הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה קלה וניתנת לשחזור המשתמשת בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך (RP-HPLC) כדי למדוד את חילוף החומרים של פורין על תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) שגודלו בתנאים שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטה זו מתארת שלב הפוך רגישה, ספציפית, אמינה לשחזור כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (RP-HPLC) שפותח assay ומאומת עבור כימות של נוקלאוטידים purine התאיים ו נוקלאוזידים המיוצרים על ידי לוקמיה לימפוציטית כרונית מטוהרים (CLL) תאים בתנאי תרבות אחרים . ההפרדה chromatographic של אדנוזין 5'-monophosphate (AMP), אדנוזין (ADO) ו inosine (INO) מתבצע ב RT על מבוסס-סיליקה, עמודה התהפכה פאזי המשמש עבור החזקת מתחם הקוטב. השיטה כוללת שלב ניידים בינארי, אשר מורכב של אמוניום אצטט 7 מ"מ ו אצטוניטריל עם קצב הזרימה של 1.00 מ"ל / דקה. את eluates מנוטרים באמצעות גלאי UV photodiode המערך להגדיר ב 260 ננומטר. עקומת כיול סטנדרטית מופקת לחשב את המשוואה עבור כימות אנליטי של כל מתחם purine. מערכת בקרה, רכישת נתונים וניתוח מבוצעים מכן. החלת פרוטוקול זה, AMP, INO ו ADO elute ב -7, 11 ו -11.9 דקות, בהתאמה, ואת זמן הריצה הכולל עבור כל דגימה היא 20 דקות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים מסוגים שונים שורות תאים (הן השעיה חסידה), באמצעות תקשורת והתרבות כמטריצה. היתרונות הם הכנת מדגם קלה ומהירה לבין הדרישה של כמות קטנה של supernatant לניתוח. יתר על כן, השימוש של מדיום סרום ללא מאפשר לדלג על השלב משקעים חלבון עם אצטוניטריל כי משפיע על הריכוז הסופי של תרכובות purine. אחת המגבלות של השיטה זו היא הדרישה של טור האיזון לרוץ לפני כל ריצת מדגם יחידה, מה שהופך את זמן ריצה הכולל של הניסוי כבר ומניעת יישומי הקרנת תפוקה גבוהה.
מבוא
אדנוזין (ADO) הוא nucleoside purine עם מולקולת אדנין מחוברת מחצית מולקולת סוכר ריבוז באמצעי קשר glycosidic. כאשר נוכח הסביבה התאית, הוא מגן על תאים מפני ניזק מופרז על ידי הפעולה של המערכת החיסונית. תפקיד זה כבר מסומן באמצעות מודלים מחלה שונים, כגון קוליטיס 1, סוכרת 2, אסטמה 3, אלח דם 4, ו איסכמי פציעה 5. אחד התפקידים ADO העיקרית היא עיכוב של התגובה החיסונית במיקרו-סביבה של הגידול, תורם התחמקות החיסונית הגידול 6. מסיבה זו, המנגנונים המעורבים ביצירה ואיתות ADO הם עניין טיפולי ניכר 7.
רמ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות דם CLL מתקבלות בהתאם להנחיות מוסדיות והצהרת הלסינקי.
1. ניתוק של leukemic לימפוציטים מדגימות דם של חולי CLL
- אסוף דגימת דם ב הפרין סודיום (העליון ירוק) צינור 17.
- הפוך 1: 3 דילול של דם מלא עם בופר פוספט 1x RT (PBS).
- לטהר תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) מדגים דם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להעריך את אחוז (%) של תאים leukemic ב PBMCs מטוהרים טרי מחולה CLL נציג, תאים מסומנים עם אנטי CD19 ונוגדנים אנטי CD5. הלוח השמאלי של איור 3 מייצג העלילה נקודה cytofluorimetric עם שער סלקטיבית על תאים חיים. איור 3 מראה דוגמה של PBMC מחולה CLL לפני (פאנל באמצע) ואחרי (פאנל מימין) טיהור תאי B.
דוגמא כימות HPLC של ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להעריך את הפעילות של מכונות CD39 / CD73 adenosinergic במדיה תרבית תאי מתאי leukemic אדם מטוהרים. באמצעות שיטה זו HPLC שנוכל לעקוב וכמותית למדוד את הדור האנזימטית של ADO (CD73-תלוי) והשפלה הבאה שלה כדי INO (CD26 / ADA התלוי). שימוש מעכבי אנזים מאפשר לשלוט בפרוטוקול וכן יש בקרות פנימיות. יתרונות החידושים של פרוטוקול זה הם כי אני) זה יכול להיות מיושם על תאים גדלים בתרבות, כי ii) זה דורש כמות קטנה של תקשורת בתרבות וכי iii) הכנת המדגם היא קלה מאוד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דם | |||
| Milli-Q מים | Millipore | כפול דה-יונים מים | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| מטוהרים אנטי-CD3, -CD14, -CD16 | תוצרת בית | עכבר חד-שבטי | |
| PE מתויג אנטי-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads כבשים נגד עכבר IgG | Invitrogen | 11031 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | Amresco | E404-200TABS | טבליות |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | ID bio | 1000-70 | |
| PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, סרום pH 7.4 | |||
| AIM V נוזל בינוני חופשי | GIBCO | 12055-091 | (דרגת מחקר) |
| אדנוזין 5'-דיפוספט (ADP) | סיגמא-אולדריץ' | A2754 | |
| אדנוזין 5'-מונוספאט (AMP) | סיגמא-אולדריץ' | A1752 | |
| אדנוזין (ADO) | סיגמא-אולדריץ' | A9251 | |
| אינוזין (INO) | סיגמא-אולדריץ' | I4125 | |
| & אלפא;,&בטא;-מתילן-ADP (APCP) | מעכב סיגמא-אולדריץ' | M8386 | CD73 |
| EHNA הידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | E114 | מעכב אדנוזין דאמינאז |
| דאוקסיקופורמיצין (dCF) | טוקריס | 2033 | מעכב אדנוזין דאמינאז |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' | D2650 | |
| דיפירידמול | סיגמא-אולדריץ' | D9766 | מעכב טרנספורטר נוקלאוזיד |
| אצטוניטריל (CHROMASOLV Plus) | סיגמא-אולדריץ' | 34998 | בדרגת HPLC |
| סיגמא-אולדריץ' | 9688 | 7 מ"מ, pH 3.0 | |
| חומצה הידרוכלורית | סיגמא-אולדריץ' | 30721-1 | ליטר מינימום 37% |
| <חזק>שם< | חזק>חברה | <חזק>קטלוג מספר | תגובות |
| Equipment | |||
| Bü מונה תא rker | VWR | 631-0920 | המוציטומטר |
| DynaMag-15 מגנט | Invitrogen | 12301D | מפריד חרוזים מגנטי דינלי |
| מיקרוצנטריפוגה צינורות נעילה בטוחה | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 מ"ל |
| צינורות צנטריפוגה PET | קורנינג | 430053/430304 | 15 – 50 מ"ל |
| מסנני מזרק Minisart RC4 | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | ממברנה 0.2 ומיקרו; בקבוקוני |
| חוט קצר | m VWR | 548-0029 | 1.5 מ"ל / מיקרו |
| מוסיף | VWR | 548-0006 | 0.1 מ"ל / מכסי |
| בורג | VWR | 548-0085 | 9 מ"מ / PP כחול |
| אטלנטיס dC18 עמוד | מים | 186001344 | 5 ומיקרו; m, 4.6 מ"מ x 150 מ"מ |
| Atlantis dC18 עמוד שמירה | מים 186001323 | 5 ומיקרו; m, 4.6 מ"מ x 20 מ"מ | |
| Waters Alliance 2965 מודול הפרדות | מים | HPLC מודול הפרדה | |
| Waters 2998 גלאי מערך פוטודיודות (PDA) גלאי | מים | גלאי UV | |
| Waters Empower2 software | Waters |
מקורות
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
