מאמר שיטה

פורמינג Polymersomes ענק בגודל שימוש Rehydration ג'ל בסיוע

DOI:

10.3791/54051

⸱

26 במאי 2016

 ,  , 
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories, 2Biological and Engineering Sciences, Sandia National Laboratories

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול ליצירה מהירה של שלפוחיות פולימר ענקיות (pGVs). בקצרה, תמיסות פולימריות מיובשות על סרטי אגרוז מיובשים המודבקים לכיסויים. התייבשות מחדש של סרטי הפולימר גורמת להיווצרות מהירה של pGVs. שיטה זו מקדמת מאוד את הכנת שלפוחיות ענק סינתטיות ליישומים ישירים במחקרים ביומימטיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות פולימר, או פולימזומים, נחקרים באופן נרחב כאנלוגים סינתטיים של שלפוחיות ליפידים בהתבסס על יציבותם, חוסנם, תכונות המחסום, הרבגוניות הכימית והמאפיינים הפיזיקליים הניתנים לכוונון. שיטות אופייניות המשמשות להכנת שלפוחיות ענקיות (> 4 מיקרומטר), לעומת זאת, הן עתירות זמן ועבודה, ומניבות מספרים נמוכים של פולימרים שלמים. כאן, אנו מציגים לראשונה את השימוש בהחזרת נוזלים בעזרת ג'ל להיווצרות מהירה ומניבה של שלפוחיות פולימר ענקיות (>4 מיקרומטר) (פולימזומים). באמצעות שיטה זו, ניתן ליצור פולימזומים ממגוון רחב של תמיסות החזרת נוזלים, כולל מספר חוצצים שונים התואמים פיזיולוגית ומדיה מלאה של תרבית תאים, מה שהופך אותם לשימושיים בקלות למחקרי ביומימיקרי. טכניקה זו מסוגלת גם לייצר באופן אמין פולימזומים מהרכבי פולימרים שונים עם תשואות טובות בהרבה והרבה פחות קושי משיטות מסורתיות. גודל הפולימר ניתן לכוונון בקלות על ידי שינוי הטמפרטורה במהלך התייבשות או הוספת נוזלי ממברנה לקרום הפולימר, ויוצר פולימרים בגודל ענק (>100 מיקרומטר).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת שלפוחית ​​unilamellar סינתטי בגודל התא, ענק (GUVs) הוא של הגדלת הריבית בשחזור במבחנה של תהליכים תאיים שונים כדי לבנות מסגרת עבור הדור של 1,2 מערכת מלאכותית דמויי תאים. בעוד GUVs מורכב ממברנות שומנים בדם הנו חקיינים מצוינים של ממברנות הטבעיות, ביולוגיות, הם אינם יציבים מפני תנודות סביבתיות ויש להם חיי מדף קצרים למדי. בשל מגבלות אלה, שמש קופולימרים לחסום amphiphilic כמו מחק שומנים כדי ליצור שלפוחית ​​פולימר, או polymersomes. במסגרת זו, polymersomes הוא יתרון בפיתוח מערכות תא biomimetic בשל היציבות המוגברת שלהם 3, הצדדי כימית 4,5 ו תכונות פיסיות לשינוי 6 - 8.

השיטות הקיימות כיום ליצירת polymersomes ענק בגודל כוללים electroformation 9 ו התייבשות בתבניות 10, שניהם which צורך זמן, עתיר עבודה, דורש ציוד מיוחד ולייצר תשואות נמוכות של polymersomes הענק פגע. שיטה להחזרת נוזלים פשוט בסיוע ג'ל פותחה לאחרונה לייצור GUVs השומנים 11. כאן אנו מתארים עיבוד של טכניקה להחזרת נוזלים בסיוע ג'ל ליצור polymersomes ענק עם קומפוזיציות פולימר משתנים, גודל מבוקר, בקומפוזיציות חיץ שונים.

בקצרה, 1% w / v סרטי agarose ג'ל אלקטרופורזה תקן ה- DNA הם מיובשים על coverslip זכוכית. פתרונות פולימר ערוכים כלורופורם אז מפוזרים על פני סרט agarose המיובש ואפשרו להתאדות. בעקבות הסרת ממס מלאה, סרטי פולימרים הם rehydrated למאגר של בחירה עם חימום מתון (40-70 מעלות צלזיוס) וענקי (> 4 מיקרומטר) polymersomes בגודל נוצר תוך 30 דקות. שיטה זו במהירות מייצרת מאה לחלוטין ללא פגע, polymersomes הבנוי היטב באמצעות שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי Reagents בעלויות מינימליות.

figure-introduction-1
באיור 1. סכמטי המתאר את שיטת ההתייבשות בסיוע ג'ל. Polymersomes הענק המורכב של קופולימר diblock נוצר לאחר ~ 30 דק 'של התייבשות. הבלוק הידרופילי הוא כונה ב המשולהבים לחסום הידרופובי הוא כונה בירוק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פולימר והכנת Agarose

הערה: כפפות וחלוק מעבדה צריך להיות משוחק בכל עת בכל פרוטוקול זה. משקפי בטיחות הם כמו כן נדרשו במהלך העבודה עם כל ממיס אורגני או כל צעד עם מתיז אפשרי.

  1. הכן פתרון 5 מ"ג / מ"ל ​​של פולימר כלורופורם. הוסף 1 מ"ל של כלורופורם עד 5 מ"ג פולי מוצק (אתילן אוקסיד) - פולי B- (סטירן) (PEO-ה.ה.ר., EO 22 -BD 37) קופולימר diblock בבקבוקון זכוכית מערבולת לפזר באופן מלא. ביצוע כל הצעדים באמצעות כלורופורם במנדף כימי קטר.
  2. מערבבים שומנים שכותרתו fluorescently (נרכש כבר מומס כלורופורם) בריכוז סופי 0.5 mol% פולימר ללא תווית 99.5 mol%.
    1. לדוגמא, פיפטה ~ 12 μl של שומנים מסומנים 1 מ"ג / מיליליטר fluorescently כלורופורם לתוך 997.58 μl PEO-ה.ה.ר., EO 22 -BD 37 פולימר כלורופורם (עם משקל מולקולרי של 2,950 Daltons) לצורך ריכוז סופי של 0.5% mol שומנים שכותרתו מעורבים 99.5 פולימר mol%.
    2. פתרון אחסן בקבוקון אטום עם מכסה עמיד כלורופורם ב -20 ° C. גלישת קלטת שרברבים על קצה הבקבוקון שם את הברגים המכסה על הבקבוקון ולאבטח את המכסה על הבקבוקון. עוטף עוד חתיכת סרט שרברבים בצד החיצוני של המכסה ולבסוף לעטוף Parafilm על החלק החיצוני של הסרט כדי להבטיח אידוי מינימאלי.
  3. בצע פתרון agarose 1% w / v על ידי ערבוב agarose 0.5 מ"ג רגיל 50 מ"ל מים (או 50 מ"ל 100 סוכרוז מ"מ) בבקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer. מרתיחים את הפתרון agarose במיקרוגל רגיל דקות ~ 1 (או עד מלא מומס כפי שציין סליקת הפתרון).
    הערה: הפתרון agarose ניתן להשתמש אחרי כמה דקות של קירור או מותר כדי לגבש, לאחסן מחדש נמס באותו אופן.

2. הכנת סרט Agarose

  1. חותך את הקצה של קצה פיפטה 1,000 μl כדי למנוע סתימה. משתמש קצה לחתוך, פיפטה 300 μl של פתרון agarose מותכת על coverslip זכוכית מרובע 25 מ"מ ישירות מהיצרן.
  2. אפשר agarose להתקרר ~ 65-75 ° C לפני הדחה. אם agarose הוא מגניב מדי, הוא יתחיל גוש על פני השטח במהלך התהליך המתפשט. לעומת זאת, אם agarose הוא חם מדי, זה ידרוש יותר מתפשט לדבוק את agarose אל פני השטח.
  3. החזק רק קצה coverslip עם אצבע עטויה כפפה ולהשתמש הקצה הארוך של עוד 1,000 קצה פיפטה μl להפיץ את agarose שווה על פני השטח של coverslip. הזיזו את קצה פיפטה הלוך ושוב על פני coverslip עד agarose דבקה לחלוטין ומכסה את coverslip.
  4. מניחים את coverslip מצופה agarose על גבי פיסת Parafilm עם agarose פונה כלפי מעלה. לאחר המספר הרצוי של coverslips הם מצופים, למקם את Parafilm עם coverslips לתוך 37 ° C חממה כדי ליבש את agarose על פני השטח לפחות 1 שעה.
    הערה: התייבשותנקבע על ידי היעלמות שכבת agarose הגלויה; את coverslip צריך להיראות שטוח ובהיר. ברגע הסרטים מיובשים לחלוטין, חנות coverslips עם משטח agarose פונה כלפי מעלה בצלחת פלסטיק חד פעמי פטרי.

3. גיבוש שכבת הפולימר

  1. 30 פיפטה μl הכין פתרון פולימר על הסרט agarose.
  2. חזק רק קצה coverslip עם אצבע עטוית כפפה ולהשתמש הקצה הארוך של מחט 18 G כדי להפיץ את הפתרון על פני סרטי agarose בתנועות הפצת חוזר. המשך הפצה עד הפתרון הוא התאדה.
    הערה: היזהר של הקצה החד של המחט.
  3. מניח את סרטי פולימר צד פולימר בצלחת פטרי מפלסטיק הפונים כלפי מעלה ולשים את צלחת פטרי לתוך ייבוש ואקום בית תקן המכוסה בנייר אלומיניום (כדי למנוע photobleaching של השומנים שכותרתו) לפחות שעה 1 כדי להסיר כל ממס שיורים מלא.

4. גיבוש Polymersomes

  1. ציית coverwell, אחת מעמד polydimethylsiloxane תוצרת בית (PDMS) גם (~ 0.5 ס"מ בלוק עבה של PDMS נרפא עם ~ 1 ס"מ קוטר באמצע אגרוף) או זמינים מסחרית היטב coverslip מצופה פולימר הסרט. לחצו על coverwell בעדינות על coverslip מצופה פולימר עם הפולימר פונה כלפי מעלה עד חותם חזק שנוצר בין coverwell ואת coverslip. היזהר שלא ללחוץ חזק מדי ולשבור את coverslip.
  2. להוסיף 200-500 פתרון להחזרת נוזלים μl (מים זה בסדר, אבל מערך של מאגרים או במדיות גם עובד) לתא (נפח התייבשות תלוי בגודל של coverwell דבק).
  3. ליצור תא לחות כדי להקטין התאדות של הפתרון להחזרת הנוזלים. מניחים Kimwipe התגלגל, רטוב בשולי צלחת זכוכית פטרי. מניח את סרט הפולימר עם coverwell דבק לתוך התא הלח ומכסים במכסה. מכסים את צלחת פטרי עם נייר אלומיניום כדי למזער photobleaching. מקוםצלחת פטרי על פלטה חשמלית נקבעה ל -40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות.
  4. כוונו את הטמפרטורה של הפלטה החשמלית במהלך התייבשות מן 24-70 מעלות צלזיוס כדי לכוון את הגודל של שלפוחית ​​נוצר (איור 5). 70 ° C הוא ליד T מ 'של agarose כך יש להיזהר בשימוש כאשר שתמשיך מעבר לטמפרטורה זו.

5. אפיון Polymersomes ידי שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP)

  1. הזז את coverslip עם דבק coverwell ישירות מיקרוסקופ הפוכה הדמיה.
  2. בחר את מערכת הסינון המתאימה בהתבסס על שומני פלורסנט נכללו פתרון הפולימר. עבור שומנים שכותרתו Rhodamine מסוממים לתוך פתרונות הפולימר, להשתמש במסנן עירור 560/25 ננומטר מסנן 607/36 ננומטר פליטה, או סינונים דומים.
  3. השתמש אובייקטיבי שמן 100X להתמקד המשטח העליון של coverslip שבו polymersomes יהיה דבק. אם polymersomes במיוחדגדול (> 20 מיקרומטר) או אם סרט הפולימר הוא עבה מדי, מטרת חשמל נמוכה יותר (למשל, 40X) יש להשתמש כדי להמחיש את polymersomes טוב יותר.
  4. זהה את polymersomes באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זהה polymersomes ידי השלפוחית ​​החלולה, כדורי המאפיין בקוטר> 5 מיקרומטר.
  5. לאפיין נזילות הממברנה באמצעות התאוששות קרינה לאחר photobleaching (FRAP) על מיקרוסקופ פלואורסצנטי המכיל קבל מתכווננת. בשל אופיו החסיד והאריזה הדוקה של polymersomes על המצעים, תנועה טבעית של polymersomes מוגבלת, הגדלת איכות הדמית FRAP.
    1. פוקוס מיקרוסקופ על polymersome עניין. סגור את הקבל לאזור קטן ולהבטיח כי קצה polymersome הוא בתוך אזור ההדמיה של עניין.
    2. הגדל את החשיפה המצלמה ולהבטיח את כל מסנני צפיפות נייטרלי יוסרו כדי photobleach אזור של אינטרס ביעילות. אפשר fl הממברנה uorescence עוצם כדי photobleach 30-60 שניות או עד עוצמת הקרינה יורדת משמעותית.
    3. כבה את המנורה ופתח לחלוטין את הקבל. להקטין את החשיפה בחזרה להגדרות החל ולהתחיל מיד לכידת תמונות כל 30 שניות במשך 3 דקות.
    4. חישוב מקדם דיפוזיה הממברנה באמצעות שיטות סטנדרטיות 12. אם האזור מולבן חוזר עוצמת הקרינה בתוך דקות 3-5, זה מצביע על כך הממברנה הוא נוזל.

אפיון 6. Polymersome גודל

figure-protocol-1
איור 6. תהליך לניתוח גודל polymersomes באמצעות תוכנת הדמיה. צעד אחר צעד הוראות כיצד למדוד את הקוטר של השלפוחית ​​נוצרה. המשתמש חייב לדעת את יחידות כיול בפיקסלים / מיקרומטר של המיקרוסקופ משמש.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. פתח את תמונות רכש של polymersomes בתוכנות ניתוח תמונת 13.
  2. הגדר את קנה המידה של התמונה על ידי לחיצה על תיבת לנתח נפתחת ואת הלחיצה "סולם הסט".
    1. כייל את המדד באמצעות מיקרוסקופ שיטות סטנדרטיות (כלומר, מיקרומטר).
    2. מלא את יחידות כיול ולחץ על "אישור".
  3. הקש על ארגז כלי הקו למתוח קו פורש בקוטר של שלפוחית.
  4. אסוף את מדידות אורך ידי לחיצה על לנתח התיבה הנפתחת ולחיצה "מידה".
  5. המשך מדידת שלפוחית ​​פרט ביצוע ההליך לעיל כל מדידה חדשה תתווסף בחלון הנתונים המדידים.
  6. לחצו על "Ctrl + D" אחרי ציור כל שורה ומדידת אורך להטביע הקו נמשך עלתמונה מה שהופך אותו קל יותר לעקוב אחר שלפוחית ​​כבר נותחו.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polymersomes נוצרו באמצעות ההליך המתואר לעיל (איור 1) וציוד המעבדה המשותף שמוצג באיור 2. Polymersomes היה rehydrated עם מים ללא יונים (איור 3) ו צלם על מיקרוסקופ הפוכה ב epifluorescence באמצעות מטרת שמן 100X. שים לב שאם polymersomes אינו גלוי, הם עלולים נוצרו בערך במידות גדולות מכדי ללכוד עם מטרת נפט 100X; מטרה חשמל נמוכה ייתכן שיהיה צורך להשתמש במקום. אחד היתרונות של שימוש התייבשות הג'ל בסיוע הוא הצדדי של להרכיב polymersomes במגוון פתרונות להחזרת נוזלים. Polymersomes נוצר בהצלחת מים ללא יונים, מדיום תרבית תאי יונקים מלא, פתרונות סוכרוז שתי תמיסות בופר רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (בופר פוספט (PBS) או מלוחה טריס שנאגר (TBS)), כפי שמוצגים באיור 4. בתנאים תקניים (התייבשותעם מים ב 40 מעלות צלזיוס במשך שעה 1), יותר מ ~ 70 polymersomes נמצאות בדרך כלל לכל 40 x 40 מיקרומטר 2 שדה הראייה. בעוד הייצור של polymersomes השטח אינו הומוגני, יש עשרות שדות של נוף עם התשואה המייצגת הזה. יתר על כן, polymersomes היו יציבים בתמיסה במשך שעה 24 לפחות.

גודל Polymersomes היה מכוון בקלות על ידי rehydrating סרטי פולימרים בטמפרטורות משתנות. Polymersomes נוצר מים ללא יונים ב RT היה בקוטר ממוצע של 2.9 ± 0.7 מיקרומטר. ככל שהטמפרטורה עולה במהלך התייבשות, הגודל הממוצע של polymersomes גם מעלה (טבלה 1). בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C), polymersomes נוצר עם גדלים עוד יותר מ -100 מיקרומטר (איור 5).

כל עיבוד התמונה הושלם באמצעות תוכנת הדמית קוד פתוח (איור 6).תמונות שנאספו נפתחו בתוכנה. גודל פיקסל המכויל הוזן תיבת מידה להגדיר. באמצעות כלי הקו, קווים היו משוכים על הקטרים. אחרי כל שורת פרט נמשכת, האורך המכויל נמדד והוסיף אל תיבת התוצאות. נתונים ניתן להתוות אז בתוכנה המתמטית של בחירה (למשל, Excel, פריזמה, מוצא וכו ')

figure-results-1
. תמונת איור 2. חומרי המעבדה הנפוצים וזולים הנדרשים להיווצרות polymersomes הפריטים הדרושים היא: Parafilm, מחט 18.5 G, פולימר כלורופורם או ממס מתאים אחר, קצה פיפטה 1,000 μl, נאד Erlenmeyer, פינצטה, agarose, 25 מ"מ coverslips מרובע, בארות הדמיה PDMS ו בכלי זכוכית פטרי. נא ללחוץ כאןלצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 3. תמונות של שיטת ההתייבשות בסיוע ג'ל. מומסות agarose משתרעות על coverslip 25 מ"מ מרובע, עד מעיילי סרט אפילו coverslip כולו. Coverslips אז הם הכניסו לתוך חממת 37 מעלות צלזיוס, סרט הוא מיובש. פתרון פולימר מופקד על הסרט agarose מיובש ולהפיץ באמצעות מחט בתנועה מעגלית. את coverslip לאחר מכן למקם בתוך O ייבוש / N להתאדות שאריות ממסות לחלוטין. לבסוף, קאמרי הדמיה מודבקת על המצע ופולימרים הם rehydrated עם פתרון מועדף והניחו לתוך צלחת פטרי ב 40 מעלות צלזיוס במשך לפחות 25 דקות, כדי לאפשר ההיווצרות של polymersomes. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות.

>

figure-results-3
Polymersomes איור 4. יכול להיווצר במגוון מאגרים שונים. סרטים פולימרי PEO-ה.ה.ר. היו rehydrated עם למאגר המצוין ב 40 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 5. הגדלת הטמפרטורה במהלך ההתייבשות מגדיל את גודל polymersomes. תמונות epifluorescence נציג של polymersomes נוצר במים בטמפרטורת ההתייבשות המצוינת. הגדלת תוצאות טמפרטורת polymersomes הגדול. בר סולם = 10 מיקרומטר._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טמפרטורה (° C) גודל ממוצע (מיקרומטר)
24 2.93 ± 0.7
40 5.76 ± 2.5
50 6.65 ± 2.4
60 11.46 ± 5.8
70 14.04 ± 7.0

טבלת 1. הגדלת הטמפרטורה במהלך תוצאות להחזרת נוזלים בגודל polymersome מוגברת. בקטרים ​​ממוצעים של יותר מ -100 polymersomes במים לכל מצב טמפרטורה שונה חושבו ו מתוארת כאן. שגיאה היא סטיית התקן.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polymersomes הופך בחן נרחב כמו מחק קרום ביולוגי. המאפיינים החזקים צדדיים של פולימרים להפוך אותן לאטרקטיביות נרחבת ללימודי מחייב functionalization קרום, אריכות ימים והיענות מכוונת. שיטות מסורתיות להרכיב polymersomes הענק בגודל 9,10 (> 4 מיקרומטר) הן עתיר עבודה ודורשות ציוד יקר והתמחה. כאן, אנו מציגים בפעם הראשונה, שיטה מהירה, תכליתית וחזקה להרכבת polymersomes הענק בגודל באמצעות למעבדה זולה תקן וציוד.

שימוש התייבשות הג'ל בסיוע, polymersomes unilamellar יכול להיווצר במהירות (<30 דק '), במגוון של פתרונות להחזרת נוזלים (כולל התקשורת תרבית תאים) ועם מגוון של פולימרים שונים (מידע לא מוצג). ההיווצרות של שלפוחית ​​multilamellar או אסימטריים לא נצפתה באמצעות טכניקה זו. במהלך עבודה זו, השתמשנו פולי (אתילן אוקסיד) - פולי B- (סטירן) (PEO-ה.ה.ר., EO 22 -BD 37) קופולימר diblock נייטרלי. קומפוזיציות פולימר שונים רבים (כולל קופולימרים diblock טעונה) גם לעבוד בשיטה זו (לא מוצג). עם זאת, חלק קופולימרים triblock המסחריים הקיימים קופולימרים diblock משקל מולקולרי גבוה (~> 5,000 Daltons) לא יוצרים polymersomes ברורים. עבור כל הניסויים בכתב היד הזה, ריכוז נמוך של שומנים שכותרתו היה מסומם לתוך פתרונות הפולימר למטרות להדמיה בלבד. שיטות אחרות להדמיה, כוללים פולימרים פונקציונליים ישירות עם פלורסנט לצבוע ניתן להשתמש גם. Polymersomes ניתן הדמיה גם עם מיקרוסקופ שדה בהיר, אם כי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק רזולוציה גבוהה יותר.

רוב השינויים קלים בצורת הפרוטוקול בדרך כלל לא לשנות את התוצאות. למשל, הבדלים קטנים בריכוז של פתרון הפולימר להתפשט על coverslips אינם משנים את ההיווצרות של f הפולימרILM יצר. בעוד טווח הריכוז המלא לא נקבע, היווצרות polymersome תתרחש בהצלחה עם מגוון גדול של ריכוזי פולימר הסרט (למשל, 1-10 מ"ג / מ"ל). עם זאת, יש כמה שינויים בפרוטוקול כי אין השפעה שלילית על היווצרות polymersome. הבולט ביותר הוא כי coverslips זכוכית העגול (במקום מרובע) לגרום להיווצרות עניה מאוד של polymersomes. אנו מייחסים זאת המעיל מאוד אפילו של agarose על זכוכית אשר למעשה מעכבת היווצרות polymersomes.

אחד האתגרים הבולטים של שיטה זו היא היכולת לשחזר את polymersomes מפני השטח עם תשואה גבוהה. ישנם מקרים מסוימים בהם הסרת polymersomes מפני השטח המקורי יכול להיות יתרון. בשל קרינת רקע הגבוהה מסרט הפולימר המיובש, הסרת polymersomes פרט והקפדה אותם לנקות coverslips יגדל איכות הדמיה ואפיון (Particularly במהלך ניתוח FRAP). לשם, זה pipetting העדין עם קצה פיפטה שבו חל הסיום נותק יהיה desorb polymersomes מפני השטח (אם כי המספר של שלפוחית ​​התאוששה נמוך משמעותי מאלה נוצרו במקור). Polymersomes ניתן להציב אז על משטחי coverslip שונים, מה שמאפשר polymersome לקיים אינטראקציה עם coverslip החדש. בדרך כלל, עבור polymersomes PEO-ה.ה.ר. נייטרלי, coverslips שטופלו האוזון במשך 15 דקות לאפשר polymersomes ליפול אל פני השטח הדמיה. שינוי פני שטח שונה נדרש עבור יצירות polymersome שונות (למשל, שלילי או חיובי טיעוני פולימרים).

רוב החומרים המשמשים פרוטוקול זה מאוחסנים בהצלחה ומשמשים במשך ימים עד שבועות. את agarose הקרושה ניתן reboiled ולעשות בהם שימוש חוזר עד agarose מתחילה לקבל אגרגטים אפילו לאחר הרתיחה, או agarose הקרושה מתחיל להתייבש. Coverslips עם סרטים agarose יבשים ניתן לאחסן ולהשתמשד ללא הגבלת זמן (למשל, חודשים). הפולימר מומס כלורופורם יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. לאחר סרט הפולימר הוא מיובש על סרטי agarose, עם זאת, הסרטים צריכים להיות מאוחסנים תחת ואקום הבית בשימוש בתוך שבועות (אחסון לטווח ארוך לא נקבע באופן ישיר, אבל יש הבדלים בולטים polymersomes נוצרו סרטי פולימרי מבוגרת שני שבועות).

באמצעות הפרוטוקול להחזרת נוזלים בסיוע ג'ל המוצג כאן, מאה polymersomes בצורה אחידה נוצרים במהירות עם רק כמה שעות של עבודה תוך שימוש בציוד סטנדרטי למעבדה זולה. יתר על כן, יכול להיווצר polymersomes במגוון פתרונות חיץ פיזיולוגיים מ קומפוזיציות פולימר שונים (לא מוצג). שינויים קלים השיטה לא שלילי לשנות את היווצרות polymersomes, טיוח התייבשות הג'ל בסיוע טכניקה צדדי ונגיש למדענים משתנה דואר טכניxpertise.

היכולת ליצור polymersomes ענק בקלות על גודל בקנה מידה של תאים חיוני לבניית מערכות דמוי תא מלאכותי. קלות שימוש צדדי של התייבשות הג'ל בסיוע לעשות polymersomes אלה מציעות קידום ענק בתחום biomimetic ליצירה מחק תא-קרום חזק. לדוגמא, באמצעות טכניקה זו, אסטרטגיות אנקפסולציה של רכיבים תאיים שונים, functionalization של הפולימר עם חלבונים-קרום תא שילוב של חלבוני תחבורת קרום, רק כדי שם כמה, יכול להיות מתוכנן לבנות תאים מלאכותיים מבוסס polymersome.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sandia National Laboratories היא מעבדה רב-תכליתית המנוהלת ומופעלת על ידי Sandia Corporation, חברת בת בבעלות מלאה של תאגיד לוקהיד מרטין, עבור המינהל הלאומי לביטחון גרעיני של משרד האנרגיה האמריקני תחת חוזה DE-AC04-94AL85000.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר איאן מ. הנדרסון, אנדרו גומז וד"ר וולטר פ. פקסטון על המומחיות הטכנית, הייעוץ והעזרה בעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי משרד האנרגיה של ארה"ב, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסיים, החטיבה למדעי החומרים וההנדסה (BES-MSE). ACG, DYS ו-GDB נתמכו על ידי BES-MSE. עבודה זו בוצעה, בחלקה, במרכז לננוטכנולוגיה משולבת, מתקן משתמש של משרד המדע המופעל עבור משרד המדע של משרד האנרגיה האמריקני (DOE) (מספר פרויקט משתמש RA2015A0004, PI: ACG).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
125 מ"ל בקבוק ארלנמאיירVWR89000-360
18 מחט מדVWRBD-305196
25 מ"מ כיסויים מרובעיםVWR48366-089
אגרוזסיגמאA9539אגרוז סטנדרטי לאלקטרופורזה של ג'ל DNA
כלורופורםסיגמא288306-2L
כיסוימסחרימדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית70336מבודדי סיליקון לחץ לאיטום
פיג'י תוכנת ניתוח תמונהImageJהורדה בחינם: http://fiji.sc/Fiji  
בקבוקון זכוכית עם מכסה טפלוןVWR66009-556קיבולת 1.9 מ"ל, מארז של 144
ליס-רודמין B PEליפיד Avanti Polar Lipids810150C1 מ"ג שומן בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל בכלורופורם
ParafilmVWR52858-00010.2 ס"מ x 38.1 מ'
פולי (אתילן אוקסיד)-b-פולי (בוטאדיאן) או PEO-PBD (במשקל מולקולרי של 2,940)מקור פולימריP2904-BdEOhttp://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf
צלחת פטרי פסטיתVWR25384-092
קלטת טפלוןVWR300001-0571/2 אינץ' רוחב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
  2. Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
  3. Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
  4. Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
  5. Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
  6. Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
  7. Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
  8. Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
  9. Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  10. Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
  11. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
  12. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FRAP

מאמרים קשורים