הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות Pseudomonas aeruginosa

Summary

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

Abstract

עמיד חיידקים לאנטיביוטיקה מסורתית העלה ניסיונות מחקר לזהות מטרות תרופה חדשות במסלולים רגולטוריים שהתגלו לאחרונה. מערכות רגולטוריות לנצל di-GMP המחזורית התאית (c-di-GMP) כשליח שני הן משורה אחד כזה של היעד. ג-di-GMP הוא מולקולת איתות למצוא כמעט כל החיידקים שפועל להסדיר פעילות ענפה של תהליכים כולל עמידות לאנטיביוטיקה, היווצרות ביופילם ו ארסיות. ההבנה כיצד c-di-GMP איתות היבטים שולטים של פיתוח biofilm עמיד לאנטיביוטיקה הציעה גישות לפיה שינוי הריכוזים הסלולר של נוקלאוטיד או שיבוש של מסלולי איתות אלו עשויים להוביל להיווצרות ביופילם מופחתת או רגישות מוגברת של biofilms לאנטיביוטיקה. אנו מתארים פרוטוקול bioreporter תפוקה גבוהה פשוט, המבוסס על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), שביטויים הוא תחת השליטה של אמרגן תגובת c-di-GMP cdrA, להקרין במהירות עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל לווסת רמות הסלולר ג-di-GMP ב Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). פרוטוקול זה פשוט יכול להקרין כלפי מעלה של 3,500 תרכובות תוך 48 שעות ויש לו את היכולת להיות מותאם מיקרואורגניזמים רבים.

Introduction

ההתפתחות המהירה של עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה נגד חשיבות קלינית היא אחת הדאגות הגדולות כיום בפני אנשי מקצוע בתחום בריאות ברחבי העולם. כשל זה של אנטיביוטיקה מסורתית העלה חיפושים חדשים לצורך עניין כימי שיכול להפריע לתהליכי חיידקים מעורבי התקדמות הארסית ומחלות ^1. אחת מערכה רגולציה כך מנצלת את השליח שני תאיים מחזורי di-GMP (c-di-GMP) הפכה לאחרונה יעד עם תוקף הבטיח ^2-4. זה כבר נקבע כי מולקולת איתות השליח השנייה הגלובלית הזה מסדיר פונקציות רבות כולל עמידות לאנטיביוטיקה, הדבקה, היווצרות ביופילם ומחלות ^2-4.

הוא הבין עכשיו ברמה התאית של c-di-GMP של תא החיידק נשלטת בסינתזה והשפלה לפיה שתי מולקולות של GTP משמשים לסנתז ג-di-GMP ידי cyclases diguanylate תחום המכיל GGDEF (DGCs) ש"שereas השפלה c-di-GMP מזורזת על ידי phosphodiesterases (PDEs) שיש בין כאדם EAL או תחום HD-גיפ (הנסקרת ב (3, 5)). חלבונים המכילים תחומים אלה בדרך כלל מכילים תחומי איתות אחרים, דבר המצביעים על כך פעילותם מחזור ג-di-GMP מוסדרת במישרין או בעקיפין על ידי רמזים סביבתיים או הסלולר ^3,5. כתוצאה מכך, ג-di-GMP איתות פונקציות לקשר את החישה של רמזים סביבתיים מגוונים שינויי פנוטיפ חיידקים. ג-di-GMP מפעילה השפעה הרגולציה שלה בחיידקים ברמה של שעתוק, שלאחר שעתוק-תרגום פוסט ידי מנגנונים שונים ^4.

השפעה גדולה של c-di-GMP בתאי חיידקים רבים היא בקביעת חיידקים 'אורח חיים', ובמיוחד, בבקרה של מעברים בין תאי planktonic ניע ותאיים נייחים המחוברים משטחים או מאורגנים במבנים הרבים-תאיים של biofilms ^3,5. באופן כללי, הסלולר גבוההרמות של C-di-GMP המשויכים היווצרות ביופילם ו sessility, בעוד שרמות הסלולר נמוכות לעודד תנועתיות וסינתזת גורם ארסי חיידקים פתוגנים רב ^3,5. לפיכך, ידע מפורט יותר של אופן הפעולה של איתות ג-di-GMP יכל להרשות לעצמם אסטרטגיות עבור עיכוב של היווצרות ביופילם ו ארסי חיידקים פתוגנים. זוהי משימה מרתיעה בהתחשב בכך שרוב הגנום החיידקים לקודד חלבונים רבים עם GGDEF, EAL ו / או תחומי HD-גיפ (למשל פ aeruginosa למעלה מ -40 חלבונים) ומפעילים מרובים ^6,7.

עם זאת, גם עם המורכבות הזו, הראיות האחרונות עולה כי אסטרטגיות מניפולציה ג-di-GMP איתות ניתן פותחה כדי גם למנוע זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה פיתוח או להפוך אותם רגישים במערכת החיסונית או טיפול יעיל על ידי שיתוף מתן אנטיביוטיקה קלאסי ^2. בקנה אחד עם זה, זה כבר בניסוי הראו כי ירידה מלאכותיתc-di-GMP תאיים במבחנה -grown פ aeruginosa מוביל ירד היווצרות ביופילם והגדילה את הרגישות antimicrobials, תוך פ biofilms -developed aeruginosa על שתלי סיליקון, ממוקם חלל הצפק של עכברים, ניתן לפזר באופן דומה ^8-11.

כאן אנו מתארים assay כתב תפוקה גבוהה, קרינה המבוססת להקרין מולקולות קטנות פוטנציאליים שיכול לווסת את רמות הסלולר ג-di-GMP ב פ aeruginosa (איור 1). Assay הוא מבוסס על מדידת ג-di-GMP רמות הסלולר באמצעות כתב ה- GFP שפותח בעבר שביטויים קשור תעתיק האמרגן ג-di-GMP-תגובת cdrA ^12. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ביטוי לבנות כתב ב פ זן של עניין aeruginosa, הכנת צלחת מתחם, חיסון התרבות לתוך 384 גם צלחות, תנאי גידול, כפי שאנוLL כפי לפרטים בדבר איסוף נתונים, ניהול וניתוח (איור 1). בסך הכל, פרוטוקול זה יסייע לחוקרים פוטנציאל לזהות תרכובות חדשות מיקוד ג-di-GMP איתות חיידקים, לשימוש במחקר מכוון להבנת הביולוגיה של פ aeruginosa.

Protocol

הערה: נהלי שיבוט וטרנספורמציה של פלסמיד הכתב המטוהר ג-di-GMP הם דנו במקום אחר ^12.

הדור 1. של GFP Tagged ג-di-GMP Reporter פ זני aeruginosa

1. לחסן 5 מ"ל של מרק lysogeny (LB) בינוני עם מושבה אחת של פ aeruginosa ו דגירה לילה בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל"ד.
2. העברת 2 מ"ל של תרבות הלילה לתוך 200 מ"ל של מדיום LB טרי בבקבוק 1 ליטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד.
3. צג צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ כל 30 דקות על ידי נטילת דגימה 1 מ"ל מהבקבוק ולבחון באמצעות ספקטרופוטומטר (כמתואר ¹² בעבר).
4. כאשר OD ₆₀₀ מגיע בין 0.3 - 0.5, להציב 40 מ"ל של תרבות לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי.
5. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 8000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant ו rדואר להשעות את התאים ב 40 מ"ל של קר כקרח, סטרילי, 300 מ"מ סוכרוז פתרון.
6. גלולה התאים פעם שנייה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 20 מ"ל של תמיסת קרים כקרח, סטרילי, 300 מ"מ סוכרוז.
7. גלולת התאים בפעם אחרונה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 400 μl של פתרון קר כקרח, סטרילי, 300 מ"מ סוכרוז.
   הערה: צפיפות התאים בשלב זה צריכה להיות כ 1 x 10 ¹¹ מושבה יחידה להרכיב למיליליטר (CFU / ml).
8. צ'יל את התאים על קרח למשך 30 דקות, לאחר מכן הם מוכנים electroporation.
9. הוסף 1 μl של פתרון ¹² פלסמיד ^C 0.2 מיקרוגרם / μl pCdrA :: GFP 40 μl של פ אלקטרו המוסמכת תאים aeruginosa מוכן לעיל בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל כי כבר מראש מקורר על הקרח. מערבבים את ההשעיה ולהעביר לתוך הפער אלקטרודה מראש צונן, 2 מ"מ, קובט electroporation.
   הערה: pCdrA :: GFP C: pUCP22Not-P _cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T ₀ -T _1, Amp ^r Gm ^r, אשר נותן ההודעה הניאון של רמת תאיים של c-di-GMP ב פ זני aeruginosa, פותחו ומאומתים על ידי Rybtke et al. ^12.
10. הסר לחות בחלק החיצוני של קובט עם נייר טישו והמקום קובט לתוך תא מדגם של electroporator. דופק עם מתח של 2.5 kV, קיבול של 25 μF והתנגדות של 200 Ω.
11. הסר את קובט ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום LB. ואז, להעביר את התאים צינור סטרילי 1.5 מ"ל microcentrifuge ו דגירה של שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד.
12. מורחים 10 μl, 50 μl ו 100 aliquots μl של התרבות לצלחות סטרילי LB-אגר בתוספת אמפיצילין (בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
13. אשר את הביטוי GFP (excitatiעל ב 485 ננומטר, פליטה ב 520 ננומטר) על ידי בחינת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערוץ GFP סטנדרטי פיק מושבה אחת לחסן 5 מיליליטר LB. דגירה לילה כפי שמתואר בשלב 1.1. מערבבים 0.5 מ"ל של תרבות לילה עם 0.5 מ"ל 50% גליצרול בתוך 2 מ"ל בורג הצינור העליון ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

2. הכנת תרבות Starter עבור חיסון

1. ימים לפני המסך, צלחת פ זן aeruginosa (המכיל את pCdrA :: פלסמיד ^C GFP) מ -80 מעלות המניות C לצלחת LB-אגר (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי הפצת חיידקים בעדינות על הצלחת באמצעות חיסון סטרילי לוּלָאָה. דגירה את צלחת הלילה ב 37 מעלות צלזיוס.
2. הערב לפני ההקרנה, לחסן מושבה אחת של פ aeruginosa מהצלחת לתוך 10 מ"ל של מדיום LB (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל) בתוך tuלהיות דגירה לילה-תרבות טרום ב 37 ° C עם רועד ב 200 סל"ד.
3. ביום של המסך, להכין תת מן מראש תרבות הלילה על ידי דילול זה הראשון עם מדיום LB טרי ל OD ₆₀₀ של 1.0 ולאחר מכן דילול נוסף עם 5% LB כדי OD ₆₀₀ של 0.04 (01:25 יחס) .
   הערה: הנפח הכולל של המדיום המחוסן תלוי במספר הצלחות להיבדק. 5% LB נעשית על ידי דילול 100% LB עם בופר פוספט (PBS) לריכוז הנדרש. חשוב לציין, התקשורת (5% LB) מאפשרת הפעלה מכוננת של pCdrA :: ^C GFP ב פ aeruginosa.
4. הוספת בר בוחש מגנטי סטרילית לתוך המיכל ומערבבים התרבות במהירות מינימלית על בוחש מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, המאפשר לחיידקים להתאקלם התקשורת לפני שהם לוותר לתוך 384 גם הצלחות.

3. הרכבת חיסון דגירה של צלחות 384-היטב המכילותמולקולות קטנות

הערה: עקרות וטכניקות ספטית טובות הן ערכים חשובים מאוד השלבים הבאים.

1. כדי להכין את השליטה חיובי (100% עיכוב), להוסיף 20 סולפט tobramycin μl (25 מ"ג / מ"ל) עד ​​10 מ"ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הבקרה החיובית לתוך בארות A23 - P23 (איור 2).
2. כדי להכין את הביקורת השלילית (0% עיכוב), להוסיף 30 sulfoxide דימתיל μl (DMSO) עד 10 מ"ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הביקורת השלילית לתוך בארות A24 - p24 (איור 2).
3. עבור כל אחת הצלחות חותמת עם מולקולות קטנות, לחסן בהיקף של 40 μl של תרבויות לילה מדולל (המתואר בשלב 2.3) לתוך A1 בארות - P22 (איור 2).
   הערה: זו יכולה להיות מושגת באמצעות מטפל נוזלי לשדודot. בשל המאפיינים הטרוגנית של תרבויות חיידקים, חשוב לשמור על תסיסה מתמדת ומתונה לשמור חיידקים מופצים באופן עקבי בתקשורת תוך מחלק. כדי לעשות זאת, לשמור על ערבוב התרבות התאקלמה משלב 2.4 מגנטי במהלך מהחלק.
4. חותם את הצלחות עם חותם חיפוי אווירי חדיר דגירה במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: החותם חדיר-האוויר הוא קריטי כדי לשמור על תנאים משתנים בכל 384 בארות וכדי לעקוף את פיתוח הפוטנציאל של הדרגתיים חמצן על פני הצלחת.

מדידת 4. של צמיחה (OD ₆₀₀₎ ו תאי ג-di-GMP רמה (GFP)

1. כ -30 דקות לפני מדידת spectrophotometric, מראש לחמם את קורא הצלחת ל -37 ° C כדי למנוע התעבות.
2. הוצא בעדינות את חותם כיסוי חדיר-האוויר לפני הקריאה. מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטבזמן שיקוע של 0.2 שניות.
3. לפני מדידת קרינה, לעשות רווח אוטומטי וכוונון מוקדי המבוסס על טוב A24 (שליטה שלילית) ולהגדיר את ערך יעד הרווח ב 75% (איור 2).
   1. מתוך תוכנות שליטה קוראת צלחת, לחץ על מדידת התחלה ולחץ על '' פוקוס התאמת הרווח / פלייט מזהה '' כרטיסייה.
   2. הבחירה '' התאמת מוקד '' ו '' 'ערוץ' 'בצד ימין על החלון.
   3. בחירה '' התאמת רווח '' ו '' נבחר גם '', ו סוג ב '' 75 '' כ '' ערך יעד ''. לבסוף, לאסוף גם A24 בפריסת הצלחת לפני הלחיצה על '' התחל כוונון ''. לאחר ההתאמה מתבצעת, לחץ על '' התחל מדידה ''.
   4. למדוד את הקרינה מן הכתב GFP תמורת מקסימום עירור / פליטה של ​​485/520 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטב settling זמן של 0.2 שניות.
4. איסוף נתונים מכל הלוחות שנבדקו. הערה: קריאות נתונים נשמרות אוטומטית כברירת מחדל על ידי תוכנות שליטה קוראת צלחת.
   1. קריאות צפו על ידי לחיצה על סמל "מאדים" בתוך תוכנות שליטה כדי לפתוח את חבילת הניתוח הסטטיסטית.
   2. אחזר נתונים על ידי "לחיצה כפולה" על מספר לוחית עניין לגשת לנתונים לניתוח.

ניתוח 5. נתונים

1. להעריך את אחידות השחזור של assay באמצעות הניתוח "Z החזק, המהווה את מדדי איכות הנפוצות ביותר שדווחו עבור מסכי תפוקה גבוהה. חישוב z החזק 'באמצעות הנוסחא:
   
   איפה MAD (סטיית מוחלט חציון) היא אומדן של סטיית התקן, p היא הבקרה החיובית (100% עיכוב) ו- n היא השליטה השלילית (עיכוב 0%) הוא ₆₀₀ OD ו נ GFPalues. הערה: assay עם ערך z 'חסון (שחושב הן ₆₀₀ OD נתונים גולמיים GFP) גדול או שווה ל -0.5 נחשבת כסוג של assay מצוין.
2. חישוב% עיכוב הצמיחה באמצעות הנוסחה:
   
   איפה Xi _OD600 הוא הערך איטרטיבית OD ₆₀₀ של כל דגימה היטב. % עיכוב _OD600> 0, מעכב צמיחה; עיכוב% _OD600 <0, מעודד צמיחה.
3. להעריך את עיכוב% מרמת תאיים של c-di-GMP באמצעות הנוסחא (השינוי ביחידות עוצמת קרינה שרירותית מתוקנים לשינוי צפיפות תאים):
   
   איפה Xi _GFP הוא הערך GFP איטרטיבית של כל דגימה היטב. % עיכוב _GFP> 0, c-di-GMP מעכב; % &# 160; עיכוב _GFP <0, האמרגן ג-di-GMP.
4. גדר סף לגילוי להיט 3 MAD מן החציון (חציון ± 3 MAD), מחושב מן המדגם גם לקריאה קטנה של כל צלחת, בהנחה של התפלגות נורמלית של נקודות נתונים. הערה: עם זאת, עיכוב ± 50% חתוך ניתן לבחור עבור מבחני מנה תגובה יותר לשחזור מדויק במידת הצורך.

Results

הגישה המתוארת כאן מאפשרת לחוקר יחיד ביעילות ובהצלחה מסך ממוצע של 3,500 תרכובות בתוך תקופה של 48 שעות. סקירה כללית של פרוטוקול הקרנת התפוקה הגבוהה מודגמת כמו תרשים זרימה באיור 1. לכתבה הנוכחית, אנו הוקרננו כלל-של-חמש ספרייה מורכבת תואמת עבור תרכובות ויסות ג-di-GMP פוטנציאל בריכוז סופי של 600 מיקרומטר . עם זאת, יש הרבה זמינים מסחריים דמויי סמים ו לא תרופתי כמו סטים מתחמים שיכול לשמש ב assay. ערכות אלה יכולות להיות תרכובות ממוקדות חיידקים או תרכובות נקווים אקראיות אבל כל ספרייה הייתה מושתת תכונות ומאפייני physicochemical מוקצה כגון הערכה הוקרנה כאן, אשר היו קבוצות פונקציונליות קוטב ומרכזי stereogenic מרובה. בפרוטוקול זה, חיידקים הם מחוסנים לתוך הצלחת יחד עם תרכובות, פקד חיובי אנטיביוטיקת רכב DMSOמלא, בהתאם לפריסה שמוצגת באיור 2. איור 3 מתארים את התוצאות של ההקרנה הראשית שהודגמה צלחת ספרייה יחידה. נציג OD ₆₀₀ ונתוני גלם GFP מוצגים באיור 3A ו 3B, בהתאמה. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום) כדי לקרר (ירוק) צבעי מציין נמוכים לערכים הגבוה OD ₆₀₀ / GFP, יושמו לערכים היטב. המפות החומות נוצרו בתוך תוכנת גיליון אלקטרונית על ידי החלת עיצוב מותנה בהיקף 3-צבע פורש מן OD הנמוך ביותר ₆₀₀ / GFP לקריאה החוצה עד OD הגבוהה ביותר ₆₀₀ / GFP לקריאה החוצה. OD ₆₀₀ ו- GFP הנמוכים ערכים ביחס הביקורת השלילית DMSO מתאימות עיכוב בגדילת רמות ג-di-GMP בהתאמה, בעוד ערכים גבוהים ביחס הביקורת השלילית DMSO מתאימות קידום בצמיחה ורמות C-di-GMP בהתאמה . הערכים 'z החזק ₆₀₀ OD ו- GFP arדואר מחושב על פי נוסחה שנקבעה בפרוטוקול (5.1). כפי שהם שניהם מעל 0.5 (0.694 ו 0.761 בהתאמה), איכות assay נחשבת חזקה והנתונים נותחו נוסף. עיכוב% של צמיחה (OD ₆₀₀₎ ורמת ג-di-GMP התאי (GFP) מחושב על ידי הנוסחות כנקבעות בפרוטוקול (5.2, 5.3). נציג נתונים מוצגים באיור 4 א ו -4 בהתאמה. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום) כדי לקרר (ירוק) צבעי מציין נמוך עיכוב% גבוה, יושמו לערכים היטב. עלילת פיזור של עיכוב% _{(OD600 / GFP)} מבארות פרטניות המבוססות על המסך הראשי היא להתוות איור 5 א ו 5 ב עבור ₆₀₀ OD ונתוני GFP בהתאמה. ± 50% חתוכים (מסומן עם קווים מקווקווים) נבחר לגילוי להיט. להיטים פוטנציאליים על הסמך חתוך זה מסומן עם נקודות אדומות. שני סוגים של תרכובות של עניין ניתן דiscerned מן assay. נפילות באיור 5A הן תרכובות מעכבות התפתחות חיידקים, בעוד נפילות איור 5 ב הן תרכובות כי פוטנציאל להחזיק את היכולת לווסת את הרמות תאיות של c-di-GMP. שני מתחמים זוהו נפילות נציג עבור assay זה. אלה הם מתחם, B מעכב מתחם צמיחה פוטנציאלי, מעכב פוטנציאל c-di-GMP. תרכובת תואמת F8 גם איורים 3 ו -4 והיו לו עיכוב 72.5% בצמיחה. היה עיכוב מקביל צפוי ברמות מחזוריות di-GMP. מתחם B מתאים K3 גם איורים 3 ו -4 והיה לו עיכוב 61% ברמות מחזוריות di-GMP ללא שינוי בצמיחה. תרכובות להיט בחרו נבדקים נוספים על ידי assay 10 נקודות מנה-תגובה עם ריכוז עליון של 2 מ"מ וסדרות דילול כפול. ערכי ₅₀ IC מחושבים על מנת התגובהעקומות (איור 6 א 'וב').

סקירה כללית באיור 1.: הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה קטנה מולקולות עבור הפוטנציאל שלהם לווסת רמות ניידות של c-di-GMP ב פ aeruginosa. סקירה זו מציגה צעד-אחר-צעד ייצוג של הפרוטוקול המשמש assay זה. מושבת חיידקים של פ aeruginosa הוא גדל לילה תרבות המתנע LB. באמצעות מתקן מגיב, התאים מחוסנים לתוך 384 גם צלחות המכילות תרכובות שנבחרו. הצלחות מודגרת במשך 6 שעות, שלאחריו ערכי OD ₆₀₀ ו- GFP נמדדים. באמצעות לקריאת פסקים אלה, תרכובות המשפיעות על הרמות הסלולריות של c-di-GMP ניתן לזהות. אנא לחץ כאן כדי להציגגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. איור 2. מפת פלייט 384 גם משמש מולקולה קטנה הקרנת Assay התרכובות מהספרייה (תכלת) הם aliquoted לתוך בארות A1 - P22. "שליטה חיובית" (אדום) המורכב לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / סולפט tobramycin מ"ל מתווסף בארות A23 - P23 ואת "שליטה שלילית" (ירוק) המכיל ריכוז סופי של 1% DMSO מתווסף A24 בארות - p24. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. נציג תוצאות עבור אחת 384 גם הקרנת פלייט. Rהנתונים הגולמיים epresentative מיועד OD ₆₀₀ (א) ו- GFP (B). מפת חום צבע הדרגתי, עם חם (האדום: OD ₆₀₀ = 0.65 או GFP = 250,000) כדי לקרר (גרין: OD ₆₀₀ = 0.10 או GFP = 40,000) צבעים המציין נמוך לערכים גבוהים, יושם לערכים היטב. וולס כי יש יחסית קריאות OD ₆₀₀ / GFP תחתונה הביקורת השלילית DMSO ייטו להיות באדום בעוד בארות שיש קריאות GFP OD ₆₀₀ / גבוהות ביחס לשליטת DMSO ייטו להיות בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.

איור 4. נציגי תוצאות עבור עיכוב אחוז מחושב עבור צלחת 384 גם. נתוני עיכוב% נתחו מיוצגים הן של OD ₆₀0 (א) ו- GFP (B) לקריאה outs. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום: OD ₆₀₀ = -150% או GFP = -20%) כדי לקרר (גרין: OD ₆₀₀ = 100% או GFP = 100%) צבעי מציין נמוכים לערכי עיכוב גבוהים, כבר להחיל את הערכים היטב. מולקולות קטנות, אשר באופן פוטנציאלי לעכב צמיחה תאית ג-di-GMP ייטו להיות בירוק ואילו מולקולות קטנות אשר באופן פוטנציאלי לקדם צמיחה ורמות C-di-GMP התאיים ייטו להיות באדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5. מגרשי פיזור נציג עבור עיכוב% _{(OD600 / GFP)} מתקבל נבדקת כל מולקולה הקטנה. כל מולקולה קטנה מיוצגים על ידי נקודה ואת חלוקת עיכוב%עבור כל אחד OD ₆₀₀ (א) ו- GFP (B) לקריאה פסקי מוצג. ± 50% חתוכים נבחר לזיהוי להיט. להיטים פוטנציאליים מודגשים באדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. נציגי תוצאות ממינון -. Assay תגובת שתי תרכובות (מעכב צמיחה פוטנציאלי B מעכב ג-di-GMP פוטנציאל) זיהו מן המסכים קודם נבדקות נוספות ב assay 10 נקודות מנה-תגובה עם ריכוז עליון של 2 מ"מ וסדרות דילול כפול. התאמת פונקציה לוגיסטית ארבעה פרמטר לנתונים הניבו ערכי ₅₀ IC של 158 מיקרומטר ו 193 מיקרומטר בהתאמה. PleASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

על מנת לשפר את הטיפול של זיהומים חיידקיים, ברור כי הבנה טובה יותר של התנהגות חיידקים ברמה הרגולטורית המולקולרית נדרשה. ההליך המתואר כאן יהיה מועיל עבור מיקרוביולוגים, ביוכימאים וקלינאים שרוצים לחשוף מולקולות קטנות כי יש פוטנציאל להשפיע או להפריע ריכוזי הסלולר של c-di-GMP בחיידקים. השיטה משתמשת bioreporter GFP שפותח לאחרונה לעקוב אחר רמות סלולריות של c-di-GMP ב פ aeruginosa ^12. bioreporter זה יאומת והראה חשוב לא להשפיע על הצמיחה של הזן משמש כאשר בתרבית 5% LB ב PBS. שימוש מסך כל תא לזהות מולקולות קטנות שמשנה רמות ג-di-GMP in vivo מתגבר על הקשיים הגדולים של גילוי תרופות מבוסס יעד מבחינת חדירת מולקולות דרך הממברנות חיידקי, במיוחד באמצעות אלה של חיידקים גראם שליליים . חשוב לציין, לאהוא assay מופיע מאוד חזק כערך z 'חזק באופן עקבי מעל 0.5 נצפה בכל המסכים עד כה. הקרנת שימוש בפרוטוקול זה יגלה מספר מולקולות קטנות המעכבות ו / או לקדם רמות ג-di-GMP תאיים P. aeruginosa. יתר על כן, assay זה גם יש פוטנציאל לזהות bactericidal או תרכובות בקטריו וכתוצאה מכך לירידה-אאוט לקרוא OD _600.

למרות שלא נדונו בסעיף הפרוטוקול, ישנם מספר שיקולים חשובים לעריכת הניסוי. זה חיוני לזכור כי bioreporter GFP מבוסס על פלסמיד. למרות פלסמיד הכתב ידוע להיות יציב מאוד פ aeruginosa, זה יכול ללכת לאיבוד אחרי מחדש ציפוי רציף, ומכאן הצורך להשתמש זנים מצופים טרי מתוך -80 ° מניות גליצרול C, ובדיקת ביטוי קרינה היא קריטית. זה גם מאוד יקר כדי לשמור על תנאי צמיחה אחידים על פני המסךשכן תנודות כל בתנאים האמורים עלולה להיות תוצאות-לוואי על המסך. זה יכלול ביצוע מסוים כי תקשורת ואנטיביוטיקה הן תערובת של עוגיות נצווה בשימוש לאורך הקורס של המסך. תרביות חיידקים לא גדל (מבוסס על OD ₆₀₀ לקריאת פסקים) באופן אחיד הוא בעיה נפוצה עבור מסכי תפוקה הגבוהה ביותר מסוג זה. זה יכול להיות בגלל קצה אפקטים או מחלק תרבות חיידקים הלא הומוגנית לתוך הצלחות. לקבלת לשעבר, מוודא חותם גז חדיר משמש במהלך הדגירה הוא חיוני. בעוד באפשרות השנייה, תחול צינורות מטפל הנוזליים עם נפח של התרבות לפחות שלוש פעמים את הנפח המת של הצינור עצמו מומלץ. זה חיוני כדי לשמור על בוחש מגנטי במהירות מינימלית במהלך מחלק. תוך מעקב ואחסון של 384 גם הצלחות לצמיחה עקבית במהלך הניסויים הוא בעל חשיבות עליונה, מצב שיש להימנע ממנו הוא הערמה של צלחות במהלך הדגירה כפי שהוא יכול לגרום unרציתי הדרגתי חמצן מוביל להטות את דפוס הצמיחה. כמו כן, חשוב להבטיח כי רכב DMSO משמש כביקורת שלילית אינו משפיע צמיחה שלילית של הזן של עניין. רבים של בעיות אלה הקשורים צמיחה יכולים להימנע על ידי ביצוע מסך מדומה עם זן החיידקים של העניין לפני ההקרנה. פרשנות נתונים גם שיקול לגופו בהתחשב בעובדה תוצאות עיכוב c-di-GMP מחושבים על ידי השינוי ביחידות עוצמת הקרינה שרירותית כי יש לתקן לשינוי צפיפות התאים. עם זאת לזכור נוסחאות מתמטיות שונות על מנת להעריך את התפוקה נתונים מניסויים אלה צריך להיות גם נחשב. לדוגמא, תרכובת יכולה להופיע כמעכב ג-di-GMP אבל בעצם להיות מעכב צמיחה או להיפך, שמצריכה פרשנות זהירה של נפילות.

ישנם מספר חסרונות ומגבלות כי יש לקחת בחשבון במהלך הפיתוח והביצוע של זהתפוקה גבוהה מבוסס תאי מסך. לדוגמה, פונקציות-הכתב ביו על אמצעי עקיף של הסלולר רמות ג-di-GMP באמצעות בדיקה ניאון שתכונותיו זיהוי עלול להיות מושפע מולקולות קטנות ששימשו מסך. סוגיה משיקה היא העובדה כי assay מבוסס התאים נותן שום מידע לגבי המנגנון עומד מאחורי שינויים ברמות-di-GMP ג התאי. לכן, תצפיות חשובות מניסויים יש לאשר באמצעות גישת ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית בעל ביצועים גבוהים, אשר נחשבת השיטה "-תקן זהב" למדידת תנודות תאיות ג-di-GMP בחיידקים. יתר על כן, ההליך שלנו יכול לספק מידע רק לגבי ההתנהגות של חיידקים הגדלים במבחנה, כמו תאי חיידקיים גדלו בהקשר של המארח (in vivo) מהר לשנות את פעילותם בשל בסביבה זו. יתר על כן, התהליך של שימוש GFP bioreporter אומר המסך אינו לוקחבחשבון את המצב הפיזיולוגי של תאים חיידקיים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם ניטור מיקרוסקופי של בארות בודדות במהלך המסך.

אפילו עם שיקולים אלה ומגבלות, assay תפוקה גבוהה זה עדיין מסך חזק מולקולות קטנות של מסוגלות להפריע רמות ג-di-GMP תאיים. מאז מינים של חיידקים רבים, כוללים חיידקים פתוגנים רבים נחקרו על מנת לאפיין את האפנון של רמות ג-di-GMP התאיים, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על מיני חיידקי מגוונת התרחב המחקר של מודלי חיידקי multispecies מורכבים יותר. Assay יכול להיות מותאם בקלות עבור מיני חיידקים אחרים על ידי שינוי תנאי הגידול בשימוש, או יכולים להיות מותאמים לקרוא פלטים אחרים באמצעות bioreporters השונה. פעמי דגירה שונות ניתן ליישם תלוי שלב הצמיחה של עניין. עם זאת, כאשר בגמלון או באמצעות הגדלה-פשוט, היא importan t לזכור כי החיידק עדיין יהיה גדל במהלך הכנות צלחת ומדידות לקריאה החוצה. לכן מומלץ להקרין לכל היותר 15 צלחות בכל פעם, באמצעות פרוטוקול זה. יתר על כן, באמצעות צלחות עם יותר מ 384 בארות לא יכול לאפשר צמיחה אחידה, מחייב אופטימיזציה נוספת. כאשר קנה המידה את מספר צלחות, זה עשוי להיות מתאים יותר כדי לחסן באופן ידני באמצעות פיפטה אלקטרונית במקום רובוט טיפול נוזלי. ברור כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור מולקולות קטנות לפזר biofilms, בהתחשב בכך תרכובות אנטי biofilm להפריע איתות ג-di-GMP. הפרוטוקול יכול גם להיות ושפץ להבין היבטים שונים של פיזיולוגיה חיידקי. בהתחשב האיתות כי ג-di-GMP נפוצה ברוב החיידקים, על ידי לימוד physiologies של אורגניזמים אלה באמצעות פרוטוקול זה אנו יכולים לזהות גירויים כימיים שונים כדי לקבוע אם או לא מנגנוני המפעילים שלהם דורשים איתות ג-di-GMP.

_content "> לסיכום, את האיתנות צדדיות של הגישה המוצגת בפרוטוקול זה יסייע בזיהוי מאפננים כימיים של c-di-GMP איתות במערכות ביולוגיות רבות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מרק ליזוגני (לנוקס)	סיגמא אולדריץ'	L3022-1KG
סוכרוז	סיגמא אולדריץ'	S0389-1KG
מרק ליזוגני עם אגר (לנוקס)	סיגמא אולדריץ'	L2897-1KG
אמפיצילין נתרן	סיגמא אולדריץ'	A0166-25G
גליצרול	סיגמא אולדריץ'	G5516-1L
פוספט חוצץ תמיסת מלח, pH 7.4	Life Technologies	10010-056
Tobramycin sulfate	Sigma Aldrich	T1783-100MG
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S UV-Vis ספקטרופוטומטר	Thermoscientific	840-208100
2 מ"מ פער אלקטרופורטור קובטה	Bio-Rad	1652092
BioRad GenePulser XCell אלקטרופורטור	Bio-Rad	1652662
Leica סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי	Leica Microsystems	MZ16FA
מוט ערבוב מגנטי למותג, PTFE, גלילי עם טבעת ציר (עיקור על ידי חיטוי לפני השימוש)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA 384-well
, קירות לבנים, צלחות תחתונות שקופות	גריינר	781098
מתקן ריאגנט Multidrop Combi	Thermo Scientific	5840300
צינורות משולבים Multidrop	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II פיפטה אלקטרונית 16 ערוצים	Integra Biosciences	4642
100 מ"ל מאגרי ריאגנטים חד פעמיים סטריליים	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal ממברנות חדירות אוויר	Sigma Aldrich
MKBQ1886 קורא צלחות Pherastar (גרסת תוכנה: 4.00 R4, גרסת קושחה: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS