מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור ננו-חלקיקים מבוססי חלבון המשנה את פני השטח ההידרופוביים להידרופילים. הננו-חלקיק המיוצר הוא מכלול של קופולימרים דיבלוק גליאדין-ציאנואקרילט. ציפוי ריסוס עם הננו-חלקיק המיוצר משנה את פני השטח של חומר המטרה למשטח הידרופילי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול עבור ההפקה של חלקיקי גליאדין-cyanoacrylate לציפוי הידרופיליות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור חלקיקים מבוססי חלבון שמשנה את פני השטח הידרופובי הידרופילי ידי ציפוי ספריי פשוט. חלקיקים אלה מיוצרים על ידי התגובה פילמור של cyanoacrylate אלקיל על פני השטח של מולקולות חלבון דגנים (גליאדין). cyanoacrylate אלקיל הוא מונומר כי polymerizes מיידי ב RT כאשר הוא מוחל על פני השטח של חומרים. התגובה פילמור שלה היא ביוזמת כמויות זעירות של מינים בסיסיים או nucleophilic חלושות על פני השטח, כולל לחות. לאחר polymerized, את cyanoacrylates אלקיל polymerized להראות זיקה חזקה עם חומרי האובייקט בגלל שקבוצות ניטריל נמצאות עמוד השדרה של פולי (cyanoacrylate אלקיל). חלבונים גם לעבוד בתור יוזם פילמור זה משום שהם מכילים קבוצות אמינות שיכול ליזום פילמור של cyanoacrylate. אם חלבון מצטברים משמש כיזמית, במצטבר חלבון מוקף הידרופוביפולי (cyanoacrylate אלקיל) שרשראות לאחר התגובה פילמור של cyanoacrylate אלקיל. על ידי שליטה על תנאי הניסוי, חלקיקים בטווח ננומטר מיוצרים. החלקיקים היוצר בקלות לספוג אל פני השטח של רוב החומרים כוללים זכוכית, מתכת, פלסטיק, עץ, עור, בדים. כאשר פני השטח של חומר הוא רסס עם השעית nanoparticle פיק שטפו עם מים, מבנה micellar של ננו-חלקיקים משנת קונפורמציה שלה, ואת החלבונים הידרופילי נחשפים לאוויר. כתוצאה מכך, השטח מצופה ננו-החלקיקים משתנה הידרופילי.
מבוא
מטרת מאמר זה היא להראות את הפרוטוקול להכנת תרחיף ננו-חלקיקים המשנה את תכונת ההרטבה של חומרים על ידי ריסוס פשוט. תרחיף הננו-חלקיקים המוצג עשוי מאלקיל ציאנואקרילט1 וחלבון דגנים, גליאדין2,3. בתהליך הייצור נוצרים אגרגטים חלבונים באתנול מימי4. תגובה עוקבת עם מונומר (אלקיל ציאנואקרילט) מייצרת את הננו-חלקיק המורכב מליבת חלבון המוקפת בשרשראות פולימר ליניאריות [פולי (אלקיל ציאנואקרילט)]5.
Poly(alkyl cyanoacrylate)s מתכלים ושימשו לייצור ננו-חלקיקים באמצעות פילמור תחליב6. תגובה זו יוזמת באופן ספונטני על ידי קבוצות ההידרוקסיל המופרדות ממים או על ידי קבוצות נוקלאופיליות אחרות בתווך התגובה7. במקרה של התגובה המוצגת במאמר זה, קבוצות האמין על פני אגרגטים של חלבון יוזמות את תגובת הפילמור של מונומרים אלקיל ציאנואקרילט5,8. כתוצאה מתגובה זו נוצרים ננו-חלקיקים במדיום התגובה. הליבה של הננו-חלקיק היא אגרגטים של חלבונים והשכבה החיצונית היא שרשראות פולי (אלקיל ציאנואקרילט) (PACA). לננו-חלקיק המוכן יש זיקה חזקה לרוב החומרים (ליתר דיוק, כל חומר ש-PACA יכול לספוג אליו) והוא נצמד על פני השטח שלהם ליצירת ציפוי דק בקנה מידה ננומטרי. ציפוי ריסוס פשוט הופך באופן מיידי את פני החומרים להידרופילים.
גליאדין הוא אחד השברים העיקריים של גלוטן, שנמצא באנדוספרמים של החיטה. גליאדינים הם בעיקר חלבונים מונומריים עם משקל מולקולרי בסביבות 28,000 - 55,000. קשרים לא קוולנטיים כגון קשרי מימן, קשרים יוניים וקשרים הידרופוביים אחראים לצבירת גליאדינים2. אף על פי שגליאדין נבחר כמגיב במאמר זה, חלבונים רבים אחרים יכולים לשמש גם לאותה מטרה. עם זאת, יש לשנות את מצב התגובה בהתאם מכיוון שהתנאי לגרימת צבירה תלוי בסוג החלבון שיש להשתמש בו8. בהשוואה לחלבונים אחרים, גליאדין זמין יותר, הטיהור פשוט ועלות הייצור נמוכה. למרות שאתיל ציאנואקרילט (ECA) נבחר כמונומר לתגובה המוצגת, ניתן להשתמש גם באלקיל ציאנואקרילטים אחרים לאותה תגובה. הסיבה לבחירת ECA היא שהיא זמינה בעלות נמוכה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. Defatting המסחרי גליאדין
- מדוד 150 מ"ל של אצטון עם גליל סיימה ויוצקים לתוך 250 מ"ל בבקבוק Erlenmeyer.
- תוך ערבוב עם בר ספין על בוחש מגנטי ב RT, להוסיף 30 גרם של גליאדין אבקה מסחרית. חותם את פתיחת הבקבוק עם רדיד אלומיניום, ולשמור על בחישת O / N בשכונה.
- תסנין הפתרון עם נייר סינון.
- שטפו את תסנין עם אצטון טרי (בערך 50 מ"ל). תן להחזיק מעמד 10 דקות, כדי לאפשר אצטון לניקוז.
- מעביר את התסנין יחד עם נייר הסינון מתחת לצלחת גדולה כמו צלחת מרובע תרבית תאים. מכסה את הצלחת המלאה עם נייר סינון גדול כדי להאט את האידוי של אצטון שיורית.
- אפשר תסנין להתייבש לחלוטין N / ברדס O. אחסן את גליאדין נטול שומן באריזה נגד אוויר חזק ב RT.
2. הכנת המטוהרים גליאדין
- מדוד 150 מ"ל של ווהter עם גליל סיימה ויוצקים לתוך 1,000 מ"ל בבקבוק Erlenmeyer.
- מדוד 350 מ"ל של אתנול אבסולוטי עם גליל בלגן ויוצקים לתוך אותו בקבוק Erlenmeyer 1,000 מ"ל. מערבבים נמרצות (800 - 1,000 סל"ד) עם בר ספין עד אין בועה נוצרת מתערובת פתרון.
- תוך ערבוב, מוסיפים 20 גרם של אבקת גליאדין נטול שומן-מסחרי. להוסיף גליאדין בכמויות קטנות בכל פעם, כדי למנוע היווצרות של גושים המכיל אוויר באמצע. שמור על ערבוב O / N.
- מעבירים את הפתרון כולו גליל בלגן 1,000 מ"ל. בואו לעמוד במשך יומיים. במהלך תקופה זו, זיהומים שישקעו בתחתית הצילינדר.
- מעביר את supernatant מאייד סיבובי עם טפטפת, ולהסיר אתנול מן supernatant ככל האפשר. ככל ששיעור אתנול מצטמצם, גליאדין יופיע הפתרון כמו צבירה.
- להקפיא את אגרגטים גליאדין המכיל פתרון ידי טבילה / מסתובבת מתנול/ תערובת קרח יבש ולהקפיא יבשים ב -70 ° C תחת ואקום. לפני ייבוש בהקפאה, לוודא הפתרון כולו קפוא ללא כל נוזל.
הערה: גליאדין מיובש בהקפאה יהווה מוצק נקבובי. - קראש גליאדין מיובש בהקפאה עם ובמכתש, וטוחנים עם מטחנת קפה להשיג כוח קנס (<0.5 מ"מ). מעבירים את המוצר לתוך מיכל אטום לאוויר ולאחסן ב RT.
3. תגובה פילמור של ECA עם גליאדין
- מניחים בקבוקון הנצנץ (נפח הוא סביב 20 מ"ל) ב במאזניים, וטרה. מוסיפים מים 3.2 גרם מזוקקים ו -6.8 גרם אתנול אבסולוטי בבקבוקון scitillation.
- הזז את בקבוקון הנצנץ על stirrer מגנטי, לשים בר ספין מגנטי (20 x 3 מ"מ) לתוך הבקבוקון, ומערבבים נמרצות (800 - סל"ד 1,000) עד אין בועת אוויר מופק מתערובת אתנול מימית.
- הוסף 40 μl של 4 N HCl לתוך בקבוקון תוך ערבוב. הוסף 20 מ"ג של גליאדין לתוך הבקבוקון בעוד Sti ט-ררינג, ולשמור על בחישה עד אבקת גליאדין נמס לגמרי בתערובת אתנול מימית.
- לאחר שווידא הפתרון גליאדין ברור בעיני עירום, להוסיף לאט 80 - 100 μl של ECA בעוד מהירות ערבוב עדיין 800 - סל"ד 1,000.
- מנמיכים את מהירות ערבוב עד 500 סל"ד, וממשיכים לבחוש עבור שעה 1. ככל שמתקדם התגובה, להתבונן עכירות אשר מציינת כי התגובה פילמור מתבצעת.
- כאשר התגובה מסתיימת, להעביר את הפתרון לתוך צינורות צנטריפוגות, ולאזן את המשקל של החצוצרות. צנטריפוגה מוצר התגובה ב XG 10,000 במשך 20 דקות. במהלך תקופה זו, משקעת חלקיקי מוצר לוואי להישאר supernantant. המרכיב העיקרי של המוצר בצד הוא homopolymer PACA.
- לאחר צנטריפוגה, להעביר את ההשעיה nanoparticle מיוצר (supernatant) עם טפטפת כדי בקבוקון הנצנץ (או כל מיכל אוויר חזק), ולאחסן אותו ב RT.
- כן 10 גרם של 68% WT אתנול המימי על ידי ערבוב מי 3.2 גרמו ו אתנול אבסולוטי 6.8 גרם ב בקבוקון נצנץ 20 מ"ל ומערבב עד אין בועה נוצרת מתערובת הפתרון.
- הוסף 40 μl של 4 N HCl לתערובת פתרון תוך ערבוב. הוסף 50 μl של ההשעיה nanoparticle לפתרון אתנול מוכן תוך ערבוב.
- מדוד את גודל ננו-חלקיקים עם פיזור אור דינאמי (DLS) באמצעות פתרון מדגם מוכן לעיל ופעל על פי ההנחיות של היצרן.
הערה: הגודל של המוצר הסופי צריך להיות קטן מ -200 ננומטר. אם הוא גדול מ -200 ננומטר, המוצר לא יהיה יציב במשך תקופה ארוכה של זמן. חלקיקים גדולים יותר מיוצרים כאשר ECA המועסקת אינה טריה.
בחינת 5. מהתוצר
- הכינו צלחת זכוכית כגון ראי יד. שטפו את פני השטח של צלחת זכוכית עם מים וסבון. Rinse פני השטח של צלחת זכוכית עם מים זורמים. הקפד לייבש את המשטח לנקות או להשתמש ללא ייבוש עבור לשלב הבא.
- תרסיס ההשעיה nanoparticle שהושגו 3.6) על חלק צלחת זכוכית, ולשטוף את המשטח עם מים זורמים מיד.
- תרסיס מים טהורים על פני השטח של צלחת זכוכית. שים לב המצופה (רסס עם השעית nanoparticle) שכבת מים בהמתנת שטח בעוד משטח הציפוי ברור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חלקיקים יכולים להיות ערוכים תנאי תגובה שונים. צורות גליאדין המצרפי מגוון רחב של אתנול תוכן 5. עם זאת, הגודל של אגרגטים צריך להיות קטן ככל האפשר, כי שכבה נוספת (כלומר., Polymerized ECA) תתווסף מצרף זה ותהליך זה יהפוך את הגודל הסופי גדול. אם הגודל של החלקיקים הסופי הוא גדול מדי, החלקיק יהיה בלתי יציב שישקע בקלות. לכן, 68% אתנול מימי נבחר כמדיום תגובה 4. גודלו של הננו-חלקיק המיוצר היא בסדר גודל של כמה מאות ננומטרים. המנג...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם מספר שלבים קריטיים בייצור תרחיף הננו-חלקיקים. אם הגליאדין המטוהר מכיל זיהומים, התגובה עם ECA תייצר תוצרי לוואי. למרות שניתן להסיר את המוצרים הלא רצויים הללו ממדיום התגובה בשלב הצנטריפוגה, זה מוריד את התפוקה של המוצר העיקרי. אם תמיסת הגליאדין שהוכנה במהלך שלב הניסוי 2.3) אינה מראה הפרדה ברורה בין סופרנטנט למשקעים לאחר יומיים, התמיסה צריכה לעמוד זמן רב יותר. השימוש ב-ECA טרי הוא חשוב ביותר מכיוון שחיי המדף של ECA מוגבלים.
ה-ECA הפולימרי חלקית ב-ECA הישן מייצר ננו-חלקיקים בגודל גדול יותר שא...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה נועד אך ורק למטרת מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקאי. USDA הוא ספק ומעסיק שוויון הזדמנויות.
תודות
תודה למר ג'ייסון אדקינס לקבלת סיוע טכני מומחה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מונומר אתיל ציאנואקרילט (ECA) | K& R International (לגונה ניגואל, קליפורניה) | I-1605 | ניתן להשתמש בכל ECA טהור. |
| Gliadin | MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS) | ניתן לרכוש מתנה מחברת | Gliadin מ-Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). במקום גליאדין, כל פרסומת ניתן להשתמש בגלוטן. |
| HCl | ניתן | כימיקל בדרגת ריאגנט. | |
| אצטון | כל | להשתמש בכל כימיקל בדרגת ריאגנט. | |
| מתנול | ניתן | כימיקל בדרגת ריאגנט. | |
| אתנול (100%) | ניתן להשתמש בכל | כימיקל בדרגת ריאגנט. | |
| ניתן | בכל | נייר סינון בכל דרגה גדולה מ-10 ס"מ. | |
| מרובעת של תרבית תאים | בכל | מנה הגדולה מ- 20X20 ס"מ. | |
| מטחנת קפה | כל | להשתמש בכל מטחנת קפה. | |
| מאייד סיבובי | כל ניתן | להשתמש בכל מאייד סיבובי. | |
| מייבש הקפאה | כל | מייבש הקפאה שיכול להגיע ל-70 מעלות; ניתן להשתמש ב-C. | |
| בכל | צנטריפוגה שיכולה להחיל 1,000 x גרם. | ||
| מערבל מגנטי | ניתן להשתמש בכל מערבל מגנטי שיכול להפוך את מוט הסיבוב ל-1,000 סל"ד. | ||
| ניתן להשתמש בפיזור אור דינמי (DLS) | ב-Brookhaven Instruments Corporation | NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer | DLS מכל חברה. |
| מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) | קארל זייס בע"מ | ניתן להשתמש בכל SEM. | |
| זווית מגע דינמית (DCA) | תרמו קאהן | ניתן להשתמש בכל DCA. |
מקורות
- Vauthier, C., Dubernet, C., Fattal, E., Pinto-Alphandary, H., Couvreur, P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. Adv. Drug Deliver. Rev. 55, 519-548 (2003).
- Wieser, H. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiol. 24, 115-119 (2007).
- Bietz, J. A., Wall, J. S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure. Cereal Chem. 57, 415-421 (1980).
- Kim, S. Production of composites by using gliadin as a bonding material. J. Cereal Sci. 54, 168-172 (2011).
- Kim, S., Kim, Y. Production of gliadin-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles for hydrophilic coating. J. Nanopart. Res. 16, 1-10 (2014).
- Behan, N., Birkinshaw, C., Clarke, N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation. Biomaterials. 22, 1335-1344 (2001).
- Nicolas, J., Couvreur, P. Synthesis of poly(alkyl cyanoacrylate)-based colloidal nanomedicines. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 111-127 (2009).
- Kim, S., Evans, K., Biswas, A. Production of BSA-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles as a coating material that improves wetting property. Colloid Surface. B. 107, 68-75 (2013).
- Lander, L. M., Siewierski, L. M., Brittain, W. J., Vogler, E. A. A systematic comparison of contact angle methods. Langmuir. 9, 2237-2239 (1993).
- Davies, J., Nunnerley, C. S., Brisley, A. C., Edwards, J. C., Finlayson, S. D. Use of Dynamic Contact Angle Profile Analysis in Studying the Kinetics of Protein Removal from Steel Glass, Polytetrafluoroethylene, Polypropylene, Ethylenepropylene Rubber, and Silicone Surfaces. J. Colloid Interf. Sci. 182, 437-443 (1996).
- Giolando, D. M. Nano-crystals of titanium dioxide in aluminum oxide: A transparent self-cleaning coating applicable to solar energy. Sol. Energy. 97, 195-199 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
