הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

סיכום

פרוטוקול נוכחי זה משתמש במדווחים פלואורסצנטיים, תיוג in vivo וטכניקות הדמיה תוך-חיוניות כדי לאפשר ניטור של התהליך הדינמי של תחול נויטרופילים בבעלי חיים חיים.

תקציר

נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר במחזור דם אנושי מגויסים במהירות לאתרים דלקתיים. לקרקע הוא אירוע קטלני זה משפר את הפונקציונליות phagocytic של נויטרופילים. למרות מחקרים מקיפים חשפו את קיומה וחשיבותה של הטרמה נויטרופילים במהלך זיהום ופגיע, פירושו של ביטוי חזותי תהליך זה in vivo לא היה בהישג ידי. הפרוטוקול ספק מאפשר ניטור של התהליך הדינמי של נויטרופילים יחולו בחיות חיים על ידי שילוב שלוש מתודולוגיות: 1) אות כתב DsRed - משמש כמדד יחול 2) תיוג נויטרופילים vivo - מתקבל על ידי הזרקה של אנטיגן נגד לימפוציטים קרינה מצומדות 6G (Ly6G) נוגדן חד-שבטי (מב) ו -3) הדמיה confocal intravital. שלבים קריטיים כמה מעורבים בפרוטוקול זה: דלקת עור אוזן עכבר נגרם oxazolone, הרגעה מתאימה של חיות, זריקות חוזרות ונשנות של מב אנטי Ly6G, ו קודםention של סחיפה המוקד במהלך ההדמיה. למרות מספר מגבלות נצפו, כגון הגבלת זמן הדמיה הרציפה (~ 8 שעות) ב שמאלי ואת הדליפה של isothiocyanate-dextran והעמסה מכלי דם במדינה הדלקתית, פרוטוקול זה מספק מסגרת יסוד הדמית intravital של התנהגות ותפקוד נויטרופילים דרוכים, אשר ניתן להרחיב בקלות הבדיקה של תאי חיסון אחרים במודלי דלקת עכבר.

מבוא

נויטרופילים הם לויקוציטים בשפע קצרים מועד ביותר במחזור. הם מגויסים במהירות לאתרים של זיהום או פציעה, שבו הם משרתים פגוציטים כפי מקצועיים באמצעות שחרור ביניים חמצן וחנקן תגובתי יחד עם גרגירים המכילים פפטידים מיקרוביאלית פרוטאזות ^1. במהלך גיוסם, נויטרופילים הם "דרוכים" על ידי סוכנים שונים כולל מוצרי חיידקים, chemoattractants, וציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פונקציונלית תָא בַּלעָן משופרת במידה ניכרת עם הגיעם אתר של דלקת ^2. המנגנונים של הטרמה נויטרופילים נחקרו רבות במבחנה ^3,4; עם זאת, ניטור דינמי של התהליך in vivo מצטער לא יכל להסיג עד כה.

לאחרונה, הדמית intravital הפכה טכניקה חשובה הדמיה לכימות הדינמיקה הסלולר של תהליכים ביולוגיים באורגניזמים חיים. Intraviהדמית טל יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ עירור אחד פוטונים קונבנציונליים (למשל, confocal) או מיקרוסקופיה multiphoton מתקרבת ^5. במשך הזמן, שיפורים משמעותיים הושגו טכניקה זו מאפשרת רזולוציית תמונה מוגברת, עומק הדמיה משופרת, ירד נזקי רקמות, ^6,7 ייצוב תמונה משופרת. בהינתן היכולת הייחודית שלה כדי לאפשר הדמיה דינמית של הגירה ואינטראקציה הסלולר לאורך זמן, מיקרוסקופיה intravital יושמה בהרחבה בתחומים מגוונים של מחקר באימונולוגיה ^8. הדמית Intravital מאפשרת אימונולוגים כדי להבין טובים יותר את הקשר התגובה חיסונית ברמה התאית ומולקולרית הם חיים במודלים של בעלי חיים.

התקדמות המהונדסת וכן עקומים בעכברי כתב ספקה כלים שימושיים לניטור ההתנהגויות הדינמיות של נויטרופילים ב בעלי חיים. אמרגן מונחה M ליזוזים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת עקומהעכברים שימשו רחב לאפיין תנועתיות של נויטרופילים, מונוציטים, מקרופאגים במהלך תהליכים דלקתיים שונים כולל extravasation, זיהום חיידקי, ודלקת סטרילית ^9-15. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים המבטא biosensor העברת אנרגיה תהודה הקרינה cytoplasmic הועסק בחקר פעילות קינאז mitogen ו- A קינאז חלבון תאי-מוסדר נויטרופילים במעי מודלק ^16. מודל Murine עם סגוליות גבוהות עבור ביטוי קרינת נויטרופילים הוא עכבר הקטשופ העקום, מייצר recombinase Cre וכן tdTomato חלבון פלואורסצנטי, שבעצמה מצמידה את הביטוי של 6G אנטיגן לימפוציטים (Ly6G) ^17. ויזואליזציה של נויטרופילים Ly6G המחסרים באמצעות מודל זה הוכיחה כי התאים האלה להפעיל פונקציונליות נורמלית במגוון הקשרים דלקתיים סטרילי או זיהומיות in vivo. עכברים טרנסגניים המבטאים את p ניאון DsRedrotein גן בשליטת העכבר interleuikin-1β (IL-1β) אמרגן (pIL1-DsRed) כבר נוצל כדי להמחיש את התנהגויות ניע של תאים מייצרים IL-1β - האמין לכלול נויטרופילים, מונוציטים דלקתיים, מקרופאגים הופעל - המתעורר בעור מודלק ^18.

בשנת vivo תיוג יכול לשמש גישה חלופית לאיתור התנהגויות תאית ומולקולרית של נויטרופילים ברקמות דלקתיות. לאחר הזרקה תוך ורידית של מינונים נמוכים של שכותרתו fluorescently אנטי-GR-1 נוגדן חד-שבטי (מב), מפל גיוס של Gr-1 ⁺ נויטרופילים כבר דמיינו בנגעים בעור העכבר נגוע Staphylococcus aureus ^19. בשנת vivo הממשל של conjugates המכיל streptavidin- מצומדות 705 נקודות קוונטיות ננומטר מב אנטי Ly6G biotinylated תווית במיוחד נויטרופילים במחזור ^20. יתר על כן, אנדוציטוזה של conjugates כזה לתוך neutrophשלפוחית ​​il מאפשר מעקב התחבורה שלפוחית ​​במהירות גבוהה ב נויטרופילים נודדות אל interstitium. בשנת vivo תיוג עם נוגדנים הקרינה מצומדות נגד P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b chemokine ו) (מוטיב CXC) קולטן 2 (CXCR2) במודל של דלקת הנגרמת TNFα יש הבהיר את מנגנוני ויסות בבית לשחק במהלך מוקדם דלקת ^21. נויטרופילים Polarized לבלוט PSGL-1 מועשר uropods לקיים אינטראקציה עם ההווה CD62L על טסיות מופעל, וכתוצאה מכך חלוקה מחדש של CD11b ו CXCR2, קולטנים שמניעים הגירה נויטרופילים וליזום את הדלקת.

IL-1β הוא אחד הגנים החתים כי הוא מוגבה ב נויטרופילים דרוכים ^22. בעכברים הכתב pIL1-DsRed, אותות הקרינה DsRed (כלומר., הפעלה של האמרגן IL-1β) לתאם באופן חיובי עם IL-1β ביטוי mRNA וייצור חלבון IL-1β. ^{18 כדי לפקח על תהליך של הטרמה נויטרופילים, שיטה מיקרוסקופית intravital פותחה מעורבים אינדוקציה של דלקת עור עם oxazolone (שור) במודל העכבר pIL1-DsRed הבאים in vivo תיוג של נויטרופילים עם מב הקרינה מצומדות אנטי Ly6G. Via מודל זה, ניתן ללמוד את ההתנהגות ותפקוד של נויטרופילים דרוכים במודלים של בעלי חיים של מחלות והפרעות שונות.}

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש מאונ' טולדו.

1. phenotyping של עכברים pIL1-DsRed

הערה: Offspring מופקים על ידי גידול עכברים הטרוזיגוטיים pIL1-DsRed עם wild-type (WT) עכברים C57BL6. שלושה עד ארבעה שבוע גורים ישנים נחשבים מוכנים phenotyping. דימום submandibular של עכברים כדלקמן פרוטוקול הוקם עם שינויים קלים ^23.

1. בידוד של תאי דם לבנים מן הדם המלא של גורי עכבר
   1. הוסף 20 μl של הפרין לכל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
   2. רוכש גור אחד מהכלוב. רשום את תג הזיהוי של הגור. אין הוא הכרחי כדי להרדים גורים לפני איסוף הדם מהעורק submandibular.
   3. החזק גור בעורפו צוואר לנקב את וריד submandibular ב הדואר כיס לחי באמצעות אזמל 5 מ"מ. להפעיל כוח מספיק כדי ליצור לנקב קטן, כך טיפות דם להפריש מנקודת החדירה. שימוש במחט חדשה עבור כל גור.
   4. אסוף 3 - 5 טיפות של דם לכל גור בתוך שפופרת microcentrifuge המכיל הפרין. נקה את האתר לנקב ולהפעיל לחץ כדי להקל המוסטאסיס.
   5. שם גור בכלוב חדש ולבחון למשך 30 דקות לפני ההחזרה לכלוב למתקן החיה.
   6. איסוף דם מעכברים בוגרים של פנוטיפ המכונה בקרות חיוביות ושליליות.
   7. הוסף 500 μl של חיץ lysing של כדוריות דם אדומות על צינור אחד, צינורות מערבולת, דגירה במשך 5 - 10 דקות על הקרח.
   8. לאט לאט להוסיף 400 - 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS) מתחת השעיות התא בצינור אחד. ממשק ברור ניתן להבחין בין השעית התא העליונה שכבה ו השכבה התחתונה של FBS.
   9. צינורות שווים דגימות צנטריפוגות ב 1500 גרם × למשך 5 דקות.
   10. חזור על שלבי 1.1.7 - 1.1.9 לפרווהיס להסיר תאי דם אדומים. אל תחזור אם תמוגה מספיק בפעם הראשונה. הגלולה צריכה להיות קשה להבחין לאחר צנטריפוגה.
2. Lipopolysaccharide (LPS) גירוי והתרבות
   1. תאים Resuspend ב 200 μl של מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני 1640.
   2. מעבירים את ההשעיה התא זרימה cytometry צינור.
   3. הפוך LPS הפתרון עובד על ידי ערבוב 10 μl של פתרון המניות LPS (1 מ"ג / מ"ל) עם 990 μl של המדיום RPMI להשלים 1640.
   4. הוסף 20 μl של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS הפתרון עובד 200 μl של השעיה התא.
   5. צינורות שווי רופפים דגירת דגימות במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
3. ניתוח cytometry זרימה
   1. פתח את תוכנית רכישת נתונים עבור cytometry הזרימה. הגדרת תבנית רכישה לפני לדגום רכישה.
   2. לחץ על כלי Dot-מגרש בלוח הכלי. צייר FO פיזור rward (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) העלילה. הגדר את הפרמטרים מתח FSC ו SSC כדי בקנה מידה ליניארי.
   3. בחר את ספי הנמוך ביותר של FSC ו SSC הדבר נתמך על ידי cytometer. החל ספי 200 ו -50 עבור FSC ו SSC, בהתאמה.
   4. בתוך FSC לעומת העלילה SSC, לצייר G1 השער הכולל מונוציטים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטיים, ולא כולל פסולת, תאי דם אדומים לימפוציטים.
   5. לחץ על הכלי היסטוגרמה בפלטת הכלי. צייר היסטוגרמה FL2 (ערוץ הקרינה אדום). השתמש מדגם ביקורת שלילי להגדיר את הבסיס של אותות FL2 ומדגם בקרה חיובי לצייר שער כולל את כל אירועי DsRed החיוביים.
   6. בלוח הבקרה fluidics של cytometer, להגדיר את מצב הנוזלים כדי "להפעיל" ואת קצב הזרימה "HI" (כ 60 μl / min). רוכשת 10,000 אירועים עבור כל דגימה.
   7. לקבוע פנוטיפ גור על ידי מדידת אחוז התאים חיוביים DsRed משער G1.

class = "jove_title"> 2. אינדוקציה של דלקת עור של עכברים pIL1-DsRed

1. להרדים העכבר על ידי הזרקה (IP) הזרקה של קוקטייל הרדמה המכיל 100 מ"ג / ק"ג קטמין, 10 מ"ג / xylazine ק"ג, ו 1 מ"ג / ק"ג acepromazine. עכברים הרדימו כראוי לא מראים אחורית נסיגה כפה קמצוץ בוהן.
2. החל קרם להסרת שיער על פני השטח הגבי של שתי האוזניים של העכבר. מתן 30 שניות עד 1 דקות. נגב פני אוזן עם צמר גפן במים רטוב ולאפשר אוויר יבש.
3. מדוד את עובי האוזן באמצעות מיקרומטר ולהחליף עכבר בכלוב נפרד. שימו לב עד ההתאוששות מן ההרדמה (~ 15 - 30 דקות). כדי לפתור דלקת עור הנגרמת על ידי מוצר הסרת השיער, לאפשר עכבר כדי לנוח במשך 3 ימים לפני ניסויים נוספים מתבצעים.
4. הכן 1.25% (w / v) OX ידי המסת 16.7 מ"ג של OX ב 1 מ"ל אצטון ערבוב 750 μl של פתרון OX / אצטון עם 250 μl של שמן זית. כן פתרון רכב על ידי ערבוב 750 μl של אצטון עם 250 &# 181; l של שמן זית.
5. Re-להרדים עכבר באמצעות זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1). מדוד את עובי האוזן כמו קודם.
6. החל 12.5 μl של OX 1.25% על כל צד של האוזן הימנית. החל 12.5 μl של פתרון הרכב שמן אצטון / זית על כל צד של האוזן השמאלית.
7. שמור עכבר להיפרד-חבריהם לכלוב עד התאושש לחלוטין כדי למנוע עלבון אוזניו ידי עכברים אחרים, ואז להחליף את העכבר בכלוב המקורי ולחזור מתקן דיור בעלי חיים.
   הערה: הסרת השיער עלולה לגרום דלקת עור קלה הבאה על ידי שינוי של עובי אוזן. דלקת קטין זה תיפתר לאחר-מכן 3 ימים אושר על ידי עובי אוזן נורמלי. לאחר יישום מקומי למשך 24 שעות, אוזניים שטופלו OX להראות משמעותי (p <0.01) נפיחות פתרון הרכב לעומת האוזניים לבד שטופלו.

3. תיוג של נויטרופילים עכברים pIL1-DsRed

הערה: תיוג vivo של נויטרופילים ידי f במינון נמוךluorescence מצומדות מב ספציפי נויטרופילים כדלקמן פרוטוקול שפותח לאחרונה ^19. זריקות רטרו-מסלולית מבוצעות על פי פרוטוקול הוקם עם כמה שינויים ^24.

1. הכן פתרון עובד מב אנטי Ly6G ידי דילול 10 μl של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​Alexa פלואוריד 647 מצומדות אנטי Ly6G מב (שיבוט 1A8) ב 90 μl של בופר פוספט (PBS).
2. העברת 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מב (50 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך מזרק אינסולין U-100 עם 28 מחט מד.
3. להרדים עכבר מבוגר pIL1-DsRed על ידי זריקה ip של קוקטייל הרדמה שתואר לעיל (2.1). מניחים את הבטן העכבר הרדים למטה על לוח עבודה נקייה.
4. החל לחץ כלפי מטה עדין על גב עור גחון בעין אחת עכבר כדי לבלוט את גלגל העין באופן חלקי מהשקע.
5. בזהירות במקום מחט, שפוע למטה, בזווית של כ -30 מעלות על canthus המדיאלי לתוך רטרו מסלוליתסִינוּס.
   הערה: מפעיל הרשת הסלולרית יכול להרגיש את הלחץ, חדירה והתנגדות הקלה פעם מחדיר מחט לתוך הסינוס.
6. לאט חלקה להזריק 100 μl של מב אנטי Ly6G פתרון עובדים (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) לתוך העכבר. הסר את המחט במהירות. כמות קטנה של דימום מצביעה על זריקה מוצלחת.
7. מייד להחיל 1.25% OX פתרון רכב על ימין ועל אוזני עכבר שמאליות.
8. לאחר 8 שעות, לנהל 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מוכן טרי מב (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית לאותו עכבר.
9. כדי להמחיש את כלי הדם, מיד לפני הדמיה, לנהל 100 μl של 30 מ"ג / מ"ל ​​והעמסת isothiocyanate (FITC) מצומדות dextran (150 KDA) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית.

4. הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים PIL-1-DsRed עכברים

1. להרדים עכבר עם זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1).0; החל משחת וטרינרים לעיני עכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה של הדמיה.
   1. כן 1 מיליליטר חצי מנת קוקטייל הרדמה על ידי דילול 500 μl של קוקטייל הרדמה מקורי עם נפח שווה של PBS.
   2. העבר חצי מנה קוקטייל ההרדמה כדי מזרק 1 מ"ל עם מחט מד פרפר 27.
   3. הכנס מחט של פרפר לתוך בטן עכבר intraperitoneally ולתקן את כנף הפרפר אל הבטן על ידי מקליטה.
2. מניחים coverslip זכוכית במרכז הבמה הדמיה. קלטת את הקצוות של coverslip כדי להחזיקו במקום.
3. מניחים ירידה של PBS על פני השטח הגחון של האוזן העכבר כמו גם על coverslip.
4. עמדה הרדימה עכבר עם האוזן שלה על coverslip. הר קצה האוזן, צד הגב למטה, על ידי הרבדה לאוזן בין coverslip ו זכוכית שקופית, גם מוחזק במקום באמצעות קלטת.
5. הפעל מיקרוסקופ confocal קרינה רב-ליזר וכל הדואר הקשורquipment. לכבות את האורות בחדר כדי למזער את החשיפה אור הסביבה.
6. פתח את תוכנת רכישת התמונה. בחר את ערוצי ליזר לגילוי של צבעי ניאון בתפריט הרשימה דיי.
7. התאם את המיקוד על עור האוזן הדלקתי על ידי תצפית של אותות ירוקים מכלי דם האותות אדומים מתאי DsRed ⁺ דרך עיני.
8. בצע סריקה מהירה עם מהירות סריקה של 2 מיקרו-שניות / פיקסלים ורזולוציה של 512 × 512 פיקסלים. בחר pseudocolor לכל ערוץ בתפריט התצוגה החי. התאם את הידית להתמקד להגדיר סוף ולהתחיל מיקום של סריקה.
9. לבצע סריקות איטיות עם מהירות סריקה של 4 - 8 μsec / פיקסלים ורזולוציה של 800 × 800 או 1,024 × 1,024 פיקסלים. התאם את המתח הגבוה, לזכות, וכן לקזז על כל ערוץ פרט למקסם את עוצמת האותות תוך הימנעות רוויה (פיקסלים אדומים). לא צריך להיות רק כמה פיקסלים אדומים בכל ערוץ.
10. יצירת קבוצות תמונה תלת-ממדיות על ידי סריקת הדואר העור האוזן מתחיל באופן שטחי את השכבה הקרנית ועל התקדמותם כלפי מטה עם x, y, כרכים z של 317 מיקרומטר × 317 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X), 635 מיקרומטר × 635 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 20X), או 1,270 מיקרומטר × 1,270 מיקרומטר × 50 מיקרומטר (אובייקטיבי 10X) בשעה 2 מיקרומטר Z- צעדים.
    הערה: השכבה הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של האפידרמיס ולהיות יכולה מקומי מבוססת בקלות על אות autofluorescence החזקה שלה.
11. בניסויים הדמיה זמן לשגות, שיא תלת ממדי תמונות כל 2 דקות או 4 עד 8 שעות.
12. לסירוגין, כמו העכבר מתחיל להתאושש מההרדמה, ציין מבוסס על תצפיות של שפם מתעוות, לנהל 5 - 10 μl של קוקטייל הרדמה חצי מנה דרך מחט פרפר.
    הערה: היי זהירה של מינון ההרדמה - מנת יתר עלול לגרום למות עכבר. לחלופין, הרדמת משאיפת בצנצנת יכולה להיות מיושמת על העכבר עבור הרדמה לטווח קצר לביןחרטומו יוכל לשמש עבור הדמיה לטווח ארוך.
13. הסר את העכבר הרדים מהבמה כאשר ההדמיה תושלם. ניתוק הקלטת ולהסיר מחט פרפר מן בטן העכבר. החזר את העכבר בכלוב נפרד במתקן דיור בעלי חיים.
    הערה: עבור הדמיה לטווח קצר (<1 שעה), עכברים להחלים לחלוטין מן ההרדמה במהירות 1 - 3 שעות. עבור הדמיה לטווח ארוכה (~ 8 שעות), עכברים להתאושש לאט, עם תקופת החלמה טיפוסית של 12 - 16 שעות. לפיכך, ממשל מים אוראלי מומלץ לפחות מספר פעמים במהלך תקופת ההחלמה על מנת למנוע התייבשות חמורה.
14. מערכי נתוני הדמית תהליך, לעקוב אחר תאים בודדים, ליצור נתיבי נדידה, ולחשב את הכיווניות ומהירויות של נדידת תאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ב ^-25.

תוצאות

הקרנת עכברי pIL1-DsRed מתבצעת על פי איתות קרינת DsRed פנוטיפי המיוצרת על ידי לויקוציטים הדם ההיקפיים שלהם באמצעות cytometry זרימה. גירוי LPS ידוע לגרום ייצור IL-1β בתאים מיאלואידית כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאים דנדריטיים ^26-28. לפיכך, לויקוציטים מבודד מודגרת עם LPS עבור 4 שעות לפני ניתוח תזרים cytometry. לאחר מכן, gating מוגדר במחזור התאים מיאלואידית על בסיס גודל תא (FSC) ומורכב פנימיים (SSC) (איור 1 א) ^29,

דיון

מטרת מחקר זה היא לפתח טכנולוגיה לניטור התהליך יחול נויטרופילים בעלי חי חיים, אשר טרם התקיימו על ידי הטכניקות זמינות כרגע. כדי להשיג מטרה זו, שלוש מתודולוגיות הוקמה מבוצעת: 1) אינדוקציה של דלקת עור IL-1β עכברי כתב DsRed מונחה אמרגן כאמצעי של הטרמה, 2) in vivo תיוג של נויטרופילים עם מינונים נמוכים של מצומדות-קרינה אנטי Ly6G מב, ו -3) הדמיה מיקרוסקופית confocal intravital. השילוב של שלוש שיטות אלה מאפשר הדמיה של פעילויות הניע של נויטרופילים דרוכים (DsRed ⁺ / Ly6G ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Heparin נתרן	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK מאגר ליסינג	Lonza	10-548E
סרום בקר עוברי	Sigma-Aldrich	F0926
ליפופוליסכרידים	Sigma-Aldrich	L4391
קטמין הידרוכלוריד	Hospira	NDC 0409-2051-05
קסילזין	מעבדת לויד	NADA #139-236
אצפרומזין	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
קרם להסרת שיער	Church & דווייט
אצטון	פישר מדעי	A16P4
אוקסזולון	סיגמא-אולדריץ'	E0753
Alexa Fluor 647 נוגדן נגד עכבר Ly6G BioLegend		127610
U-100 מזרק אינסולין עם מחט 28 גרם	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	סיגמא-אולדריץ'	74817
סט עירוי פרפר (מחט 27 גרם)	BD	387312
FACSציטומטר קליבור	BD
CellQuest Pro תוכנה	BD
מיקרוסקופ קונפוקלי	אולימפוס	FV1000
Metamorph תוכנה	הדמיה

אוניברסלית