מאמר שיטה

הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

DOI:

10.3791/54072

⸱

16 באוקטובר 2016

 ,  ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, Republic of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, Republic of Korea, 3College of Medicine, The Catholic University of Korea, Republic of Korea

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים נגרם אדם מן synoviocytes חולה נגזרת כמו-פיברובלסטים, באמצעות מערכת lentiviral ללא תאים מזינים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי סומטיים בוגרים יכולים להיות הפוכים לתוך גזע פלוריפוטנטיים דמוי תא מדינה באמצעות סט של גורמי תכנות מחדש מוגדר. מחקרים רבים יצרו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) סוגי תאים שונים סומטיים ידי transducing ארבעה גורמי שעתוק יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc. המחקר של iPSCs נשאר בחוד החנית של מחקר ביולוגי וקליני. בפרט, iPSCs המטופל ספציפי יכול לשמש ככלי חלוצים למחקרי של pathobiology מחלה, מאז iPSCs יכול להיגרם מן הרקמה של כל אדם. דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית, אשר סווגו על ידי הרס הסחוס ומבנה העצם במפרק. היפרפלזיה הסינוביאלי הוא אחד הסיבות העיקריות או סימפטומים שיובילו לתוצאות אלה ב- RA. Synoviocytes פיברובלסטים דמויי (FLSs) הם התאים המרכיבים העיקריים הסינוביום hyperplastic. FLSs במפרק להתרבות ללא הגבלה, בסופו של דבר פולש cartil סמוךגיל ועצמות. נכון לעכשיו, synovium hyperplastic ניתן להסיר רק על ידי הליך כירורגי. הסינוביום שהוסר משמש למחקר RA כחומר המשקף את המצב הדלקתי של המפרק. כשחקן מרכזי בפתוגנזה של RA, FLSs יכול לשמש כחומר ליצור ולחקור את iPSCs של חולי RA. במחקר זה, השתמשנו FLSs של חולה RA כדי ליצור iPSCs. באמצעות מערכת lentiviral, גילינו כי FLSs יכול ליצור iPSC המטופל הספציפי RA. IPSCs המופק FLSs ניתן להשתמש כדי להמשיך ככלי ללמוד בפתופיזיולוגיה של RA בעתיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים הם הפלטפורמה של הדור הבא בתחומים קליניים וביולוגיים שונים. הם כולים מבטיחים כי ניתן להשתמש ב דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפול רפואי רגנרטיבית. אדם תאי גזע עוברי (hESCs) שמשו בעיקר כדי ללמוד ולהבין תאים פלוריפוטנטיים. עם זאת, מבודד על ידי הרס של הבלסטוציסט האנושי, hESCs המשויכים מספר שיקולים אתיים. בשנת 2007, ד"ר שיניה יאמאנאקה וצוות הפכו את תהליך תכנות תא ופתחו תאי גזע תאי סומטיים אדם בוגרי 1,2. לכן, בניגוד hESCs, נגרמת pluripotent בתאי גזע (iPSCs) ניתן להפיק מן התאים הסומטיים בוגרים, הימנעות המכשולים המוסריים.

בדרך כלל, iPSCs ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: זה פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC12TISI0861).

1. בידוד Synoviocyte ורחב

  1. בידוד Synoviocyte
    1. לעקר שני זוגות מספריים כירורגיות וזוג אחד של מלקחיים.
    2. העברת רקמה סינוביאלי לצלחת 100 מ"מ ולשטוף עם 5 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצור iPSCs מ FLSs באמצעות מערכת lentiviral. איור 1 א מציג תוכנית פשוטה של פרוטוקול בידוד FLS. בעקבות הסרה כירורגית של synovium, הרקמה היה קצוץ לחתיכות קטנות באמצעות מספריים כירורגיות. Collagenase התווסף לבודד את התאים מן הגושים של רקמות. תאי הודגרו במשך 14 ימים לפני עיבוד נוסף. 1B האיור מראה את המורפולוגיה של FLSs המבודד. תאים נשמרו למשך 3 קטעים לפני השימוש. FLSs לשתף.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפני גילוי iPSCs, מדענים משמשים בעיקר ESCs ללמוד ביולוגית גזע תא שושלות תאים אחרות באמצעות בידול. עם זאת, ESCs מקורן המסה הפנימית של הבלסטוציסט, המהווה העובר בשלב מוקדם. כדי לבודד ESCs, הרס של הבלסטוציסט הוא בלתי נמנע, העלאת סוגיות אתיות כי ניתן להתגבר. יתר על כן, למרות שיש ESCs מאפייני stemness ו pluripotency, הם לא יכולים לקבל מיחידים הם לפעמים לא כלי אידיאלי לניתוח אישי והקרנת מחלה.

בשנת 2007, טקהאשי et al.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הממומנת על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בקוריאה (HI13D2188).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 100 מ"מTPP93100
צלחת 6 בארותTPP92006
50 מ"ל צינור קורניקלSPL50050
15 מ"ל צינור קורניקלSPL50015
10 מ"ל פיפטה חד פעמיתפלקון7551
5 מ"ל פיפטה חד פעמיתפלקון7543
צלחת 12 בארותTPP92012
<חזק>FLS חומרי בידוד
מספריים
מלקחיים
DPBSLife Technologies14190-144
DMEMLife Technologies11995-073
פניצילין סטרפטומיציןSigma AldrichP4333
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologies16000-044
קולגנאזסיגמא אולדריץ'C6885-100MG
פרפילםסיגמא אולדריץ'54956
PBS/1 מ"מ EDTALife Technologies12604-039
<חזק>iPSC דור חומרים
DMEMLife Technologies11885
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)Life Technologies11140-050
β-מרקפטואתנולסיגמא אולדריץ'M3148
פוליברןכימיקוןTR-1003-G
פניצילין סטרפטומיציןלייף טכנולוגיותP4333
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologies16000-044
DPBSLife Technologies14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057רכיב מדיה iPSC (500 מ"ל)
נתרן ביקרבונטLife Technologies25080-094רכיב מדיה iPSC (Conc.: 543 μ גרם/מ"ל)
נתרן סלניטסיגמא אולדריץ'S5261iPSC מרכיב  (קונקציונלי: 14 ננוגרם/מ"ל)
רכיב מדיה אנושי TransfferinSigma AldrichT3705iPSC (Conc.: 10.7 μ גרם/מ"ל)
רכיב מדיה בסיסי FGF2Peprotech100-18BiPSC  (קונקטיבי: 100 ננוגרם/מ"ל)
Human InsulinLife Technologies12585-014מרכיב מדיה iPSC (Conc.: 20 μ גרם/מ"ל)
TGF ובטא אנושיים; 1רכיב מדיה Peprotech100-21iPSC (כולל: 2 ננוגרם/מ"ל)
חומצה אסקורביתSigma AldrichA8960רכיב מדיה iPSC  (Conc.: 64 μ גרם/מ"ל)
PolybreneChemiconTR-1003
נתרן בוטיראטסיגמא אולדריץ'B5887
VitronectinLife TechnologiesA14700
מעכב ROCKסיגמא אולדריץ'Y0503
<חזק>חומרי בקרת גואליות
18 מ"מ כיסוי זכוכיתמעולהHSU-0111580
4% פרפורמלדיהיד (PFA)טכנולוגיה & חדשנותBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
אלבומין סרום בקר (BSA)Vector LabSP-5050
Anti-SSEA4 נוגדןMilliporeMAB4304
נוגדן Anti-Oct4 SantaCruzSC9081
Anti-TRA-1-60 נוגדןMilliporeMAB4360
נוגדן Anti-Sox2Biolegend630801
Anti-TRA-1-81 נוגדןMilliporeMAB4381
נוגדן Anti-Klf4Abcamab151733
Alexa Fluor 488 נוגדן עז נגד עכבר IgG (H+L) בדיקהמולקולריתA11029
Alexa Fluor 594 נוגדן עז נגד ארנב IgG (H+L)בדיקה מולקולריתA11037
DAPIבדיקה מולקולריתD1306
Prolong זהב נוגד דהייה מגיבInvitrogenP36934
זכוכית שקופיות, מצופהHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
כלורופורםסיגמא אולדריץ'366919
איזופריפיל אלכוהולMillipore109634
אתנולדוקסן64-17-5
RevertAid ערכת סינתזה cDNA גדיל ראשוןThermo ScientficK1622
i-Taq DNA פולימראזiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
טוען כוכבDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) סמן סולם DNAEnzynomicsDM003
אלקליין פוספטאזMilliporeSCR004
כירורגייםכירורגיים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים