אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

סיכום

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

תקציר

המעיים - אשר מכילים את המספר הגדול ביותר של תאי מערכת החיסון של כל איבר בגוף - חשופים כל הזמן אנטיגנים זרים, הן חיידקים תזונתיים. בהתחשב שיש לנו הבנה גוברת כי אנטיגנים לומינל אלה לעזור לעצב את התגובה החיסונית וחינוך של תאים חיסוניים בתוך המעי הוא קריטי עבור מספר המחלות מערכתיות, שם כבר עלה עניין באפיון מערכת החיסון במעי. עם זאת, פרוטוקולים רבים שפורסמו הם מפרך זמן רב. אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט עבור הבידוד של לימפוציטים מתוך שכבת הרירית מיוחדת קטנה-מעיים, שכבת intraepithelial, והטלאים של Peyer כי הוא מהיר, לשחזור, ואינו דורש הדרגתי Percoll מייגע. אף על פי הפרוטוקול מתמקד במעי הדק, זה גם מתאים ניתוח של המעי הגס. יתר על כן, אנו מדגישים היבטים מסוימים שעשויות צריך אופטימיזציה נוספת תלויים בככפרו המדעי הספציפיtion. גישה זו גורמת לבידודה של מספר גדול של לימפוציטים קיימא כי לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוח תזרים cytometric או אמצעים חלופיים של אפיון.

מבוא

המשימה העיקרית של המעי הדק נחשב לעתים קרובות להיות עיכול וספיגה של חומרים מזינים ^1. בעוד תפקוד המטבולי זה חיוני בבירור, המעי הדק יש תפקיד משמעותי לא פחות בהגנת המארח מן המטח המתמיד של אנטיגנים סביבה נמצאים בתוך לומן ^2. המעי מפרידה בין העולם החיצוני (למשל., אנטיגנים לומינל) מהסביבה הפנימית של המארח עם שכבת האפיתל כי היא שכבה תא בודד רק עבה. ככזה, המערכת החיסונית הקטנה-מעיים יש את המשימה האדירה של איזון הסף שלה עבור תגובתיות, המאפשר אנטיגנים זרים מן חיידקי דיאטת commensal להיכנס רירי עם מינימאלי, אם בכלל, תגובה חיסונית תוך גובר תגובה חזקה נגד פתוגנים הפולשים "מזיקים" אנטיגנים אחרים. תגובות חיסוניות מוגזמות או לא מתאימות לאנטיגנים אלה יכולים להוביל למחלות פתולוגיים (למשל., Inflammaמחלות מעי טור, סוכרת מסוג I, טרשת נפוצה) ויש להימנע מהם ^3-6.

בסך הכל, מערכת העיכול הוא חשב לייצג את איבר החיסון הגדול ביותר בגוף, המכיל מעל 70% מכלל התאים מפרישי נוגדן ^7. המערכת החיסונית קטן-מעיים מורכב מ -3 תאים עיקריים - שכבת הרירית המיוחדת (LP), השכבה intraepithelial, וטלאים של Peyer (PPS) - שכל אחד מהם מכיל קבוצה ייחודית של לימפוציטים ^2. הלימפוציטים LP (LPLs) הם בעיקר תאי TCRαβ ⁺ T עם תאים ~ 20% B; לימפוציטים intraepithelial (IELs) מכילים תאי B מעט מאוד עם יותר תאי TCRγδ ⁺ T מאשר תאי TCRαβ ⁺ T; ו- PPS, שהן איברים הלימפה משני מוטבע בקיר הקטן-מעיים, מכיל ~ 80% תאי B. למרות שכל אחד האזורים האנטומיים הללו יש פונקציות נפרדות מעט ובסיסים אונטולוגית, הם מתפקדים אהאופנה armonized להגן המארח מפני עלבונות פתוגניים.

יתר על כן, יש הערכה גוברת כי החיידקים הוא קובע קריטי להתפתחות של מערכת חיסון במעי, עם הכרה גוברת של קשר מאותו המקור בין חיידקים ספציפיים ואת ontogeny של שושלות תאים מסוימות ^8,9. יתר על כן, בהתחשב בכך החינוך של מערכת החיסון במעי משפיע התגובה החיסונית לאתרים מרוחקים מבחינה אנטומית (למשל., דלקת פרקים, טרשת נפוצה, דלקת ריאות), זה הפך להיות ברור כי פיתוח של מערכת החיסון במעי רלוונטי יותר תהליכי מחלה מאשר שהוכר בעבר ^{10 -12.} ככזה, עניין בהערכת כמותית מערכת החיסון במעי האריך מעבר אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן עכשיו כולל אינטראקציות בין מאכסן commensal ואת בפתוגנזה של מחלות מערכתיות רבות גם כן.

בהתחשב בשונות של שיטות קיימות בהבידוד של לימפוציטים מעיים, שיטה כי הוא מותאם במיוחד תשואה, הכדאיות, ועקביות תוך איזון ראוי בין הזמן הנדרש הוא קריטי יותר ויותר. פרוטוקולים שכוללים הדרגתיים Percoll הם זמן העבודה אינטנסיבית יותר, אשר נוטה טעות אנושה, מוביל התשואה משתנית ואת כדאיות ^13. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבידוד והאפיון של לימפוציטים מכל 3 תאי החיסון קטנים-המעיים. בנוסף, עניין גובר נתון שינויים מושרי חיידק במערכת החיסונית ברירית, נכלולי צעדים שיכולים לשמש כדי לאפשר את ההעברה האופקית של מיקרואורגניזמים בין העכברים להעריך כיצד שינויים אלה כמותית להשפיע על המערכת החיסונית של המעי.

פרוטוקול

כל המחקרים נערכו בבדיקה הנחיות קפדניות על פי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, אשר עומדת בסטנדרטים וטרינריים שקבעה האגודה האמריקאית למדע בעלי חיים מעבדה (AALAS).

1. הילוכים אופקיים של חיידקים באמצעות Co-דיור (אופציונלית)

1. כדי למזער זיהום אקסוגניים (במיוחד אם באמצעות עכברי gnotobiotic), לתרגל את הטכניקה ספטית בעוד רכבת כלובים פנויים סטרילי, באמצעות מזון ומים כי יש את שניהם כבר autoclaved.
2. השתמשו אגרופי אוזן או תגים בנפרד לסמן 6 בן שבוע C57BL / 6 עכברים כי נמל microbiotas שונה לשכן אותם באותו כלוב. בהתחשב בכך עכברים קופרופאגי ולאכול כדורי צואה מן רצפת הכלוב, חיידקים יועברו באופן טבעי אופקי בין העכברים.
3. Co-בית עכברים ≥1 בשבוע כדי לאפשר זמן העברת חיידקים ושינוי אימונולוגית לפני הניתוח.

2. הכנת תרחיף תא בודד משכבת ​​אינטרה-אפיתל קטן-מעי Lamina propria

1. הכנת פתרונות
   1. הכן התקשורת החילוץ (מחיר המעי הדק): 30 מ"ל RPMI + 93 μl 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 μl 0.5 M EDTA + 500 μl עוברי בסרום שור (FBS). מוסיפים את DTT מיד לפני השימוש.
   2. הכן התקשורת העיכול (מחיר המעי הדק): 25 מ"ל RPMI + 12.5 מ"ג dispase + 37.5 מ"ג collagenase II + 300 FBS μl. מוסיפים את dispase ו collagenase מיד לפני השימוש.
   3. לכל incubations ביצע ב 37 מעלות צלזיוס, פתרונות prewarm ל -37 מעלות צלזיוס.
2. להרדים את העכבר על ידי מחנק ₂ CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.
3. הנח את הצד הגבי העכבר למטה ולרסס את הבטן עם אתנול 70%. השתמש במספריים לבצע פיום בטן ברצף על ידי חיתוך העור ולאחר מכן fascia הצפק לאורך קו האמצע הגחון הלוך ושובמ 'מאחת הערווה לתהליך xiphoid, ובכך חושף את חלל הצפק.
4. השתמש במספריים כדי להפריד את המעי הדק מהקיבה על ידי חוצים את הסוגר השוער. הוצא בעדינות את המעי הדק מן הצפק, מנסה לשחזר את שומן mesenteric.
   1. כדי להסיר את המעי הדק היטב, לעשות חתך שני בצומת ileo-cecal. מניח את המעי הדק מבודד לתוך קר (כלומר., 4 ° C) RPMI המכיל 10% FBS כדי למקסם כדאי תא.
5. הוצא בעדינות חתיכות גדולות של שומן באמצעות מלקחיים מעוקלים. היזהר כדי למנוע קריעה של רקמת המעי עצמו בעת שניסה להסיר שומן.
6. כדי להסיר תוכן המעיים, המעיים סומק בעדינות עם 15 - 20 מ"ל של PBS קר באמצעות מחט האכלה 18 G מודבקת מזרק.
7. השתמש במספריים שיחתוך PPS, ולהכניס אותם לתוך RPMI קר המכיל FBS 5%. PPS ממוקמים בצד antimesenteric של המעי הדק להופיע בתור רב lobulated לבןמסה. בהתאם לזן הספציפי, עכבר בדרך כלל יש 8 - 12 PPS.
8. חותכים את המעי הדק לתוך 3 - 4 מגזרים אינץ.
9. הסר שומן שייר ידי גלגול בכל מגזר קטן-מעיים על מגבת נייר טבולה RPMI, באמצעות אזמל משעמם להקניט את השומן מן הרקמה.
10. סובב את הרקמות מבפנים החוצה על ידי cannulating מגזרי המעיים עם מלקחיים מעוקלים לתפוס את הקצה הדיסטלי של הרקמה. לאחר מכן השתמש זוג ישר מלקחיים כדי להסיר את קטע הרקמה בעדינות מן המלקחיים המעוקלים (החל בסוף הפרוקסימלי), וכתוצאה מכך הרקמה להיות הפוכה.
11. מניחים קטעי רקמה בתוך כוס המכילה 30 מ"ל של התקשורת החילוץ ובר ומערבבים. אבטח את המכסה על הכוס, ומערבבים ב 500 סל"ד במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס; ערבוב צריך להיות נמרץ אבל לא מעורבב.
12. לאחר דגירה, להשתמש מסננת פלדה להפריד חתיכות רקמה מן supernatant המכיל האפיתל, שאמורה להופיע מעונן. supernatant זה מכיל iלימפוציטים ntraepithelial כי ניתן לנתח עוד יותר, אם תרצה בכך, על ידי שתמשיך סינון המדגם בצעדים 2.18 - 2.23.
13. ידני להתסיס את פיסות הרקמה ב RPMI לשטוף תקשורת חילוץ שיורית.
14. מניח רקמות על מגבת נייר יבשה להעיף אותו מקצה אל מספר פעמים כדי להקל על הסרה של ריר שיורית כי לא שוחרר על ידי מדיום החילוץ.
15. מניחים שברי רקמת צינור 1.5 מיליליטר עם 600 μl של מדיום עיכול.
16. השתמש במספריים כדי לקצץ את הרקמה עד חתיכות כבר לא מקלות על המספריים והפתרון נראה הומוגני. שלב זה הוא קריטי על מנת להבטיח עיכול אנזימטי מלא של הרקמה.
17. מוסיפים את המעי הדק טחון כוס המכילה 25 מ"ל של התקשורת העיכול. מערבבים ב 500 סל"ד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. באמצע העיכול (כלומר., ב 15 דקות), pipet למעלה ולמטה עם pipet סרולוגיות לעזור לשבור את כל חתיכות גדולות של רקמה.
18. רקמות מסננות מתעכלות (או epithשכבת elial משלב 2.12 אם IELs עיבוד) דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל. יש לשטוף את מסננת עם 20 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
19. צנטריפוגה הפתרון המסונן XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 °.
20. בזהירות למזוג גלולה supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
21. סנן resuspended התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך שפופרת 50 מ"ל. לשטוף מסננת עם 20 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
22. צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
23. בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של RPMI המכיל 2% FBS.

3. הכנת ההשעיה תא בודד מתוך תיקונים של Peyer

1. העברת נכרת PPS לכוס עם 25 מ"ל של התקשורת העיכול ובר ומערבבים. מכסה מאובטח, ספין ב 500 סל"ד במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
2. סנן מתעכל PPS דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור 50 מ"ל. אם כל הרמ"א גושיםב, ללחוץ אותם דרך מסננת בעזרת קצה השטוח של הבוכנה של מזרק 1 מ"ל.
3. לשטוף מסננת עם 10 מ"ל של RPMI המכיל 10% FBS.
4. צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
5. בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של RPMI המכיל 2% FBS.

4. מכתים שטחי cytometry זרימה

1. נפח Aliquot המתאים של תאים (למשל., 200 μl של LPLs) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית.
2. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
3. תאים Resuspend ב 90 μl של RPMI המכיל 2% FBS ו דילול 1: 100 של אנטי CD16 / 32 (בלוק Fc). דגירה של 10 דקות ב 4 ° C..
4. הוסף 10 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
5. תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant למזוג ידיהיפוך לצלחת.
6. (אופציונליים) תאי כתם עם צבע כדאיות, אם ירצו בכך, על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן.
7. תאים Resuspend בפורמלין 100 μl 1% לתקן את התאים. דגירה עבור שעה 1 בחושך ב 4 ° C..
8. הוסף 200 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
9. תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת.
10. תאים Resuspend ב 200 μl PBS. לנתח תאים באמצעות cytometer זרימה.

תוצאות

ניתוח תזרים cytometric של המתלים תא בודד של לימפוציטים קטנים-מעיים אמור להניב אוכלוסייה דיסקרטית של תאים בעלי מאפיינים דומים קדימה פיזור בצד כמו splenocytes (איורים 1 א ו -1 B). הלימפוציטים עשויים להתחיל למות אם הרקמה אינה נשמרת ב 4 ° C. במהלך השלבים הראשונים של בידוד, וכתוצאה מכך אוכלוסיית הלימפוציטים בעל פיזור קדימה נמוך ולהיות יותר קשה להפריד מתאי אפיתל מתים אחרים (איור 1 ג) . יתר על כן, אם הרקמה קטנה-מעיים לא נ...

דיון

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד וזרימת אפיון cytometric של לימפוציטים קטנים-מעיים, כולל LPLs, IELs, ואת הלימפוציטים PPS. למעוניינים בהערכה כיצד שינויי החיידקים להשפיע על המערכת החיסונית הקטנה-מעיים, נפרטנו את השלבים הפשוטים המעורבים בהעברה האופקית של אורגניזמים בין עכברי מחסה microbiotas שונה. למרות בפרוטוקול זה מתמקד המעי הדק, ההליך הוא זהה לניתוח של המעי הגס, עם ההבדל היחיד הוא שאין PPS להסיר (אם כי תיקונים גסים נוכחים, אלה הם בדרך כלל לא גסים גלויים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כפפות סטריליות	Kimberly-Clark	555092
	חדשני	MS2-AD	מכיל מכסה, תחתית כלוב ומצעי אלפא-דרי
מזין מתכת	חדשני	M-FEED
בקבוק מים	חדשני	M-WB-300
מחזיק כרטיסים	חדשני	CRD-HLD-H
מכרסם הניתן לחיטוי צ'או (NIH-31M)	זייגלר	4131207530
RPMI בינוני 1640	Gibco	11875-119
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
סרום בקר עוברי (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	הריכוז בפרוטוקול מבוסס על רמת פעילות של 1.878 U/mg
קולגנאז, סוג II	Invitrogen	17101-015	הריכוז בפרוטוקול מבוסס על רמת פעילות של 245 U/mg
מספריים חיתוך	Roboz	RS-5882
מחט האכלה (18 גרם, אורך 2 אינץ')	Roboz	FN-7905
10 מ"ל מזרק	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
אזמל חד פעמי (15 להבים)	Miltex	4-415
מלקחיים מעוקלים	Roboz	RS-5211
מלקחיים ישרים	Roboz	RS-5132
כוסות רב תכליתיות, 120 מ"ל	VWR	89009-662
מוט ערבוב	VWR	58949-062
צלחת ערבוב רב-מצבית, 9 מצבים	VWR	12621-048
חרוטי נירוסטה מסננת, 3 אינץ'	RSVP
1.5 מ"ל שפופרת	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m מסננת תאים	Falcon	08-771-19
40 μ m מסננת תאים	Falcon	08-771-1
50 מ"ל צינור חרוטי	Falcon	352098
1 מ"ל מזרק	BD	309659
96 בארות צלחת, תחתית עגולה	Corning	3799
נגד עכבר CD16/32 (בלוק Fc)	Biolegend	101320
(אופציונלי) צבע כדאיות לתיקון eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% פורמלין, חוצץ ניטרלי	Thermo Scientific	5725