H. pylori). הוא ממלא תפקיד קריטי H. פילורי -induced דלקת קיבה ידי הפעלת מספר לויקוציטים מולד כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאי פיטום. מאפייני immunogenic ואת המערכת החיסונית של HP-NAP הופכים אותו למועמד אבחון חיסון פוטנציאל H. פילורי ומועמד תרופה חדשה לטיפול בסרטן. על מנת לקבל כמויות ניכרות של NAP HP המטוהר המשמש ליישומים הקליניים שלה, שיטה יעילה לטהר חלבון זה עם תשואה וטוהרת גבוהות צריכה להיות הוקם.

בפרוטוקול זה, שתיארנו שיטה לטיהור chromatographic שלילית חד-שלבית של NAP HP רקומביננטי ביתר Escherichia coli (E. coli) באמצעות diethylaminoethyl (DEAE) חילופי יונים בעזרת שרפים (למשל., Sephadex) iבמצב יצווה n. HP-NAP רקומביננטי מהווה כמעט 70% של החלבון הכולל ב E. coli, והוא התאושש כמעט לחלוטין בשבריר מסיס על תמוגה התא ב- pH 9.0. תחת במצב אופטימלי ב- pH 8.0, רוב HP-NAP הוא התאושש בשבריר מאוגד בעוד חלבונים אנדוגניים מ E. coli מוסרים ביעילות על ידי שרף.

שיטת טיהור זה באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי יון-חילוף DEAE מניב HP-NAP ומתפקד מ E. coli בצורתו המקורית עם תשואה וטוהר גבוהה. HP-NAP מטוהרים יכול להיות מנוצל נוספת עבור מניעה, טיפול, ופרוגנוזה של H. פילורי -associated מחלות כמו גם בטיפול בסרטן.

מבוא

הליקובקטר פילורי (H. pylori) הוא גורם עיקרי של גסטריטיס כיב פפטי. חיידק זה גם סווג קרצינוגן בבני אדם על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן, כחלק מארגון הבריאות העולמי, בשנת 1994. הערכה היא כי השכיחות של H. זיהום פילורי הוא 70% במדינות המתפתחות ו 30-40% במדינות המתועשות 1. למרות שיעור הזיהום של H. פילורי הולך ופוחת במדינות המתועשות, שיעור הזיהום של H. פילורי במדינות המתפתחות עדיין גבוה 2. הטיפול המקובל למגר H. זיהום פילורי מורכב של המינהל מעכב משאבת פרוטונים, PPI, ושני אנטיביוטיקה, clarithromycin בתוספת אמוקסיצילין או metronidazole 3. עם זאת, העלייה של עמידות לאנטיביוטיקה ב H. פילורי -related טיפול כיב קורא לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי למנוע or לרפא את הזיהום. פיתוח של חיסון מונע ו / או טיפולי נגד H. פילורי יכול לספק גישה חלופית לשלוט H. זיהום פילורי.

חלבון הליקובקטר פילורי הפעיל-נויטרופילים (HP-NAP), גורם ארסיויות גדולות של הליקובקטר פילורי, זוהה לראשונה בשנת תמציות מים של H. פילורי עם היכולת להפעיל נויטרופילים לדבוק לתאי אנדותל ולהפיק (reactive oxygen species ROS) 4. חדירת נויטרופילים של רירית הקיבה למצוא במאמרם של ה' pylori- חולים שנדבקו עם גסטריטיס פעיל עלול לגרום לדלקת ולנזק ברקמות של הקיבה. לפיכך, HP-NAP עשוי לשחק תפקיד פתולוגי ידי הפעלת נויטרופילים לגרום דלקת קיבה, אשר עוד גורם כיב או H. פילורי -associated מחלות קיבה. אף על פי כן, HP-NAP הוא מועמד פוטנציאלי עבור יישומים קליניים 5,6. בשל פרו immunogenic ואת המערכת החיסוניתperties של HP-NAP, חלבון זה יכול לשמש כדי לפתח חיסונים, סוכנים טיפוליים, וכלי אבחון. ניסוי קליני נערך לשימוש רקומביננטי HP-NAP כאחד המרכיבים של חיסון חלבון נגד H. פילורי. חיסון זה מורכב רקומביננטי HP-NAP, גן הקשור-cytotoxin (cagA), ו- A cytotoxin vacuolating (Vaca) חלבונים גיבש עם הידרוקסיד אלומיניום הודגמה עוד יותר כדי להיות בטוח immunogenic בבני אדם 7. כמו כן, HP-NAP משמש immunomodulator חזק כדי לעורר T מסייעים מסוג 1 (Th1) -polarized התגובה החיסונית לטיפול בסרטן 8 וכדי למטה לווסת את התגובות החיסוניות בתיווך Th2 שהושרו על ידי תגובות אלרגיות וזיהומים טפיליים 9,10. באשר אבחון, רקומביננטי HP-NAP המבוסס ELISA יושם לאיתור נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP ב- H. פילורי -infected חולים 11. מחקר אחד הראה כי רמת נוגדנים-NAP הספציפי של HP ב- סר מן H. pyלורי -infected בחולים עם סרטן קיבה היה גבוה משמעותית מזה של חולים עם דלקת קיבה כרונית 12. גם מחקר אחר הראה כי נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP המשויכים בנוכחות אדנוקרצינומה בקיבה הלא הקיבה 13. לפיכך, רקומביננטי HP-NAP המבוסס ELISA ניתן להחיל לאיתור נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP עבור הפרוגנוזה של סרטן קיבה אצל ח פילורי -infected חולים. יחדיו, HP-NAP מטוהרים יכול להיות מנוצל נוספת עבור מניעה, טיפול, ופרוגנוזה של H. פילורי -associated מחלות כמו גם בטיפול בסרטן.

בין מספר השיטות השתמשו לטיהור רקומביננטי HP-NAP לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli) בצורתו המקורית שדווח עד כה, צעד טיהור שני כרומטוגרפיה ג'ל-סינון מעורב נדרש כדי להשיג מאוד טהור HP-NAP 14-16 . כאן, שיטה באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עםdiethylaminoethyl (DEAE) חילופי יונים בעזרת שרפים מתוארים לטיהור HP-NAP ביתר E. coli עם תשואה גבוהה וטוהר גבוה. טכניקת טיהור זו התבססה על הכריכה של חלבוני תא מארח ו / או זיהומים אחרים מאשר HP-NAP שרף. בשעת 8.0 pH, כמעט ללא חלבונים אחרים למעט HP-NAP הם התאוששו מן השבר המאוגד. גישת טיהור זה באמצעות כרומטוגרפיה יון-חילוף DEAE במצב שלילי היא פשוט חוסך זמן בכך שהוא מאפשר טיהור של HP-NAP רקומביננטי באמצעות כרומטוגרפיה צעד אחד באמצעות האיסוף של השבריר המאוגד. בנוסף HP-NAP, כמה ביומולקולות אחרים, כגון וירוסים 17, אימונוגלובולין G (IgG) 18, המוגלובין 19, phosphatase חלבון 20, ו גורם ארסיות flagellin 21, דווחו גם להיטהר על ידי כרומטוגרפיה-חילוף יונים בנגטיב מצב. המצב השלילי עדיף כרומטוגרפיה יון-חילופי אם זיהומים הם הקטיןרכיבים נוכחיים במדגם הנתון להיטהר 22. היישום של כרומטוגרפיה שלילית בטהרת ביומולקולות טבעית או רקומביננטי נבדק לאחרונה 23.

הדו"ח הנוכחי מספק צעד אחר צעד פרוטוקול עבור ביטוי רקומביננטי HP-NAP ב E. coli, תמוגה של התאים, וטיהור-NAP HP באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי יון-חילוף DEAE. אם החלבון הרצוי לטיהור מתאים כרומטוגרפיה-חילוף יונים במצב שלילי, פרוטוקול המתואר יכול גם להיות מותאם כנקודת מוצא לפיתוח של תהליך טיהור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דם אדם נאסף מתנדב בריאים עם הסכמה מדעת ובכתב אישור דירקטוריון הסקירה המוסדית של האוניברסיטה הלאומית צינג הואה, Hsinchu, טייוואן.

הביטוי 1. רקומביננטי HP-NAP ב E. coli

  1. הכן את pET42a-NAP פלסמיד המכיל את רצף ה- DNA של HP-NAP מ H. פילורי 26,695 זן כפי שתואר לעיל 16. הכן את פלסמידים המכילים את רצף ה- DNA של HP-NAP עם מוטציות נקודתיות הרצויות כמתואר (ראה פרוטוקול, שלב 8).
  2. Transform 10 ng של פלסמידים DNA הנ"ל לתוך E. BL21 coli (DE3) תאים המוסמכת על ידי הלם חום במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס, פס התאים על מרק lysogeny (LB) אגר צלחות המכילות 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin, דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  3. לחסן מושבות אחת צינורות בודדים המכיל 5 מ"ל של מרק LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin ולגדל אותם כמו precultures ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות עם רועד ב 170 סל"ד.
  4. לחסן 2 מ"ל של תאים טרום התרבות הנ"ל לתוך 200 מ"ל של מרק LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin בבקבוק L 1. דגירת בקבוק התרבות המחוסנת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם הרועד ב 170 סל"ד עד הספיגה ב 600 ננומטר ומגיע לכ 0.4-0.5 זוהה על ידי ספקטרופוטומטר UV / VIS.
  5. הוסף 80 μl של 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתוך התרבות מעל לריכוז סופי של 0.4 מ"מ כדי להשרות את הביטוי של HP-NAP. דגירת ההתרבות עבור 3 שעות עד הספיגה ב 600 ננומטר ומגיע לכ 1.6-1.7.
  6. צנטריפוגה התאים ב 6000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר את supernatant. אחסן את התא גלולה ב -70 ° C עד לטיהור.

2. הכנת שבר חלבון מסיס המכיל HP-NAP

הערה: כל הצעדים הבאים מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס.

  1. Resuspend 50 מ"ל של התא pellet מוכן בשלב פרוטוקול 1.6 ב 20 מ"ל של 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM NaCl המכילים פלואוריד 0.13 מ"מ phenylmethylsulfonyl (PMSF), 0.03 מ"מ N-אלפא-Tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK), ו 0.03 מ"מ N-Tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) בשעה 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל 16.
  2. לשבש את תאי חיידקים על ידי העברת ההשעיה חיידקי באמצעות homogenizer בלחץ גבוה פעל בטווח של 15,000 עד 20,000 psi במשך 7 פעמים ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. צנטריפוגה lysate התא g 30,000 × ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להפריד את השברים חלבון מסיסים ובחלקם לא מסיסים באמצעות ultracentrifuge. מעביר את supernatant כמו שבר החלבון המסיס כדי מבחנה.
  4. למדוד את ריכוז החלבון של שבר החלבון המסיס בשיטה ברדפורד באמצעות ערכה מסחרית עם אלבומין בסרום שור (BSA) כתקן לפי הוראות היצרן.
  5. הוסף 177.6 μl של 1 N HCl לתוך 20 מ"ל של הדואר חלבון מסיס חלק המתקבל פרוטוקול צעד 2.3 להתאים ערך ה- pH שלה pH 9.0 ל 8.0 pH.
  6. הוסף 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl לפתרון חלבון לעיל כדי להפוך את ריכוז החלבון הסופי להיות 0.5 מ"ג / מ"ל.

טיהור 3. רקומביננטי HP-NAP מ E. coli על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי DEAE יון-חליפין

  1. כן 15 מיליליטר של שרפי DEAE.
    1. תשקלי 0.6 גרם אבקה יבשה של שרפים DEAE ולהשעות אותו 30 מ"ל של 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl בטמפרטורת החדר למשך יום 1 לפחות.
    2. צנטריפוגה שרף ב 10,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
    3. הסר להתעלמות supernatant.
    4. הוסף 15 מ"ל של 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl.
    5. חזור על פרוטוקול צעדים 3.1.2 ל 3.1.4 עוד ארבע פעמים.
    6. אחסן את 15 מ"ל התיישבו שרף (slurry 50% ב 30 מ"ל טריס חיץ) בשעה 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: כל הצעד הבאהים מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס.
  2. להוסיף 45 מ"ל של חלבונים מסיסים מוכן בשלב פרוטוקול 2.6 15 מ"ל של שרף ומערבבים את התערובת הדלילה חלבון / שרף עם בוחש מגנטי ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. יוצקים את התערובת הדלילה חלבון / שרף לתוך עמוד פלסטיק או זכוכית מצויידות ברזלים. אפשר שרף להתיישב תחת כוח הכבידה.
  4. פתח את השסתום לאפשר פתרון החלבון לרוץ דרך הטור ידי זרימת כוח הכביד עד רמת הנוזל בעמודה היא בדיוק מעל השרף. אסוף את הזרימה דרך השבר המאוגד, אשר מכיל את HP-NAP המטוהר.
  5. הוסף 15 מ"ל של 20 קר כקרח mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl לתוך הטור.
  6. פתח את השסתום לאפשר החיץ לשטוף לרוץ דרך הטור ידי זרימת כוח הכביד עד רמת הנוזל בעמודה היא בדיוק מעל השרף. אסוף את הזרימה דרך השבר לשטוף.
  7. חזור על פרוטוקול צעדים 3.5 ל 3.6 ארבע פעמים נוספות כדי לאסוף את השברים לשטוף נוספים.
  8. הוסף 15 מ"ל של 20 קר כקרח mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl לתוך עמוד.
  9. פתח את השסתום לאפשר למאגר elution לרוץ דרך הטור ידי זרימת כוח הכביד עד רמת הנוזל בעמודה היא בדיוק מעל השרף. אסוף את הזרימה דרך שבר elution.
  10. חזור על פרוטוקול צעדים 3.8 ל 3.9 ארבע פעמים נוספות כדי לאסוף את השברים elution נוספים.

4. ההצפה Exchange ו- הסרת אנדוטוקסינים של NAP HP מטוהרת על ידי כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי DEAE

הערה: HP-NAP מטוהר לידי ביטוי E. coli צריך להיות נתון חיץ חליפין וסר רעלן פנימי לפני לעורר נויטרופילים.

  1. בצע דיאליזה כדי לשנות את החיץ של HP-NAP המטוהר שנאגר מלוח פוספט של Dulbecco (D-PBS), pH 7.2, ב 4 ° C. באמצעות צינורות דיאליזה עם הפסקת משקל מולקולרית של 14 kDa כפי שתואר לעיל 24.
  2. סנן את HP-NAP dialyzed באמצעות syringמסנן דואר עם קרום חיובי טעונים, הידרופילי מצורף מזרק חד פעמי 20 מ"ל ב ספיקות החל 2.5 ל 4 מ"ל / דקה ב 4 ° C כדי להסיר רעלן פנימי.

אפיון 5. המאפיינים המולקולריים של המטוהרים רקומביננטי HP-NAP ידי נתרן Dodecyl סולפט-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), מערבי סופג, שפה-PAGE, כרומטוגרפיה סינון ג'ל, ומתארים dichroism ספקטרוסקופיה

  1. נתח את HP-NAP מטוהרים רקומביננטי על ידי SDS-PAGE ו המערבי סופג עם supernatants תרבות hybridoma המכיל נוגדנים חד שבטיים העכבר MAb 16F4 25 כפי שתואר לעיל 24.
  2. נתח את HP-NAP מטוהרים על ידי-עמוד יליד כרומטוגרפיה סינון ג'ל לבחון מצב oligomeric שלה כפי שתואר לעיל 26.
  3. נתח את HP-NAP רקומביננטי מטוהר על ידי ספקטרוסקופיה dichroism המעגלי לבחון מבנה המשני שלה כפי שתואר לעיל 26.

6. הערכה הטוהרת-NAP HP ידי כסף המכתים של ג'ל SDS-PAGE

  1. הכן את הפתרון לתקן, רגישות פתרון, פתרון כסף, פיתוח פתרון, להפסיק פתרון, ופתרון כביסה בהתאם להוראות היצרן של ערכת צביעת כסף.
  2. בצע צביעת כסף של ג'ל SDS-PAGE פי הוראות היצרן של ערכת צביעת כסף.
  3. רוכש את התמונה של הג'ל עם מערכת הדמיה.

מדידת 7. של ROS ייצור נויטרופילים מושרה על ידי HP-NAP

  1. לבודד נויטרופילים אדם מדם אנושי heparinized ידי שקיעת dextran ואחריו צנטריפוגה שיפוע צפיפות כפי שתואר לעיל 24.
  2. מדידת ייצור ROS מ נויטרופילים מגורים עם HP-NAP באמצעות assay chemiluminescence התלוי לומינול.
    1. הפעל קורא צלחת ולהגדיר את הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס. הוסףצלחת תחתונה 96-גם לבן שטוח ריק בתוך החדר קורא צלחת, שמאפשרת לו להתחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
    2. מכינים את תערובת גירוי ב D-PBS, pH 7.2, המכיל 0.9 מ"מ 2 CaCl, 0.5 מ"מ MgCl 2, ו -13.3 מיקרומטר 5-אמינו-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione (לומינול) עם נוכחות והיעדרות של 0.67 HP-NAP מיקרומטר-הסיר רעלן פנימי שהוכן צעד פרוטוקול 4.2.
    3. התאם את הריכוז של נויטרופילים האדם מוכן משלב פרוטוקול 7.1 2 x 10 6 תאים / מ"ל ב D-PBS, pH 7.2, המכיל 5 גלוקוז מ"מ.
    4. הוסף 50 μl של השעיה נויטרופילים לבאר כל 96-גם בעוד הצלחת.
    5. להוסיף 150 μl של תערובות הגירוי מוכנות משלב פרוטוקול 7.2.2 לתוך נויטרופילים המכילים גם במרווח זמן של 5 שניות לכל טוב.
    6. מדוד את פליטת chemiluminescence במשך 5 שניות לכל טוב על פני תקופה של שלוש שעות באמצעות קורא צלחת.

8.בניית DNA פלסמידים מחסה HP-NAP מוטאנטים ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססת mutagenesis אתר הישיר

הערה: mutagenesis באתר-ישיר המבוסס PCR נוצר בעצם כפי שתואר לעיל 27, למעט עובדת אתרי ההגבלה "השקטים" הוכנסו פריימרים mutagenesis ידי mutagenesis באתר ביים (SDM) -assist תוכנת 28.

  1. בצע תגובת PCR.
    1. הוסף 10 ng של פלסמיד pET42a-NAP, 1 מיקרומטר של זוגות פריימר mutagenesis המפורטות בטבלה 1, 200 מיקרומטר של triphosphates deoxynucleoside (dNTPs), ו -3 יחידות של תמהיל האנזים באיכות גבוהה PCR לתוך צינור PCR המכיל מים ללא יונים, נותן הסופי נפח של 25 μl.
    2. ליזום את מחזורי PCR ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפגל את תבנית ה- DNA, ופעל עם 12 מחזורים הגברה ב 95 מעלות צלזיוס למשך דקה 1, T מ 'לא -5 ° C למשך דקה 1, ו -72 o צלזיוס במשך 6 דקות.
    3. לסיים את מחזורי PCR עםצעד חישול ב T מ 'עמ -5 מעלות צלסיוס דקה 1 צעד הארכה על 72 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. פנקו 15 μl של מוצר ה- PCR עם 0.4 μl של אנזים הגבלה DPN אני על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ולאחר מכן לנתח 2 μl של המוצר PCR שטופלו שאני DPN ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose.
  3. מוטציות מסך.
    1. Transform 2 μl של המוצר PCR לתוך E. coli DH5α תאים המוסמכת על ידי הלם חום במשך 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס.
    2. מורחים את התאים טרנספורמציה על צלחת LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
    3. לבודד את ה- DNA פלסמיד מן מושבות חיידקים באמצעות ערכת תמוגה אלקליין מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
    4. פנקו את ה- DNA פלסמיד מבודד בשלב פרוטוקול 8.3.3 עם אנזים הגבלה XhoI כדי לאמת את הנוכחות של מוטציה שקטה הרצוי על פי פרוטוקול של היצרן.
    5. ברצףפלסמיד דנ"א מאומת על ידי צעד פרוטוקול 8.3.4 עם פריימר אמרגן T7 כדי לאשר את התיקון של רצפי הקידוד של מוטציות HP-NAP על פי הפרוטוקול של היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרשים סכמטי של הליך ניסיוני של טיהור השליליות של רקומביננטי HP-NAP לידי ביטוי E. coli באמצעות חילופי יונים בעזרת שרפי DEAE במצב תצווה מוצג באיור 1. טכניקת טיהור זה מבוסס על הכריכה של חלבוני תא מארח ו / או זיהומים אחרים מאשר HP-NAP שרף. ב- pH 8.0, כמעט ללא חלבונים אחרים למעט HP-NAP בצורה המקורית שלו הם התאוששו מן השבר המאוגד (איור 2 א 'וב'). HP-NAP מטוהר בשבריר המאוגד היה immunodete...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כרומטוגרפיה תצווה המצב השלילית עם שרפים-אניוני DEAE המוצגת כאן היא מתאימה טיהור רקומביננטי HP-NAP ביתר coli E. ערכי ה- pH של המאגרים המשמשים מדרגות תמוגה תא וטיהור מאוד קריטיים כדי להבטיח את המסיסות של HP-NAP ב E. lysates coli ו הפרדה יעילה של-NAP HP רקומביננטי מן הטומאות התא המארח, בהתאמה. יש lysed תאי חיידקיים ב- pH 9.0, והטיהור השלילית צריכה להתבצע ב- pH 8.0 כדי להשיג-NAP HP בתשואה גבוהה וטוהר גבוה. התאוששות אופיינית של HP-NAP היא 90%, וטוהר טיפוסי הו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

HWF ו-YCY הם ממציאי הפטנטים TW I 432579 ו-US 8,673,312 לשיטת הטיהור החד-שלבי של חלבון מפעיל נויטרופילים הליקובקטר פילורי . כל החומרים המתוארים בכתב היד יהיו זמינים למטרות מחקר. המחברים מאשרים כי זה לא משנה את דבקותם בכל המדיניות של JoVE לגבי שיתוף נתונים וחומרים.

תודות

אנו מודים לד"ר צ'או-שנג צ'נג מהאוניברסיטה הלאומית צינג הואה, טייוואן, על ביצוע מדידת הדיכרואיזם המעגלי. אנו מודים גם לד"ר אוונתיה גאלאניס וינקו ד. יאנקוב ממאיו קליניק, ארה"ב, על אספקת הנוגדן החד-שבטי נגד HP-NAP. אנו מעריכים את ד"ר האן-וון צ'אנג וצ'ונג-צ'ו צ'ן מבית החולים Mackay Memorial, שינג'ו, טייוואן, על מתן ייעוץ ליישום IRB, מר טה-לונג צאי מבית החולים Mackay Memorial, שינג'ו, טייוואן, על הפיקוח על הניתוח של נויטרופילים מבודדים, וגב' ג'ו-צ'ן וונג מהאוניברסיטה הלאומית צינג הואה, טייוואן, על הסיוע הטכני שלה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 ו-NSC98-2311-B-007-006-MY3), תוכנית המחקר המשותפת של אוניברסיטת צינג הואה הלאומית ובית החולים מקיי ממוריאל (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), ותוכנית המחקר של האוניברסיטה הלאומית צינג הואה (104N2052E1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים



רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרי
pET42a-NAP N/AN/Aהוכן כמתואר בנתונים משלימים של Refernce 15 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)Thermo Fisher Scientific IncC6000-03
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 KanamycinAmresco25389-94-0http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)MD Biomedical Inc101-367-93-1http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)מעכב פרוטאז Sigma-Aldrich10837091001
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)מעכב פרוטאזSigma-AldrichT7254
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)מעכב פרוטאזSigma-AldrichT4376
תקן חלבון (אלבומין בסרום בקר)Sigma-Aldrichעמ' 5619 חלבון סטנדרטי לבדיקת חלבון Bio-Rad
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
DEAE– ספדקס   A-25 כלוריד בצורתSigma-AldrichA25120http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW צינורות
דיאליזה ספקטרום/פורספקטרום מעבדות ספקטרום132720עם חיתוך משקל מולקולרי של 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
יחידות Acrodisc® עם Mustang® ממברנת EPallMSTG25E3להסרת אנדוטוקסין; מופעל בקצבי זרימה הנעים בין 1 ל-4 מ"ל/דקה
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
נוגדן חד שבטי של עכבר MAb 16F4N/AN/Aמורם כנגד HP-NAP מטוהר של זן הליקובקטר פילורי NCTC 11637 כמתואר בהתייחסות 23;   מתנה מד"ר אוונטיה גלאניס וינקו ד. ינקוב במאיו קליניק, ארה"ב
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare Life Sciences28989335לכרומטוגרפיה לסינון ג'ל
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
ערכת צביעת כסף PlusOne, חלבוןGE Healthcare מדעי החיים17-1150-01
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare Life Sciences17-1440-02לצנטריפוגה בשיפוע צפיפות לטיהור נויטרופילים אנושיים
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
צלחת לבנה עם תחתית שטוחה 96 בארותThermo Fisher Scientific Inc236108http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
LuminolSigma-AldrichA8511מוגן מפני אור
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW
הרחב   מערכת PCR תבנית ארוכהSigma-Aldrich11681834001מקור לתערובת אנזימים PCR בנאמנות גבוהה
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW
Dpn Iניו אינגלנד BiolabsR0176Shttps://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho Iניו אינגלנד BiolabsR0146Shttps://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. קולי DH5&אלפא;תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ18265-017https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר מוצר<חזק>תגובות
<חזק>ציוד
 
U-2800 ספקטרופוטומטר UV/VIS כפול קרןהיטאצ'י N/Aמחוץ לשוק ושודרג לדגם חדש
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 הומוגנייזר בלחץ גבוהAvestin IncC315320http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX אולטרה-צנטריפוגה כלליתHitachi Koki Co 90106401להפרדת חלקיקי החלבון המסיסים והבלתי מסיסים מ-E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
Ä KTA FPLCGE Healthcare Life Sciences18-1900-26לכרומטוגרפיה לסינון ג'ל
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
אביב דגם 62ADS CD ספקטרופוטומטראביב ביו-רפואיN/Aיצא מהשוק ושודרג לדגם חדש http://www.avivbiomedical.com/circular.php
מערכת הדמיה LAS-3000FujifilmN/Aהופסק והוחלף
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) מונה רב-תוויותPerkin-Elmer1420-018לזיהוי כימילומינסנציה
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW

מקורות

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157(2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786(2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HP NAPDEAEBatch ModepH
צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.