Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

Summary

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Abstract

דג עוקצן threespine התפתח כמערכת רבה עצמה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של מגוון רחב של מורפולוגיים, פיסיולוגי, פנוטיפים התנהגותיים. פנוטיפים המגוונים להפליא שהתפתחו כמו אוכלוסיות ימיות להסתגל לסביבת מים מתוקה אינספור, בשילוב עם היכולת לחצות צורות ימיות מים מתוקים, לספק מערכת החולייתנים נדירה בם גנטיקה יכולה לשמש כדי למפות אזורי גנומית שליטה התפתחה תכונות. משאבי גנומי מצוינים זמינים כעת, הקלה לנתיחת גנטיקה מולקולרית של שינויים התפתחו. בעוד ניסויי מיפוי ביצירת רשימות של גני מועמדים מעניינים, מניפולציות גנטיות פונקציונליות נדרשות לבחון את התפקידים של גנים אלה. ויסות גנים ניתן ללמוד עם פלסמידים BACS כתב מהונדסים משולבים לתוך הגנום באמצעות מערכת transposase Tol2. פונקציות של גנים מועמדים ספציפיים ואלמנטים רגולטורית ציס ניתן להעריך על ידי גרימת ממוקדמוטציות עם Talen ו CRISPR / Cas9 ריאגנטים עריכת הגנום. כל השיטות דורשות החדרת חומצות גרעין לעוברי קוצן חד תא מופרה, משימה שנעשתה מאתגר ידי סיסי העבה של עוברת קוצן ואת blastomere הקטנה ורזה יחסית. כאן, פרוטוקול מפורט עבור microinjection של חומצות גרעין לעוברי קוצן מתואר ליישומים מהונדסים הגנום עריכה ללמוד ביטוי גנים ותפקוד, כמו גם טכניקות כדי להעריך את ההצלחה של transgenesis ולשחזר קווי יציבה.

Introduction

מרכיב בסיסי אחד של הבנה כיצד מגוון ביולוגי המתבקשת הוא לקביעת הבסיסי הגנטי והתפתחותיים של שינויים פנוטיפי התפתחו בטבע. דג עוקצן threespine, Gasterosteus aculeatus, התפתח מודל מצוין לחקר הבסיס הגנטי של אבולוציה. הקוצנים עברו שינויים אבולוציוניים אדפטיבית רבים כמו דגים ימיים יישבו בסביבות מים מתוקים אינספור ברחבי חצי הכדור הצפוני, וכתוצאה מכך מורפולוגיים דרמטי, פיזיולוגיים, ושינויים התנהגותיים ^1. בגנום של אנשים מגובה של עשרים ואחד אוכלוסיות קוצן היה רצף והרכיבו, ומפה הצמדה צפיפות גבוהה נוצרה על מנת לשפר יותר את מכלול ^2,3. ניסויי מיפוי גנטיים זיהו אזורים גנומית שבבסיס פנוטיפים התפתחו ^{4 - 6,} ובעוד כמה מקרים, התפקידים התפקודיים של גני מועמדים ספציפיים נבדקו ^7,8. מספר האזורים גנומית שבבסיס שינויים מורפולוגיים זוהה עם גני מועמדים מבטיחים, אך מועמדים אלו טרם נבדקו מבחינה תפקודית ^{9 - 12.} בנוסף, הקוצנים הם מודלים נפוצים ללימודים של גנטיקה של אוכלוסיות / הגנומיקה ^13,14, התפצלות ^15, התנהגות ^1, אנדוקרינולוגיה ^16, ecotoxicology ^17, אימונולוגיה ¹⁸ ופרזיטולוגיה ^19. מחקרים עתידיים בכל אחד מהתחומים הללו ייהנו היכולת לבצע מניפולציות גנטיות תפקודיות הקוצנים. בנוסף מניפולצית רצפי הקידוד שלהם, את התפקידים של גני מועמדים ניתן להעריך על ידי לימוד הרצפים רגולטורית ציס שלהם ועל ידי הגדלה מבחינה תפקודית, קטן, או ביטול הביטוי של גן המועמד. שיטות Microinjection ו transgenesis ב הקוצנים מבוססות היטב ^7,8,20 ו בתחילה פותחו באמצעות meganuclease בתיווךשיטה ²¹ תוארה לראשונה בשנת medaka ^22. שיטת microinjection השונה המוצגת כאן כבר אופטימיזציה עבור שניהם transgenesis Tol2 בתיווך ופתחה לאחרונה ריאגנטים עריכת הגנום כולל TALENs ו CRISPRs.

שינויי האלמנטים רגולטורית ציס נחשבים קריטי לאבולוציה מורפולוגיים, כמו השינויים רגולטורית ציס יכולים למנוע את ההשלכות השליליות של pleiotropic קידוד מוטציות ^23. לכן, בדיקה והשוואת רצפים רגולטורית ציס משוערים הפכה ליעד מרכזי של מספר גדל והולך של מחקרים אבולוציוניים. בנוסף, רוב גרסאות מחלות אנושיות הן גרסאות רגולטוריות ^24,25, ומערכות חוליות מודל נדרשים עז ללמוד לתפקד אלמנט רגולטורית ציס וההיגיון. דגים כי לדשן העוברי שלהם כלפי חוץ במספרים גדולים להציע מערכות חוליות רבות עצמה כדי לחקור -regulation cis. מערכת transposon Tol2, שבו foreiDNA GN להיות משולבת בגנום מוקף Tol2 transposase אתרי קישור ושיתוף הזריקו Tol2 transposase mRNA, עובד עם יעילות גבוהה לשילוב בהצלחה פלסמיד בונה לתוך הגנום דגים ^{26 - 28.} בדרך כלל, משפר הפוטנציאל הוא משובטים במעלה הזרם של האמרגן הבזליים (כגון hsp70l ²⁹⁾ ואת הגן כתב ניאון כגון EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת) או mCherry בתוך עמוד השדרה Tol2 והזריקו עם transposase mRNA ^26. תצפית ביטוי של כתב הניאון, בין אם עובר מוזרקים או צאצא עם transgenes משולב ביציבות, מספקת מידע על ויסות spatiotemporal של ביטוי גנים מונעת על ידי המשפר המשוער. בניסויים נוספים, משפרי תוקף ניתן להשתמש בכונן ביטוי יתר ספציפי רקמות של גנים של עניין.

באשר לניתוח אזורי רגולטורית ציס גדולים, באיכות גבוהה genom בקנה הכנסic ספריות באמצעות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) נבנו עבור שני הקוצנים ימיים מים מתוקים ^30. Bács אלה ניתן recombineered להחליף גן עם גן כתב ניאון בהקשר של (kb 150-200) גדול באזור הגנומי ^31. כתב הניאון מתבטא אז דפוס spatiotemporal כפי שנקבע על ידי רצפי רגולציה בתוך BAC. עבור מחקרים בדגים, אתרי Tol2 ניתן להוסיף גם את BAC כדי להקל אינטגרציה הגנומי ^32,33. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות כאשר הכלאה באתרו הוא מאתגר מבחינה טכנית, את ההודעה הניאון של BAC יכול לשמש כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים, כפי שהוכח לחלבון קוצן עצם המוךפו"גנטי שהולך 6 (Bmp6) ^20. בנוסף, דפוסי ביטוי ניאון אדם יכול להיות במעקב לאורך זמן, אשר לא יכול להיות מושלם עם הכלאה באתרה. Bács יכול לשמש גם כדי להוסיף additionaעותק l של אזור גנומי כדי להגדיל את המינון של גן של עניין.

לצורך המחקר של תפקוד הגן, עריכת הגנום הוא השדה המתרחב בפיצוץ, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שינויים ממוקדים אל רצפי הגנום במגוון רחב של אורגניזמים ^34. מפעיל דמוי תמלול nucleases מפעיל (TALENs) הם nucleases מודולרי, ספציפית רצף מבודד במקור פתוגנים צמח יכול להיות מהונדסים בדיוק להיקשר ישירות רצף גנומי של בחירה וליצור גדיל כפול לשבור ^35,36. באשכולות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / מערכות CAS נמצאו במקור חיידקים להשתמש RNA מדריך ואת החלבון Cas9 כדי ליצור הפסקה ברצף ה- DNA היעד משלים מדריך ^37. התיקון בדיעבד של הפסקת הגדיל הכפולה שיצרה שתי TALENs ו CRISPRs לעתים קרובות משאיר אחריו כניסה קטנה או מחיקה, אשר יכול לשבש את הפונקציה של רצף היעד35-37. בשנת הקוצנים, שימשו TALENs לשבש ביטוי גנים על ידי מיקוד משפר ^20, ושניהם TALENs ו CRISPRs יצרו בהצלחה מוטציות קידוד רצפים (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול מפורט עבור הדור של CRISPRs לשימוש דג הזברה יכול לשמש כקו מנחה לפתח CRISPRs עבור הקוצנים ^38.

מהונדס וניסויי עריכת הגנום דורשים מבוא של חומצות גרעין לתוך עובר חד-תאי שהופרה זה עתה. על ידי הצגת כלי transgene או הגנום עריכת בשלב מוקדם של התפתחות, מספר תאי הבת מניפולציות גנטיות בעובר מוגדל. עובר מוזרק אז מוקרנים חזותיים עבור קרינה או הוקרנתי מולקולרי עבור שינויים בגנום. אם תאי תורם germline ממוקדים בהצלחה, את הגן או המוטציה יכול להיות עברה על קבוצת משנה של צאצאים, גם כאשר הקטלניות לאחר הזרקה היא גבוהות. דג הפסיפס ניתן outcrossed אוintercrossed וצאצאיהם הוקרנו לשחזר את אללים מוטנטים או transgene משולב ביציבות של ריבית. פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנסת transgenes ריאגנטים עריכת הגנום לעוברי קוצן חד-תאים וניטור עבור שינויים גנומיים מוצלחים.

Protocol

כל העבודה דגים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קליפורניה-ברקלי (מספר פרוטוקול R330).

1. הכינו חומצות גרעין עבור הזרקה

1. Tol2 פלסמיד Transgenesis (מעובד מתוך פישר ^26).
   1. חותכים 10 מיקרוגרם transposase פלסמיד (PCS-TP) ³⁹ עם 10 U NotI במאגר שסופק עבור שעה 1 ב 37 ° C עד linearize.
      הערה: הסכמי העברת חומר עשויים להידרש לקבל פלסמידים Tol2.
   2. חלץ את הפלסמיד לחתוך עם 25: תערובת 1 של פנול: 24 כלורופורם: אלכוהול isoamyl ואת המשקע אתנול עם נתרן אצטט פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^40. Resuspend פלסמיד ב 50 μl מים RNase חינם.
      הערה: פנול, כלורופורם אמור לשמש במנדף ואת הפסולת חייבת להיות מסולקת כראוי בהתאם להנחיות מוסדיות.
   3. הגדרה בתגובת שעתוק SP6 פי הוראות היצרן.
   4. השתמש RNA Isolערכת ation לנקות תגובת שעתוק על פי הוראות היצרן; resuspend רנ"א 50 מים μL RNase חינם.
   5. הסר aliquot 1 μl של רנ"א. מחממים עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל מבנים משניים ומיד לצנן על הקרח. להקפיא נותרי תגובת שעתוק ב -80 מעלות צלזיוס.
   6. הפעל את aliquot RNA על ג'ל agarose 1% ב 0.5x טה (בסיס טריס, חומצה אצטית, חומצת Ethylenediaminetetraacetic) הפעלת מאגר עם תקן גודל RNA בנתיב אחד. המוצר הצפוי הוא 2,200 נ"ב; וזורק אם> 5% של רנ"א הכל מופיעים כתם קטן מ -2,200 נ"ב, אשר מציין שפלה נרחבת (איור 1).
   7. לכמת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר. לדלל 350 ng / μl ב RNase ללא aliquots מים ולאחסן 1 μl ב -80 ° C (טוב במשך שנתיים לפחות).
   8. Clone Tol2 פלסמיד הכתב (למשל, באמצעות pT2HE ⁸ או פלסמידים מתוך הערכה Tol2 ⁴¹⁾ עם ציס- אלמנט מווסת של עניין. בקצרה, PCR להגביר רצף הדנ"א הגנומי של עניין עם פריימרים המכילים אתרי הגבלה נמצאים פלסמיד, לעכל את מוצר וקטור PCR עם האנזים (s), ולקשור את הכנס לתוך הווקטור, ולהפוך פלסמיד שנוצר לתוך E. המוסמכת coli ^40. לבודד פלסמיד עם ערכה הכוללת שטיפת רעלן פנימית על פי הפרוטוקול של היצרן.
   9. בצע טיהור שנייה של פלסמיד Tol2 עם ערכת טיהור PCR על פי הפרוטוקול של היצרן. Elute ב 30 μl מים RNase חינם.
      הערה: תשואת משלב זו עשויה להיות נמוכה (לפעמים מתחת 50% של פלסמיד הקלט).
   10. לדלל פלסמיד ~ 125 ng / μl במים RNase חינם.

באיור 1. ג'ל mRNA Transposase. פרו תגובת שעתוק מטוהר(Μl 1) צינור חומם לטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, מקורר על הקרח, ולהפעיל על ג'ל agarose 1% עם TAE 0.5x הפעלת המאגר ב -100 V. הגדלים הסולם רנ"א kilobases (kb) מסומנים בצד שמאל . ה- mRNA transposase באורך המלא הוא להקה בהירה ב ~ 2.2 kb. כמות קטנה אך מקובל של mRNA מושפל או שלם נתפסת מתחת 2.2 kb. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. BAC Transgenesis (ראה Suster ^32,33 עבור טכניקות BAC Recombineering)
   1. כן BAC מ E. coli באמצעות ערכת טיהור BAC על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש משקעים אתנול להתאושש DNA עם מיצוי אצטט-אתנול נתרן תקן ⁴⁰ ו- DNA גלולה ב ~ 250 ng / μl במים RNase חינם.
   2. כן mRNA transposase כאמור בסעיף 1.1.
3. מוטציה אינדוקציה עם TALENs (ראה צ'רמאק
4. השתמש יישום מבוסס אינטרנט לעצב TALENs עבור הגן של עניין ^42. במידת האפשר, עיצוב TALENs לשבש אתר לחתוך אנזים הגבלה כדי להקל על ניתוח מולקולרי.
5. Clone TALENs ולהכין פלסמידים עבור שעתוק הבאים שפורסמו פרוטוקול ^35.
6. לתמלל Talen mRNA עם התגובה שעתוק SP6 פי הוראות היצרן ולנקות mRNA כפי שתואר עבור transposase בסעיף 1.1.4. לכמת עם ספקטרופוטומטר לדלל 200 ng / μl במים חינם RNase. הפעל Talen mRNA על ג'ל כדי לוודא שהוא בגודל הנכון ולא מושפל כמתואר בשלב 1.1.6.
7. עיצוב זוג פריימרים PCR כדי להגביר כ 100-200 נ"ב שמסביב רצף היעד Talen באמצעות כלי עיצוב פריימר ואת רצף ה- DNA היעד ^43. הזמן את אנזים ההגבלה המתאים לבדוק עבור נגעים באתר היעד מבוססים על צעד 1.3.1.

CRISPR Transgenesis (ראה טאלבוט Amacher ³⁸ לעיצוב הכנת CRISPRs):

1. CRISPRs תכנון להכין Cas9 mRNA על פי פרוטוקול ^38, ו פריימרים ו אנזימי הגבלה האישור המתאים כדי כמתואר בשלב 1.3.4.

2. כן ריאגנטים הזרקה

1. השתמש בורוסיליקט נימים להכין מחטים כפי שנראה בהמשך.
   הערה: הנימים אלה אינן הנימים הסטנדרטיות המשמשות עבור microinjection דג הזברה, והם עשויות זכוכית עבה וחזקה כי הוא קריטי לנקב את סיסית קוצן הקשוחה.
   1. תמיד ללבוש כפפות ניטריל או לטקס בעת משיכת מחטים, ואינם מאפשרים מחטים לפנות שמנים העור ובעור.
   2. לקבוע פרמטרים משייכי micropipette אמפירית על ידי בדיקות רמפה בעקבות הוראות היצרן של micropipette חולץ. לדוגמא, עם נימת קופסא, את הפרמטרים הבאים היו להרתיעממוקש להיות אופטימלי: (חום = 515, משוך = 60, מהירות = 60, עיכוב = 85, לחץ = 500). הגדרות אלה מייצרות מחט כי נרות בתלילות על כ 12 מעלות במשך ~ 2 מ"מ ואז סיומת ארוכה כי נרות בכ 2 מעלות במשך ~ 6 מ"מ (איור 2).
      הערה: הפרמטרים הראויים ישתנו לפי חולץ ו נימה, ו בעיוורון באמצעות תכנית מבלי לקבוע את הפרמטרים ראשונים באמצעות בדיקות רמפה יכולה להרוס את הנימה של החולץ לצמיתות, וזה קשה ויקר להחליף.
   3. עקוב אחר הוראות היצרן כדי למשוך לפחות 4 מחטים micropipette מן הכוס בורוסיליקט עם ההגדרות שנקבעו 2.1.2.
   4. מחטי חנות אנכיות קנקן נימים עם הקצה החד כלפי מטה.
   5. לפני ההזרקה, להציב קנקן נימים על קרח לצנן מחטים. להוסיף פיסת מגבת נייר לחה כדי הצנצנת כדי למנוע אידוי פעם המחטים מלאות.
2. להפרות ביציות (כלצעדים הנערכת ב RT)
   1. רצועת המצמד הביצית מן קוצן נקבה הרה להולדת על ידי כיווץ הבטן בעדינות ומלטפת בבית הקדמי אל האחורי כיוון לדחוף את הביצים החוצה דרך הביב לתוך 35 x 10 מ"מ ² בצלחת פטרי. הוספת חתיכת לחי מגבת נייר בצד אחד של צלחת פטרי (לא נוגע ביצים) ליצור תא לחות. מניחים את המכסה על צלחת פטרי כך ביצים להישאר לחה.
   2. להרדים קוצן גברי 0.025% Tricaine-S שנאגר עם סודיום ביקרבונט 0.1%.
   3. גזור לפתוח את הבטן, להסיר האשכים מרוכך ב 250 הפתרון של μl האנק (ראה Westerfield ⁴⁴ עבור פרוטוקול מלא להכנת פתרון של האנק).
   4. לדשן לכל היותר 100 ביצים עם 50 μl פתרון זרע ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה כדי להבטיח את כל הביציות מופרות. אם המצמד הוא> 100 ביצים, לדשן מחצית הביצים מאוחר יותר על מנת להבטיח כי כל העוברים נמצאים בשלב אחד תא בזמן ההזרקה. ביצים ניתן להשאיר מופרות ב RT עד שעה, והזרע נמשך בדרך כלל 1-7 ימים ב 4 ° C בתמיסה של האנק.
   5. שמור עובר מכוסה מכסת צלחת פטרי לאחר הפריה כדי למנוע התייבשות. אפשר 20-25 דק 'עבור התא הראשון לצוץ להתנפח (להכין חומרי הזרקה במהלך הזמן הזה).
   6. למלא צלחת 150 מ"מ x 15 מ"מ פטרי עם מי קוצן. (כדי להפוך מי קוצן, להכין ראשון 10% סודיום ביקרבונט מומס במי deionized. לאחר מכן להוסיף 3.5 גרם תערובת מי ים מלאכותי 0.217 מיליליטר של 10% סודיום ביקרבונט לכל 1 ליטר של מים ללא יונים, ומערבבים / לנער במרץ לפזר מלח.)
3. כן פתרון הזרקה (בעוד ביצים הן זבול)
   1. כן פתרון הזרקה לפי טבלת 1 ולאחסן על קרח.
      הערה: ריכוזי חומצות גרעין כמה כבר עלו מ לאלה שפורסמו עבור דג זברה עקב הכמות המוגברת של blastomere קוצן.

מֵגִיב	הזרקת Tol2	הזרקת BAC	הזרקת Talen	הזרקת CRISPR
Tol2 mRNA	350 ננוגרם	350 ננוגרם	-	-
DNA	150-200 פלסמיד ng	200-300 ng BAC	-	-
Talen mRNA	-	-	200 ng כל	-
RNA מדריך CRISPR	-	-	-	200 ננוגרם
Cas9 mRNA	-	-	-	400 ננוגרם
0.5% פנול אדום inDulbecco של PBS	0.5 μl	0.5 μl	0.5 μl	0.5 μl
מים חינם RNAse	עד 5 μl	עד 5 μl	עד 5 μl	עד 5 μl

ther.within-page = "1" height = "301" width = "511">

טבלת 1:. ריאגנטים הזריקו כל התערובות צריכים להיות מוכנות כדי בהיקף כולל על 5 μl ומאוחסנים על קרח.

4. מלאו מחטים (על הקרח; לאפשר לפחות 10 דקות עבור מחטים כדי למלא).
   1. למילוי לפחות שלוש מחטים על ידי pipetting פתרון הזרקה 0.5 μl אל הקצה העליון הקהה של המחט תוך מחטים תלויות אנכיות קנקן נימים. תיזהר כי הירידה נשארת על גבי ואינה לטפטף למטה בצד ולהימנע בועות.
   2. לאחר הנוזל האדום בעיקר נקז אל הקצה המחודד של המחט, להוסיף עוד 0.5 μl אל הקצה הקהה של המחט ולאפשר לו לנקז.

3. כן להזריק Rig ו מחטי Microinjection

הערה: ג צעדים אלהלהיעשות לרוב לאחר הפריית הביצים.

1. הפעל אור שקוף עבור מיקרוסקופ לנתח ומניחים צלחת זכוכית ~ 13 ס"מ x 13 ס"מ על בסיס אור מיקרוסקופ עם 15 ס"מ טיח ראה להב על גבי צלחת זכוכית ^7. אוריינט המסור בניצב מנגנון הזרקה עם החריצים הפונה לכיוון בעל מחט.
2. הפעל אספקת האוויר להבטיח לחץ מוגדר ~ 200 kPa הרגולטור.
3. הפעל את תיבת הבקרה ולהתאים את ההגדרות. לחץ מוגדר ~ 150-175 kPa. הגדר משך ההזרקה ל -180 מילי-שניות.
4. שחרר את בעל המחט, להכניס מחט מולא לתוך מחזיק עד התנגדות של בעל הגומי יכולה להיות מורגשת, והדק עד אצבע חזקה.
5. התאם את זווית המחט כ 45 °.
6. השתמש בבקרת micromanipulator להתאים את המחט כך בסופו של דבר הוא מרוכז בתחום של נוף. גדל כדי הגדלה ~ 40X ולהתמקד קצה המחט, אשר לא צריך להיות נוגעהזכוכית מתחת.
7. בעדינות לשבור את קצה המחט על ידי לתפוס אותו עם מלקחיים של שען. באופן אידיאלי, לא לשבור בניצב, אלא בזווית ~ 60 °. לשבור קרוב קצה (לא יותר מ 2-3 רוחבי מלקחיים הרחק בסופו של דבר, איור 2).

איור 2. מחטי microinjection רצופות שבורות. המחט העליונה היא רצופה ואת קצה המחט התחתונה נשבר עם מלקחיים (חץ). מחטים מלאות בתמיסה המכילה אדום 0.05% פנול. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

8. לחצו על הדוושה הזרקת ברגל מספר פעמים על מנת לבדוק אם המחט היא שבורה. אחרי כמה דפיקות, טיפות אדומות זעירות צריכות להתחיל לצאת tהוא בסופו. אם לא, נסו לשבור את המחט מעט גבוה יותר.
9. אם המחט יש בועת אוויר, להגדיל את יחידת לחץ בחזרה ולחץ על הדוושה מספר פעמים במהירות כדי לחשב את הבועה.
10. התאם את הלחץ חזרה:
    1. השתמש פיפטה העברת הפנויה להציב כמה טיפות של מים קוצן על צלחת זכוכית.
    2. בעדינות להוריד את המחט לתוך המים.
    3. להגביר את הלחץ בחזרה עד זרם קלוש של נוזל ורוד עולה מהמחט (המציין לחץ חיובי).
       הערה: אם אין מספיק לחץ בגב, המחט תמשוך את הציטופלסמה ידי פעולת נימים. אם יש יותר מדי לחץ בחזרה, את עוצמת הזריקה יכולה להיות בטעות גדולה מדי.
    4. לחזור בו מחט ככל האפשר, כך שהוא לא יינזק בעת ההכנה העוברית (ראה להלן).
11. לחלופין, כוונן את הלחץ חזרה הגדרה בלחץ גבוהה, כך זרם חזק מתמיד של נוזל יוצא מחט wתרנגולת הוא שקוע במים. לאחר מכן, הלחיצה על דוושת הרגל להזריק הופכת מיותרת; עם זאת, הזריקה חייבת להתבצע במהירות כדי למנוע הזרקה מעל.
    הערה: אל תנסה הטכניקה הזו כאשר לומדים הראשון להזריק.

4. Microinjection

1. כ -25 דקות לאחר הפריה, משתמשים בשני 10 μl טיפי pipet להסיר 5-10 העוברות מן המצמד והעברת צלחת הזכוכית.
2. ובכל זאת באמצעות הטיפים pipet, בעדינות להפריד את העוברים לתוך החריצים הפרט של להב המסור. היזהר שלא לנקב עובר.
3. באמצעות העברת pipet עם סוף לנתק כך עובר קוצן יוכל להיכנס, להוסיף מי קוצן מספיק כדי לכסות את העוברים, להשאיר את המים במשך 3-5 שניות, ולאחר מכן להסיר את עודפי המים עם pipet, עוזב נפח קטן של ציפוי מים כל עובר.
   הערה: מדי מים רבים יגרמו chorions להקשיח ולשבור את המחט, אבל נפח קטן של מים יש צורך להרים את chאוריון מן התא חלמון (איור 3 א - ב).
4. החל עם הקליעה העובר משם, להחליק את צלחת זכוכית להתקרב כך העובר הראשון ממלא כ -25% של שדה הראייה.
5. מנמיך את המחט לתוך שדה הראייה, ולאחר מכן השתמש טיפ 10 μl pipet בעדינות לסובב את העובר כדי לזהות את blastomere, בליטה מגורענת, צהובה מורמת מעט של הציטופלסמה על גבי החלמון (איור 3 ב), ולאחר מכן לסובב כך blastomere הוא ישירות בניצב בסופו של המחט (תוך שמירה על העובר הזחה של להב המסור, איור 3 ג).
   הערה: טיפות חלמון יכול להעביר עד העובר הוא הסתובב, ולכן אין להשתמש בהם כמסגרת התייחסות למיקום של blastomere.
6. מנמיך את המחט לתוך הציטופלסמה אבל לא לדחוף ועד החלמון הבסיסי. החל לחץ לאט ובאופן שווה כאשר הפירסינג הסיסי כדי למנוע שבירת המחט. אםעיקולי מחט קשה, לחזור ולנסות שוב במיקום שונה במקצת.
7. לחץ על דוושת רגל 3-4 פעמים להזריק כך בולוס אדום עם קצוות מפוזר מעט ממלא כ ~ 1/8 בקוטר של הציטופלסמה (ראו איור 3D).
   1. הימנע קבלת בולוס אדום עם קצוות חדים שלא מתחילים לפזר, דבר שמצביע על הזרקת בחלמון מתחת בציטופלסמה (איור 3E).
   2. אם כתם ורדרד-אדום בוהק מפזר במהירות, הכנס את המחט עוד לנקב את blastomere.
   3. אם בולוס ההזרקה הופך צהוב מיידי, לסובב את העובר על מנת להבטיח את blastomere היווה מטרה ולהזריק שוב (איור 3F).

איור 3. מראה של עובר קוצן לפני ואחרי ההזרקה. כל העוברים שאובי הפרספקטיבת דואר להסתכל למטה מבעד למיקרוסקופ (למעט ג 'ו-ז). (א) לפני הוספת מים, עוברים מופרים יש מראה אחיד עם טיפות שמן צף בסמוך לחלקו העליון של החלמון. (ב) לאחר הוספת מים, הגלים הסיסיים, חושף blastomere שבולט מן החלמון והיא גלויה פרופיל. (ג) סיבוב של העובר כך המחט נכנסת בניצב הסיסי ו blastomere. (ג ') עם נוף צדדי של מחט אשר נקבה סיסית עם הקצה בציטופלסמה. (ד) הזרקה לתוך תוצאות הציטופלסמה ב נקודה אדומה עם קצוות מפוזרים כי לדעוך עם זמן. (E) הזרקה לתוך החלמון שבבסיס תוצאות הציטופלסמה ב נקודה אדומה עם קצוות מוגדרים. (F) הזרקה לתוך החלמון מול תוצאות הציטופלסמה ב שינוי צבע נגרמת pH מאדום לצהוב. (G) לרוחבלאור תוצאות הזרקה, עם סימן X על פני מקומות הזרקה תת-אידיאליים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

8. השתמש בפקדים micromanipulator לחזור בו את המחט, באמצעות קצה 10 μl pipet להחזיק את העובר אם היא נדבקת אל המחט.
9. לאחר חוזרת בה המחט, להחליק את צלחת זכוכית כדי ליישר את העובר הבא עם המחט.
10. לאחר הזרקת כל העוברים, השתמש העברת pipet להוסיף מים העוברים, ולאחר מכן לאסוף אותם פיפטה ההעברה ומניחי 150 מ"מ צלחת פטרי מלא מי קוצן.
11. להתנגב צלחת זכוכית עם מגבת נייר כדי להימנע מצבירת יותר מדי מים.
12. פזר עוברת טרי על המסור וחזור על שלבי 4.4 דרך 4.10.
13. שמור ~ 10% של עוברים בקרות uninjected כדי להבטיח כי עוברי uninjected להתפתח באופן נורמלי ולהשתמש כפקדים wild-type עבור tהוא מבחן מולקולרי כמתואר להלן.

5. טיפול הזרקת הודעה

1. דגירה עוברים בצלחות פטרי על 18 מעלות צלזיוס לאחר ההזרקה עד הבקיעה ^10. בעקבות בקיעה, זחלים אחוריים באקווריום כמתואר ^10.
2. בעדינות יוצק את היום אחד מי קוצן לאחר ההזרקה ולהחליף מי קוצן טריים. חלף עם מי קוצן טריים לפחות פעם בימים לאחר מכן.
3. בדקו אם עובר מת או פגום יומי. סר עובר כאלה למניעת עששת מ מזהם את המים.

6. ניתוח של תוצאות הזרקה

1. עבור זריקה של כתבים ניאון, לפקח עוברים מדי יום בחדר חשוך באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון עם GFP או מסנן RFP (תלוי transgene ניאון). לתבניות אנטומיות שיא של ביטוי גנים עם תמונות דיגיטליות ו / או תיאורים בכתב והכנת סיכומים של מספר הדגים עם הבעה שונהתחומי שיאון (איורים 4 ו -5).
   הערה: יש הקוצנים autofluorescent, תאי פיגמנט stellate הנראים תחת מסנני GFP החל לאחר הפריה 4 ימים (DPF).
   1. כדי ליצור קווים יציבים, שמורים עוברת עם קרינה לזיהוי ולגדול לבגרות כמתוארת ^10.
   2. Outcross מוזרק דגים בוגרים לדגים wild-type באמצעות ההליך הפריה חוץ גופית המתואר בסעיף 2.2 וצאצאים מסך פלואורסצנטי כמתואר בשלב 6.1 לחפש הצאצאים פלורסנט, המציין שידור transgene מוצלח.
   3. כדי להמחיש הקרינה בקעו, הזחלים הם שוחים חופשיים, להוסיף 500 μl 0.8% Tricaine כדי בצלחת פטרי 150 מ"מ לטשטש דגים ולחכות עד להפסיק דגים נעים לתדמית. מייד לשטוף מספר פעמים עם מי קוצן טרי הבאים תצפית והדמיה.
   4. לחלופין, כדי לשמר קרינת הדמיה נוספת, להרדים זחלים0.025% (250 מ"ג / ליטר) Tricaine שנאגרו עם 0.1% סודיום ביקרבונט ולתקן במשך 4 שעות ב paraformaldehyde 4% ב 1x בופר פוספט (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס. אחסן 1x PBS עד שבועיים.
      הערה: עליות אוטומטי קרינת רקע לאורך זמן.
2. אבחון PCR / Genotyping העיכול לזירוז מוטציה עם CRISPRs או TALENs - הביצועים הטובים ביותר ב 2 ימים לאחר ההפריה.
   1. השתמש העברת pipet למקום 10 עוברים מוזרקים (2 DPF, עדיין chorions) לתוך 10 הבארות הראשונות של צינור רצועת 12 גם PCR. הנח דגים מלאי uninjected בשנתי הבארות האחרונות.
   2. סר מי קוצן עודפים.
   3. הוסף 50 חיץ תמוגה μl (10 מ"מ טריס pH 8.3, 50 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl _2, 0.3% Tween-20, ו -0.3% NP-40) זה טוב.
   4. כמוסות מקום על צינורות לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב thermocycler.
      הערה: החלמון יהפוך לבן גומי לאחר שלב הרתיחה.
   5. סר מכסה להשתמש CLE שונהטיפ 1,000 μl pipet מרוכך העובר בצינור אחד.
      הערה: פסולת לבנה תאסוף בתחתית של התחתית.
   6. להוסיף 2.5 μl של 10 מ"ג / K proteinase מ"ל היטב כל אחד.
   7. חלף מכסה לדגור על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לעכל חלבון, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית proteinase ק חנות ב -20 ° C כדי למנוע התפתחות עובש.
   8. בצע PCR באמצעות פולימראז נאמנות גבוהה הבאים הוראות היצרן. השתמש lysate העובר כתבנית DNA.
      הערה: היזהר להסיר נוזלים מלמעלה של צינור עבור תבנית ה- DNA, הימנעות מכל סיסי גלויים או פסולת חלמון בתחתית של התחתית.
   9. מערבבים את המוצר PCR נפח שווה עם תערובת אמן אנזים הגבלה המכיל חיץ 1x אנזים ספציפי 0.25 אנזים μl לדגימה. שמור תמיד מחצית מוצר PCR נימול כדי assay על ג'ל כדי לאשר מוצרי PCR הם בגודל החזה. דגירת PCR מעורבב עם אנזים על התנאים המתאימיםאנזים ההגבלה.
      הערה: אנזימים מסוימים עשויים לדרוש יחס אחר של חיץ אנזים למוצר PCR; להתאים את ריכוז החיץ אם בקרות uninjected לא מראות עיכול שלם.
   10. בעקבות עיכול, מוצרים לרוץ על ג'ל 1% agarose ליד סולם גודל DNA כדי לאשר בגדלי תוצר צפויים.
       הערה: להקות נימולו בעוברים מוזרקים להעיד על הנוכחות של נגעים מולקולריים (איור 6) ובקרות uninjected חייבים להתעכל לחלוטין לפרש תוצאות.
   11. כדי לאשר נגעים, לגזור להקות נימולו מן ג'ל agarose ולטהר DNA עם ערכת ג'ל חילוץ. השתמש רצף סנגר, רצוי להשתמש פריימר רצף פנימי אל פריימרים PCR, כדי לאשר נגעים. ב F ₀ מוזרק עוברים, שילוב של נגעים יהיו נוכחים סביר, גרימת איכות סנגר לקרוא להשפיל סמוך לאתר היעד.
   12. כדי לייצר קו יציב, לשמור את כל העוברים המוזרקים מציפורניים כי המסך חיובי עבור נגעים מולקולריים. Gשורה למעלה דגים, outcross, ולאחר מכן להקרין קבוצת משנה של עבר F ₁ עבור נגעים מולקולריים כמתואר בשלבי 6.2.1 דרך 6.2.11. אם נשאים הטרוזיגוטיים מזוהים, לגדול הנותרים F ₁ עוברים לבגרות ולזהות אנשים הטרוזיגוטיים באמצעות DNA מופק קליפ סנפיר הזנב.

Results

עבור transgenes גן הכתב כי יש פעילות משפרת, זריקה מוצלחת תגרום ביטוי ספציפי, סלולארי של transgene (איור 4 א, ​​4C). דגים מוזרקים לאחר מכן ניתן outcrossed לייצר קווי יציבה (דוגמא קו BAC יציב שמוצג באיור 4B). הזרקת DNA לעוברי קוצן בדרך כלל תוצאות קטלניות גבוהה בהרבה RNA לבד. זה אופייני לראות עד 50% (לפעמים אפילו יותר) קטלני או מום (ראה האיור 4D - F, 4I)

Discussion

חד-תאי הזרקה עוברת קוצן עבור transgenesis או עריכת הגנום מציג שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, ביחס עוברי דג זברה, הסיסי עוברי קוצן קשה ולעתים קרובות ישבור מחטים. בעיה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש micropipettes זכוכית עבה וחזק וההזרקה בניצב הסיסי (ראה פרוטוקול, איור 2). ההבטחה כי מים כמה שפחות מתווסף עובר (רק מספיק כדי לגרום הסיסי להתנפח ולהרים מן התא) עוזר להפחית קשיות סיסית. הסיסי מתקשה לאורך זמן, כך עובדים במהירות לאחר הרטבת העוברים חשוב. שמירה על העוברים בתא ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סטריאומיקרוסקופ עם טרנסתאורה	Leica	S6e/KL300 LED
מיקרומניפולטור ידני	מכשור מדעי יישומי	MM33	Marzhauser M33 מיקרומניפולטור
מערכת אינדקציה בלחץ	מכשור מדעי יישומי	MPPI-3
יחידת לחץ אחורית	מכשור מדעי יישומי	BPU
ערכת מחזיק מיקרופיפטה	מכשור מדעי יישומי	MPIP
מחזיק בסיס מגנטי	מכשור מדעי יישומי	בסיס
מתג רגל	מכשור מדעי יישומי	FSW
צלחת ברזל (בסיס מגנטי)	Narishige	IP
בוער / חום Micropipette	Puller Sutter Instrument	P-97
פיפטות העברה חד פעמיות	פישר	13-711-7M
0.5% פנול אדום ב-DPBS	Sigma	P0290	עוקב הזרקה
#5 מלקחיים, ביולוגי דומוקסל	Fine Science Tools	11252-30	לשבירת מחט
צנצנת אחסון מיקרופיפטה	World Precision Instruments	E210	מחזיקה מחטים
6 אינץ', 6 שיניים לאינץ' מסור קיר גבס גבס	Lenox	20571 (S636RP)	להחזיק ביצים להזרקה
13 ס"מ x 13 ס"מ צלחת זכוכית	כל חנות לחומרי בניין-נימי
זכוכית בורוסיליקט, 1.0 מ"מ OD/0.58 מ"מ ID	World Precision Instruments	1B100-F4	*זכוכית קשה יותר מאשר נימי הזרקת דג זברה
150 x 15 מ"מ צלחת פטרי	פישר	FB0875714	להעלות עוברי סטיקלבק
35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי	פישר	08-757-100A	חנות ביצים לפני הזרקה
מיידית מלח אוקיינוס	מיידי אוקיינוס מיידי	SS15-10
נתרן ביקרבונט	סיגמא	S5761-500G
טריקאין מתאנסולפונאט / MS-222	ווסטרן כימיקל בע"מ	MS222	הרדמת דגים / המתת חסד
ערכת שעתוק Sp6	אמביון	AM1340	לתמלול של TALENs וטרנספוזאז mRNA
RNערכת ניקוי קלה	Qiagen	74104	לטהר טרנספוזאז או TALEN
RNA Qiaערכת ניקוי PCR מהירה	Qiagen	28104	לנקות פלסמידים עבור הזרקת
פרוטאינאז K 20 מ"ג/מ"ל	אמביון	AM2546	להכנת DNA
ערכת נוקלאובונד BAC 100	קלונטק	740579	להכנת BAC DNA
NotI	NEB	R0189L
פולימראז	פישר	F-530L
Qiagen PlasmidPlus ערכת Midi	Qiagen	12943	מכילה מאגר שטיפת אנדוטוקסין
מיצוי ג'ל QIAQuick	Qiagen	28704	לריצוף מוטציות המושרות
פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול	סיגמא	P2069-100 מ"ל
נתרן אצטט	סיגמא	S2889-250G
אתנול (דרגת ביולוגיה מולקולרית)	סיגמא	E7023-500 מ"ל
אגרוז	סיגמא	A9539
50x Tris-אצטט-EDTA מאגר	ThermoFisher	B49
0.5-10 Kb סולם	RNAThermoFisher	15623-200
Nanodrop  ספקטרופוטומטר	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Paraformaldehyde	Sigma	158127-500G
10x	PBS ThermoFisher	70011-044
1 kb Plus DNA סולם	ThermoFisher	10787-018
אשלגן כלורי	סיגמא	P9541-500G
מגנזיום כלוריד	סיגמא	M8266-100G
NP-40	ThermoFisher	28324
Tween 20	Sigma	P1379-500ML
Tris pH 8.3	Teknova	T1083
צינור PCR 12 רצועות	Thermo Scientific	AB-1113