מאמר שיטה

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

10.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54096

⸱

19 ביוני 2016

 ,  ,  , 
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

במאמר זה

סיכום

מולקולות הנחיית אקסון מווסתות את הנדידה העצבית וניווט ממוקד של חרוט גדילה. אנו מציגים שיטה רבת עוצמה, מבחן הפסים, להערכת יכולתן של מולקולות הנחיה למשוך או לדחות נוירונים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את בדיקת הפסים על ידי הצגת יכולתו של FLRT2 להדוף נוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים.

תקציר

אקסונים גדלים מפתחים מבנה תנועתי מאוד בקצותיהם, הנקרא חרוט הגדילה. חרוט הגדילה יוצר קשר עם רמזים סביבתיים חוץ-תאיים כדי לנווט בצמיחה אקסונלית. Netrin, slit, semaphorin ו-ephrins הן מולקולות הנחיה ידועות שיכולות למשוך או לדחות אקסונים בעת קשירה לקולטנים וקולטנים משותפים על האקסון. הקולטנים המופעלים יוזמים מולקולות איתות שונות בחרוט הגידול שמשנות את המבנה והתנועה של הנוירון. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט לבדיקת פסים כדי להעריך את יכולתה של מולקולת הנחיה למשוך או לדחות נוירונים. בשיטה זו, נוירונים היפוקמפיים מנותקים מעכברי E15.5 מתורבתים על כלים מצופים למינין המעובדים עם פסים מתחלפים של אקטודומיין של פיברונקטין וחלבון טרנסממברני עשיר בלאוצין-2 (FLRT2) ובקרת חלבון אזור גבישי (IgG) של אימונוגלובולין G (IgG). גם האקסונים וגם גופי התאים נהדפו חזק מאזורי הפסים המצופים FLRT2 לאחר 24 שעות של תרבית. צביעה חיסונית עם tau1 הראתה ש~90% מהנוירונים היו מפוזרים על הפסים המצופים ב-Fc בהשוואה לפסים המצופים FLRT2-FC (~10%). תוצאה זו מצביעה על כך של-FLRT2 יש השפעה דוחה חזקה על תאי עצב אלה. שיטה רבת עוצמה זו ישימה לא רק עבור נוירונים מתורבתים ראשוניים אלא גם עבור מגוון תאים אחרים, כגון נוירובלסטים.

מבוא

הדרכת האקסון היא התהליך שבו הנוירונים שהוקם זה עתה לשלוח אקסונים אל היעד שלהם במהלך פיתוח של 1,2 מערכת העצבים. אקסונים פיתוח לשאת מבנה ניע מאוד בקצהו שלהם שנקרא חרוט צמיחה. חרוט הצמיחה החושים רמזים תאיים לנתב את הדרך של האקסון. מולקולות הנחיה, כגון חתך, semaphorin, ו ephrins, יכולים למשוך או לדחות אקסונים תלוי האינטראקציה שלהם עם קולטנים מתאימים-קולטנים שיתוף על האקסון 1,3,4. הקולטנים מופעלים להעביר אותות אל חרוט הצמיחה המשפיעים ארגון cytoskeletal שלה לתנועות האקסון וצמיחה חרוטה.

שיטות שונות פותחו כדי להעריך את הפעולה של מולקולות attractant ודוחה. חמו-משיכה ודוחים יכול להינתן לתוך מדיום הגידול / תרבות עם ריכוז שיפוע (למשל., קאמרית או μ-מגלשות דאן) 5,6, במקום מרוכז מאוד על ידי מיקרו-p ipette (למשל., assay מפנה) 7 או בריכוז הומוגנית ידי יישום אמבטיה (למשל., assay קריסת צמיחה חרוט) 8,9.

שיטות אחרות כוללות assay פס או הדפסת microcontact (μCP), שבו attractant הכימותרפיה או דוחה מצופה על פני השטח של צלחת כמו מצע 10-12. Thestripe assay פותחה במקור על ידי בונהופר ועמיתיו בשנת 1987 לנתח מיפוי טופוגרפי במערכת retino-tectal חומוס 13. השיטה המקורית נדרש שואב אבק לחלבונים מעיל על ממברנות פוליקרבונט nucleopore באמצעות פסים ומטריצות מרושת. בגירסאות מתקדמות יותר, חלבונים רקומביננטיים הודפסו ישירות על פני השטח של צלחת תרבות בדפוס פסים באמצעות 14,15 מטריצות סיליקון פתח צר. לאחרונה, קבוצות מחקר שונות יישמו בהצלחה assay פס זה ניתוח של פעילות מולקולה הדרכה האקסון 16-21.

ss = "jove_content"> כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור assay פס המודד את למשיכה או לדחיה של מולקולות האקסון הדרכה עבור נוירונים בהיפוקמפוס ניתק. יש לציין, שיטה זו יכולה להיות מיושמת במסגרות מעבדה מצוידות מינימאלי. עבור assay זה, פסים מתחלפים של מצע שכותרתו fluorescently ו חלבון בקרה מופקים על צלחת פלסטיק באמצעות מטריצת סיליקון עם חריצי 90 מיקרומטר ומצופי laminin. בהפגנה שלנו, ניתק נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים E15.5 היו בתרבית על לסירוגין פסים של ectodomain רקומביננטי של פיברונקטין ו לאוצין עשיר הטרנסממברני חלבון-2 (FLRT2) ולשלוט Fc חלבון 21. לאחר 24 שעות של תרבות, הן אקסונים גופי התא של הנוירונים נהדפו מאוד מן פסים FLRT2. צביעה עם נוגדן אנטי Tau1 גילה כי כ -90% של נוירונים חולקו על אזורים מצופה Fc, לעומת כ -10% על FLRT2-FC, המציין כי FLRT2 יש חזקה דוחהפונקציה עבור נוירונים בהיפוקמפוס 21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש בבית הספר אוניברסיטת Hamamatsu לרפואה.

1. הכנת מטריצות

  1. מרתיחים 4-8 מטריצות סיליקון במיקרוגל או על פלטה חשמלית במשך 5 דקות ולאפשר להם להתייבש לחלוטין עבור h 1 תחת זרימה למינרית (צד פסים למעלה).
    הערה: ההליכים הבאים יש לבצע תחת זרימה למינרית.
  2. לפוצץ אוויר דחוס או להשתמש סרט דביק שקוף כדי להסיר כל אבק מצד הפסים של המטריצות. שמור את צד הפסים נקיים אז זה בתקיפות יכול לדבוק פני הצלחת.
  3. בזהירות את מטריצות על צלחות פלסטיק 6 ס"מ על ידי לחיצה באצבע (מטריצה ​​אחד לכל צלחת; פס בצד למטה). להימנע מקבלת בועות אוויר בין מטריקס ואת המנה. סמן את מיקומו של הפסים בצד התחתון של מנת התרבות.
  4. אם המטריצה ​​נכשלה לצרף, וחזור משלב 1.2.

דור Stripe 2. Laminin ציפוי לתרבות Neuron

  1. הכן שכותרתו fluorescently חלבון רקומביננטי (25 μl כל להזרקה [שלב 2.2] או 100 μl כל לשיטת מיקום [צעד 2.2.1]) על ידי ערבוב של חלבון Fc-tagged (10-50 מיקרוגרם / מ"ל) ו dye- ניאון אנטי אנושי מצומדות נוגדנים Fc (1 עד 3 יחס: 30-150 מיקרוגרם / מ"ל) ב בופר פוספט (PBS). ואז, דגירה את התערובת למשך 30 דקות ב RT.
  2. באמצעות מזרק 22-G, להזריק 25 μl של חלבון רקומביננטי מוכן בשלב הקודם (2.1) דרך חור קטן בצד של מטריקס (חיצים באיור 1A, 1C, ו 1E).
    1. לחלופין, במקום 100 μl של חלבון רקומביננטי לתוך החריץ העליון של מטריקס לשאוב כמחצית הפתרון מהחור הקטן (חיצים באיור 1A, 1C, ו 1E), כך חלבון רקומביננטי נשאר באזורי הפסים.
  3. דגירת הצלחת עבור 30 מיליםn ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים.
  4. מניח 300 μl של PBS לתוך החריץ העליון (איור 1 ב ') ואת לשאוב מהחור הקטן הממוקם בצד של מטריקס (חיצים באיור 1A, C ו- E) כדי להסיר חלבונים רקומביננטיים פנויים. אין לשאוב את PBS לחלוטין, משום שהחלבונים יתייבשו. חזור על פעולה זו פעמיים. (3 פעמים בסך הכל)
  5. מוציאים בזהירות את מטריקס ומיד למקם ~ 100 μl של חלבון בקרה (10-50 מיקרוגרם / מ"ל; Fc) כדי לכסות את האזור כולו פסים, יצירת ציפוי חלופי. לאחר מכן, דגירת הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים.
  6. לאחר שטיפת משטח צלחת שלוש פעמים עם PBS, לצפות אותו ~ 100 μl של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​laminin ב PBS.
    הערה: Laminin צריך להיות מופשר על הקרח כדי למנוע התמצקות.
  7. דגירת הצלחת של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים.
  8. שטפו את פני השטח צלחת שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף Medi תרבותאממ. מניח את הצלחת המצופית עם מדיום תרבות חממה 5% CO 2 ב 37 ° C עד שימוש.

3. נוירונים בהיפוקמפוס Culturing מ E15.5 עכבר עוברים

  1. להרדים אמא באמצעות נקע בצוואר הרחם ולבודד שלושה E15.5 עוברים.
  2. חותכים את עור הגולגולת sagittally על קו האמצע של הראש עם מספריים, ולהסיר את המוח בעזרת כף קטנה. מעביר את המוח בזהירות לצלחת 60 מ"מ פטרי המכילה 3 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS).
  3. באמצעות אזמל, לחתוך את ההמיספרות כולל קליפה, ההיפוקמפוס בסטריאטום (איור 2 א). לאחר מכן, לנתח את אזור בהיפוקמפוס על ידי הסרת קרומי המוח בזהירות, ולהעביר את רקמות בהיפוקמפוס גזור לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של תמיסת HBSS, על הקרח (איור 2 ב-ג). אסוף 6 hippocampi מן 3 עוברים בצינור, אשר מספיקים culturing נוירונים 8 מנות.
  4. החזר את Hפתרון BSS עם פתרון טריפסין / EDTA (2 מ"ל) ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמבט מים.
    הערה: לשאוב HBSS ללא צנטריפוגה ואינו למזוג פתרון HBSS על ידי הטיית הצינור.
  5. לנטרל את פעילות טריפסין על ידי הוספת 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS).
  6. צנטריפוגה את התערובת על 100 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 2 מ"ל של מדיום תרבות. חזור על פעולה זו פעם נוספת.
  7. Pipet hippocampi למעלה ולמטה 10 פעמים במדיום תרבות באמצעות קצה 1,000 μl עם חור גדול (לחתוך קצה) כדי לנתק את הרקמה.
  8. שנה עד קצה 1,000 μl רגיל (נימול) ו pipet למעלה רקמות הניתקות ולמטה כדי לקבל השעית תא בודד.
  9. הפרד את התא הבודד על ידי העברת אותם באמצעות מסננת תא רשת 80-100 מיקרומטר.
  10. צנטריפוגה השעית התא הבודדה המסוננת ב XG 150 במשך 5 דקות.
  11. הסר את supernatant על ידי aspirating, ו resuspend פלet (נוירונים) ב 2 מ"ל של מדיום תרבות.
  12. ספירת התאים באמצעות hemocytometer עם מכתים trypan הכחול כדי לקבוע את הצפיפות ואת הכדאיות. לאחר מכן, צלחת 10,000 נוירונים 150 μl של מדיום התרבות עבור כל קבוצה של השעית stripes.The צריכה להיות ממוקמות היטב על מנת לטייח באזור הפס כולו.

ויזואליזציה 4. Cell גופות אקסונים ידי Immunofluorescence מכתים באמצעות נוגדן אנטי Tau1

  1. לאחר 24 שעות של תרבות, לשאוב את המדיום מבלי להפריע את התאים החסידים, ולתקן את הנוירונים עם paraformaldehyde מחומם מראש 4% (PFA) / 4% סוכרוז / PBS ב RT במשך 15 דקות.
  2. שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. אם תרצה, להשתמש בעט מים ודוחה לצייר עיגול סביב אזור הפסים כדי להקטין את כמות הנוגדנים הצורכות.
  3. Permeabilize הנוירונים עם 0.3% Triton X-100 / PBS במשך 5 דקות.
  4. דגירה הנוירונים עם פתרון חסימה המכיל סרום 3% חמורים 0.1% Triton X-100 טובים30 דקות ואחריו הדגירה עם נוגדן אנטי Tau1 (1: 200) בסרום חמור 1% / 0.1% Triton X-100 / PBS O / N ב 4 ° C.
  5. שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. דגירה הנוירונים עם נוגדן fluorophore מצומדות אנטי עכבר IgG ב אלבומין 1% שור (BSA) /0.1% טריטון X-100 / PBS למשך 30 דקות.
  6. שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. מכסה את אזור פסים עם מכסה זכוכית 18 מ"מ x 18 מ"מ באמצעות 50 μl של antifade פתרון. למנוע בועות אוויר, אשר להפריע הדמיה.
  7. להשיג תמונות ניאון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המערכת המתאימה, למשל, עדשה אובייקטיבית x10, מערכות סינון עבור GFP ו RFP, וזמן חשיפה של 1,000 מילים-שניות (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נוירונים בהיפוקמפוס ניתקו מעכברי E15.5 היו מצופים ותרבותי במשך 24 שעות על פסים של שכותרתו fluorescently Fc ביקורת (איור 3A-C) או FLRT2-FC (איור 3D-F) לסירוגין עם Fc שליטה הלא מסומן. בשני המקרים, הנוירונים היו מצטברים והאריכו האקסונים שלהם כמו צרורות. בשלט Fc / פסים Fc, הנוירונים חולקו באופן שווה על שכותרתו fluorescently ופסים אי שכותרתו ושם האריכו האקסונים שלהם בכיוונים אקראיים (איור 3A-C). לעומת ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר assay פס המשתמשת חלבון רקומביננטי נוירונים ניתק מן ההיפוקמפוס עכבר E15.5. assay זה מאפשר תצפית היעילה של תגובות דוחות, אטרקטיביות, או ניטראליות של נוירונים לחלבון רקומביננטי של עניין להציב דפוס פסים. יתרון עיקרי של פרוטוקול זה הוא השיטה הפשוטה ליצירת הפסים, שבו החלבון מודפס ישירות על גבי המשטח של צלחת פלסטיק, לעומת השיטה המסורתית, המחייב מטריצות מיוחדות, מערכת שאיבה, וקרומי nucleopore 20 , 21. כדי להפוך את פסי החלבון, חלבון רקומביננטי שכותרתו ניתן להזרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Grants-in-Aid for Scientific Research מהאגודה היפנית לקידום המדע (23700412, 25122707 ו-26670090 ל-S.Y.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור צנטריפוגה 15 מ"לViolamo 1-3500-01
4% פרפורמלדהיד (PFA)נקלאי01954-85
Alexa Fluor 488 נוגדן IgG אנטי אנושי עיזיםThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 חמור נגד עכבר נוגדן IgGThermo ScientificA-21203דילול 1/500
נוגדן Anti-Tau1ChemiconMAB3420דילול 1/200
אנטי דהייהThermo ScientificP7481ניתן להשתמש באמצעי הרכבה חלופיים
תוסף B27Thermo Scientific17504-044דילול 1/50
אלבומין סרום בקרסיגמא01-2030-2
מסננת תאים 100 אוםBD Falcon352360
מכונת צנטריפוגהKubota2410
כיסוי זכוכית 18 מ"מx18 מ"ממטסונאמי18x18 מ"מ מס' 1
עטDAKODAKO S2002ניתן להשתמש בעט דוחה מים חלופי
נוצותאזמל חד פעמי2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
מיקרוסקופ FluorecentNikonE600
מלקחיים מס' 5כלי מדע עדינים11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061דילול 1/100
מזרק המילטוןהמילטון805N22 מד, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
IgG אנושי, שבר Fcג'קסון009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
NeurobasalThermo Scientific21103-049
סרום חמור רגילג'קסון017-000-121
PBSNacalai14249-24
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו סיינטיפיק15070-063דילול 1/100
צלחת תרבית פלסטיק, 60 מ"מ
זמין וניתן לרכישה אצל פרופ' מרטין בסטמאייר (bastmeyer@kit.edu)
מיקרוסקופ סטריאואולימפוסSZ61
טיפ, 1000 uLWatson125-1000S
סרט דביק שקוףTesa57315ניתן להשתמש בסרט דביק חלופי
Triton X-100SigmaT8787
Trypan blue, 0.4%Bio-Rad145-0013
Trypsin/EDTAThermo Scientific25300-054
תרבית מדיוםנוירובזאלי בתוספת B27, GlutaMAX ופניצילין-סטרפטומיצין.
מטריצות סיליקון Thermo Scientific 150288

מקורות

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FLRT2Tau1

מאמרים קשורים